藥物分析第十六章藥品質量控制中的現代分析方法與技術

藥物分析第十六章藥品質量控制中的現代分析方法與技術Capillaryelectrophoresis,CE第一節(jié)、藥物現代色譜法及其應用Modernchromatography&itsapplicationinpharmaceuticalanalysis⊙Nearinfraredspectrometry,NIRS⊙Nuclearmagneticresonancespectrometry,NMRS⊙X-raydiffractionmethod第二節(jié)、現代光譜法及其應用Modernspectrometry&itsapplicationinpharmaceuticalanalysisHTC

(HyphenatedTechniquesinChromatography)MS(MassSpectrometry)GC-FTIRHPLC-FTIRGC-MSHPLC-MSHPLC-NMRFTIR(FourierTransformInfrared)⊙毛細管電泳分析法毛細管電泳(capillaryelectrophoresis,CE)就是80年代初發(fā)展起來得一種高效、快速得分離分析技術。在藥物分析中有著重要得應用與發(fā)展前景自20世紀90年代初Menz等提出“微型全化學分析系統(tǒng)”(miniaturizedtotalchemicalanalysissystem,

-TAS)概念以來,分析技術得微型化、集成化和自動化一直就是分析科學發(fā)展得主導趨勢,其中芯片毛細管電泳技術得研究已取得突出進展,在生物、臨床、醫(yī)藥、工業(yè)和環(huán)境等領域中得到廣泛應用。與傳統(tǒng)毛細管電泳技術相比,芯片毛細管電泳具有樣品用量更少,分離速度更快得特點,但對檢測得靈敏度和響應速度提出了更高要求1、高效2、高速3、微量4、低消耗HPCE就是經典電泳技術和現代微柱分離相結合得產物。與HPLC相比,均為液相分離技術,都有多種分離模式,且儀器操作可自動化;但遵循不同得分離機理。在很大程度上,HPCE和HPLC互為補充。HPCE更具有如下優(yōu)點:但HPCE得檢出靈敏度和精密度不及HPLC毛細管電泳裝置示意圖1、高壓電源2、光電倍增管3、液冷溫控毛細管4、光源5、數據采集6、緩沖液/樣品7、緩沖液陽陰+-30kV7123456a、毛細管中電滲流呈“塞式流”流型b、HPLC柱中壓力驅動呈拋物線流型-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+EOP---++++-ElectroosmoticFlow,EOFElectrophoresicFlow,EPF毛細管電泳裝置示意圖1、高壓電源2、光電倍增管3、液冷溫控毛細管4、光源5、數據采集6、緩沖液/樣品7、緩沖液陽陰+-30kV7123456應用示例電泳條件石英毛細管(未涂層)57cm×50μm,優(yōu)化選擇25mmol/L磷酸二氫鈉-12、5mmol/L硼砂-25mmol/LSDS(pH7、8)為電泳介質,操作電壓20kV,柱溫23℃,測定波長205nm本文建立得優(yōu)選方法可在11min內測定利巴韋林及中間體含量,與HPLC測定需1h相比,更快速。本方法也可用于利巴韋林制劑中中間體得控制＊利巴韋林及各中間體得定量分析＊復方甘草片中甘草酸、甘草次酸、嗎啡和

苯甲酸鈉得分析[21]

復方甘草片為常用鎮(zhèn)咳祛痰藥,臨床上有廣泛得應用。每片含甘草浸膏(中粉)112、5mg、阿片粉4、0mg、樟腦2、0mg、八角茴香油2、0mg、苯甲酸鈉(中粉)2、0mg電泳條件石英毛細管65cm×75μmi、d、,有效長度50cm,運行緩沖液為50mmol/L硼砂溶液;運行電壓14、0kV,電流70μA;測定波長228nm;重力進樣10s(高度7cm)定量分析經分析方法驗證,本法具有良好得線性關系,回收率大于97、0%。該法可作為快速、準確測定復方甘草片中多組分含量得有效方法

12大家應該也有點累了，稍作休息大家有疑問的，可以詢問和交流藥物現代光譜法及其應用

⊙近紅外分光光度法優(yōu)點:無邊緣干擾,線性范圍(A~C)寬水份吸收不覆蓋C-H、N-H、O-H吸收帶適用于水溶液樣品,含水固體和泥漿狀樣不經溶劑稀釋,不必制備KBr片,可直接測定,定量效果優(yōu)于GC、HPLC和FTIR12500cm-14000cm-1400cm-1NIRMIR(nearinfra-redspectrum)(midinfra-red)倍頻overtones合頻combinations｛C-H,N-H,O-H伸縮振動譜帶峰強度<1/100~1/10基頻峰強度方法特點

可獲得一系列物理性質得信息由NIRS可得到如密度、粒子尺寸、纖維直徑、大分子聚合度等特殊信息樣品無需預處理NIRS法僅需將樣品裝入樣品池內而不必作預處理。一般,液體樣品可以直接裝入光路長1～30mm得石英池中。固體樣品可直接放入具有石英窗得反射樣品杯中;蓋上彈簧壓縮蓋,即可。在1min內即可完成裝樣;取出樣品、清洗杯子得時間也不需1minNIR反射譜又與MIR不同,她有以下特點:分析速度快通常,將樣品杯置入NIR

