ctDNA檢測的臨床應(yīng)用研究進(jìn)展

分子診斷的臨床應(yīng)用

---ctDNA檢測的臨床應(yīng)用研究進(jìn)展1.病原學(xué)的檢測實時熒光PCR技術(shù)（1）病毒：HBVHCVHPVEBCMV（2）生殖道感染病原學(xué)

NG淋球菌CT沙眼衣原體UU解脲脲原體（3）呼吸道病毒（4）結(jié)核分枝桿菌（5）細(xì)菌2.遺傳性疾病新一代測序技術(shù)（1）BRCA1/2基因檢測（2）錯配修復(fù)基因

3.循環(huán)血游離DNA分析（1）NIPT產(chǎn)前三體的診斷新一代測序技術(shù)數(shù)字PCR（2）循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA)ARMSPCP突變digitalPCR突變、拷貝數(shù)變化NGS

捕獲建庫擴增子建庫檢驗科應(yīng)用的分子診斷技術(shù)：基于PCR的檢測技術(shù)雜交技術(shù)檢驗科開展的分子檢測項目CACANCERJCLIN2018;68:7–30CACANCERJCLIN2018;68:7–30北京癌癥發(fā)病率呈上升趨勢惡性腫瘤自2007年開始連續(xù)4年位居北京市居民死因首位。以2009年為例，北京市戶籍人口共報告惡性腫瘤新發(fā)病例36765例，發(fā)病率為297.04/10萬。其中，男性新發(fā)病例18902例，發(fā)病率為303.08/10萬，女性新發(fā)病例17863例，發(fā)病率為290.91/10萬。惡性腫瘤新發(fā)病例男女比例為106∶100。近十年來，肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌一直位于北京市居民惡性腫瘤發(fā)病前三位。男性肺癌發(fā)病一直高居榜首，在2008年發(fā)病率第一次突破70/10萬大關(guān)，遙遙領(lǐng)先于其他器官的惡性腫瘤。乳腺癌一直是北京市女性第一位高發(fā)的惡性腫瘤，且發(fā)病率上升之迅速也引起了社會各界的廣泛關(guān)注。此外，女性肺癌、結(jié)直腸癌也在近十年中有較為明顯的上升趨勢晚期腫瘤（1）診斷、鑒別診斷（2）分型、分期（3）治療效果評價（4）靶向藥物使用指導(dǎo)（5）預(yù)后預(yù)測早期腫瘤（1）篩查（2）診斷（3）手術(shù)治療后微小殘留評估（4）手術(shù)后的治療決策（5）復(fù)發(fā)、生存預(yù)測傳統(tǒng)的標(biāo)志物

CEA

細(xì)胞角蛋白

SCCCa125Ca153Ca242Ca199AFP

激素類新型腫瘤標(biāo)志物ctDNACTC靶向治療：是在細(xì)胞分子水平上，針對已經(jīng)明確的致癌位點（該位點可以是腫瘤細(xì)胞內(nèi)部的一個蛋白分子，也可以是一個基因片段），來設(shè)計相應(yīng)的治療藥物，藥物進(jìn)入體內(nèi)會特異地選擇致癌位點來相結(jié)合發(fā)生作用，使腫瘤細(xì)胞特異性死亡，而不會波及腫瘤周圍的正常組織細(xì)胞。cfDNA：cell-freeDNA，血漿游離DNA。腫瘤細(xì)胞壞死、凋亡以及正常細(xì)胞，炎性細(xì)胞凋亡后釋放入血的DNA。ctDNA：circulatingtumorDNA，循環(huán)腫瘤DNA。腫瘤細(xì)胞壞死、凋亡后釋放入血的DNA，其攜帶的基因組信息與腫瘤的基因組信息相似。微小殘留（MMR）ClinCancerRes.2009July15；15(14)

：4554-4560Science.2014October10;346(6206):256–259ElzaC.deBruin,etal.Science;346;251腫瘤異質(zhì)性腫瘤的監(jiān)測很多腫瘤患者無法進(jìn)行手術(shù)穿刺受檢者嚴(yán)重的不合適穿刺自身的臨床風(fēng)險某些腫瘤解剖位置不便進(jìn)行穿刺Crowly,E,etal.Nat.Rev.Clin.Oncol.2013,10:472-48411cfDNA的來源：-腫瘤壞死/凋亡-細(xì)胞被動裂解-正常細(xì)胞凋亡-炎性細(xì)胞克服腫瘤異質(zhì)性實時動態(tài)監(jiān)測——L858R----T790M

ctDNADiagnosisStartthetherapyScreeningSelecttherapy/PredicttheeffectMinimalResidualDisease(MRD)detectCollectBloodTherapyevaluate12雜志：

Journalofclinicaloncology影響因子：24.008分發(fā)表時間：2018年3月單位：美國臨床腫瘤學(xué)會(ASCO)和美國病理學(xué)家協(xié)會(CAP)作者：

JasonD.Merker等ASCO&CAP聯(lián)合評估腫瘤患者ctDNA檢測的臨床有效性和實用性CirculatingTumorDNAAnalysisinPatientsWithCancer:AmericanSocietyofClinicalOncologyandCollegeofAmericanPathologistsJointReview一、研究背景1、液態(tài)活檢已經(jīng)成為病理學(xué)家和腫瘤學(xué)家關(guān)注的新技術(shù)，ctDNA檢測憑借其無創(chuàng)、快速、勻質(zhì)等特點，被認(rèn)為是能夠克服組織標(biāo)本局限性的理想選擇，被廣泛應(yīng)用于腫瘤患者基因組變異檢測，以達(dá)到疾病診斷和預(yù)后監(jiān)測的目的。2、專家們從2007年至2017年發(fā)表的實體瘤ctDNA序列和拷貝數(shù)變異相關(guān)的1338篇文獻(xiàn)中分析390篇，最后從中選擇了77篇進(jìn)行匯總分析認(rèn)為：除肺癌患者循環(huán)血EGFR突變及結(jié)直腸癌KRAS突變檢測外，尚沒有足夠證據(jù)顯示ctDNA在其他變異類型或其他癌種中具有臨床有效性。ctDNA臨床應(yīng)用缺乏證據(jù)

分析性能癌癥篩查術(shù)后殘留病變監(jiān)測治療效果

一、研究結(jié)果-

ctDNA檢測的可靠性和準(zhǔn)確性3、組織仍是臨床上腫瘤基因檢測的首選，但組織標(biāo)本取材困難、處理復(fù)雜以及標(biāo)本異質(zhì)性等都對臨床檢測產(chǎn)生了一定的局限性，液體活檢尤其是ctDNA檢測的確是突破這些限制的理想之選。4、ctDNA不同的突變檢測尚未確定最佳檢測下限，不同方法檢測結(jié)果存在不一致。5、未來關(guān)注：

使用合規(guī)的、具有明確臨床有效性證據(jù)的ctDNA檢測方法。目前全球范圍內(nèi)批準(zhǔn)的血液伴隨診斷試劑有且只有2個：美國