光譜儀內,每秒進行5次掃描;一般掃

描50次求得平均值制得最后得光譜,繼

之將光譜數據進行加工以作數據得定量

或定性得解釋。通常,作一次NIRS分

析僅需2~3min靈敏度高NIRS光源強度較大,檢測器得反應靈敏度較高,因而檢測信噪比高,尤其在散射效應強時,散射-吸收比高運用范圍廣在反射和散射NIR中,高

得信噪比可以得到良好得線性關系,

對分析樣品得外觀寬容度大,既可以

用于清澈得氣、液、固樣品得測定,

又可用于粉末狀、糊狀、絲狀和不規(guī)

則狀樣品得分析便于在線分析和控制NIR區(qū)內還有價格便宜耐用得透明材料(一般得光學玻璃)作為分析窗口,便于實現快速、實時,并有池長對分析結果影響小,定量分析得范圍寬等優(yōu)點應用示例諾氟沙星膠囊得NIRS分析UV、HPLC測定含量,均需對樣品進行預處理,較繁瑣費時。采用近紅外漫反射光譜(near-infareddiffusereflectancespectrometry,NIRDRS)技術及偏最小二乘法(PLS)對諾氟沙星膠囊進行含量測定得回收率好,與其她方法相比,還具有分析簡便、快速得優(yōu)點⊙核磁共振光譜分析法核磁共振光譜(nuclearmagneticresonancespectrometry,NMRS)技術已在BP和USP中應用,在新藥得研制中,如藥物結構確證,藥物代謝物得研究和藥物得篩選和設計等方面,更就是重要得分析方法之一。重點討論定量分析方法及應用示例簡述NMR(nuclearmagneticresonance)肌肉松弛劑定性、定量和雜質檢查不同藥物具有不同NMR圖譜樣品中每個組分有一個或一組特征得、且互不重疊得吸收峰Maolate異構體ⅠMaolate異構體Ⅱ312312內標法(絕對測量法)

NMR最常用得定量分析方法內標物得要求:最好能產生單一得共振峰,與樣品間隔≥30Hz能溶于分析溶劑中有盡可能小得質子當量不應與樣品中任何組分相互作用亞硝酸戊酯(Amylnitrite)及其

吸入劑(Amylnitriteinhalant)得NMR定量分析USP分子中與亞硝基相鄰得次甲基上得質子呈現多重峰δ4、8ppm內標:苯甲酸芐酯C6H5COOCH2C6H5呈現單一峰δ=5、3ppm以TMS為對照δ=0、ppm3-甲基-1-丁醇亞硝酸酯2-甲基-1-丁醇亞硝酸酯應用示例

＊鹽酸普魯卡因得結構鑒定＊植物中藥及其偽品得區(qū)別偽品中藥在外觀特征上幾可以假亂真,但其化學成分得組成,尤其就是活性成分卻不可能與正品完全一致,并且相差甚遠。以正品植物中藥得1H-NMR相對標準圖譜為參照,只需比較所鑒別樣品得1H-NMR譜就可以斷定中藥得真?zhèn)?。以人參為例說明之試驗測定了偽品人參,其1H-NMR指紋圖均與正品得特征峰毫無相似之處＊亞硝酸戊酯(amylnitrite)及其吸入劑(amylnitriteinhalant)得含量測定(USP24)⊙

X射線粉末衍射法X射線就是倫琴在1895年發(fā)現得,又曾稱為倫琴射線。本質上就是波長很短得電磁波,一般認為波長為0、01～1nm,較紫外線還短。作為波,就可以產生衍射。所謂衍射,就就是繞過障礙物邊緣向前傳播得現象當X射線射到晶格排列整齊得晶體上,僅僅在某些方向有光線反射,這就就是X射線得衍射。有光線反射得方向可用布拉格方程加以描述

X射線衍射法得理論依據式中θ為掠射角;dhkl為晶面間距;hkl為晶面指數,即晶面與晶軸截距得倒數之比,也叫密勒指數

······························AOCBdθ布拉格方程布拉格方程

布拉格方程給出了什么條件下衍射得X射線可能從晶體射出［已知晶面間距(d)和入射線波長(λ),即可求出衍射線方向(θ)］,也可給出進行X射線衍射得晶體得晶面間距［已知入射線波長(λ)和衍射線方向(θ),即可求出晶面間距(d)］。當然晶面有若干組,都可產生相應衍射,這些衍射均可由X射線衍射儀進行測定

X射線衍射儀得工作原理

⊕X射線管中不同靶材料,如銅、石墨等可發(fā)出各自特征波長⊕晶體粉末盡可能緊密地裝入玻璃毛細管,壓成多晶圓柱體。當穿過鉛塊狹縫得一細束X射線射到晶體粉末時,總會有取向合適得微小晶體,使射線在其表面反射最強2θ·C2θ2θX射線衍射儀得工作原理一般采用粉末法。粉末衍射儀得構成與工作原理見下圖由反射方向,根據布拉格方程即可求出晶

面間距,進而求出鍵長。本法可同時將各

種波長得X射線反射到不同方向,記錄為

衍射圖譜在新藥研制過程中,必需對藥物結構進行確證,固體樣品一般要做X射線粉末衍射分析,以便從測定結果可比較研制品與對照品就是否一致。X射線粉末衍射法就是藥物晶型進行定性鑒別得重要方法之一應用

＊應用示例西咪替丁得晶型研究

尹華等藥物分析雜志2001,21(1):39~42測試條件:Cukα(靶),50kV-80mA(工作電壓-電流),8(o)/min,DS=SS=1℃,RS=0、15mm(狹縫),2θA晶型和B晶型得X射線測定數據見表

X射線衍射法除了用于晶型鑒別外,也可用于晶型藥物得定量分析

A晶型和B晶型得X射線測定數據A晶型B晶型衍射角晶面距豐度比衍射角晶面距豐度比9.380.942169.560.92403512.920.68473513.080.67636114.660.60381813.920.63572516.440.53882318.480.47976216.740.52923418.980.467241

26.000.34247526.100.34117526.340.3381526.380.337610027.240.32712728.440.31362828.440.3136372θ／(o)d／nmI／I02θ／(o)d／nmI／I0＊X射線晶體結構分析若以已知波長得X射線入射,也會對不同得平面族獲得最強得反射,據此可以測定晶格常量,進而確定晶格構造。這就就是

X射線晶體結構分析重要意義確定藥物結構及生物大分子結構原理如此,具體做起來還就是一件十分復雜得工作,特別就是對新化合物結構得確定,常要借助于電子計算機,例如四圓衍射儀,可以直接測量化合物得鍵長鍵角等數據色譜聯(lián)用技術及其應用

GC-FTIR系統(tǒng)組成著重圍繞幾種應用較廣泛得色譜聯(lián)用技術及其在藥物分析中得應用予以簡述⊙氣相色譜-紅外光譜聯(lián)用技術GC/FI-IR聯(lián)用光路示意圖拋物面鏡干涉儀光源接口橢面鏡光管FID或放空GC柱出口GCFT-IRIR拋物面鏡麝香風濕油GC分析圖譜1、α-蒎烯2、β-蒎烯3、桉樹腦4、樟腦5、水楊酸甲酯6、桂皮醛7、茴香酸甲酯8、丁香酚9、2-甲基十一烯10、鄰苯二甲酸二丁酯11、正十六烷11t(min)12345678910⊙氣相色譜-質譜聯(lián)用技術GC-MS儀得接口組件就是解決氣相色譜和質譜聯(lián)用得關鍵組件,她起傳輸試樣,匹配兩者工作流量(也就就是工作氣壓)得作用。理想得接口應能去除全部載氣而使試樣毫無損失地從氣相色譜儀傳輸給質譜儀。要求試樣傳輸產率高,濃縮系數大,延時短,色譜得峰展寬少GC-MS工作原理示意圖載氣樣品進樣器色譜柱分子分離器抽真空記錄儀放大器離子源分析器電子倍增管放大器示波器質譜應用示例在藥物中毒急救、預防和刑事偵破工作中常需要在生物體液中進行未知毒物得鑒定。由于未知毒物得范圍非常廣泛,理化性質各異,因此,有必要建立一系統(tǒng)化得盡可能多得毒物藥物得分析方法＊固相萃取結合GC-MS系統(tǒng)分離生物體液中常見毒物藥物＊GC-MS測定冰片和川芎嗪血藥濃度GC-MSD得選擇性離子檢測色譜圖A、標準樣品B、血漿樣品1、川芎嗪2、樟腦3、4、龍腦A1432243tR(min)B243243tR(min)質譜圖120406080100136(M+)4254100608014012010841698195152(M+)1006080140120955567154(M+)121110⊙液相色譜-質譜聯(lián)用技術粒子束(particalbeam)接口不適用于極性得、熱不穩(wěn)定得和分子量大于1000得樣品分子熱噴霧(TSP)接口TSP接口得應用正逐步減少以下重點闡述LC-MS得關鍵部件、接口裝置和應用接口裝置USP(24)中列出了如下幾種接口裝置大氣壓離子化(API)接口就是目前商品

化LC-MS儀采用最廣得接口動態(tài)快原子轟擊法(FAB)FAB法適合于高活性、低蒸汽壓、熱穩(wěn)定性低及分子量大得樣品分析,而且樣品用量少。該接口得缺點就是限制HPLC得流速,通常為10

l/min,只能使用微型柱應用示例

曲安奈德中特殊雜質得檢查曲安縮松(TACA)TriamcinoloneAcetonide雜質峰3、85′350600550500450曲安縮松及其雜質得質譜TACA:曲安縮松;desmethyleneTACA:去甲曲安縮松40050100150200250300100、0100、050、050、029359758593115135147159173187199213225237269253281590569549535519507493475463455443435421+339347359415387377367293888293888TACAMH+-HFTACA(M+C2H5)+(M+C2H5)+DesmethyleneTACAMH+421+去甲曲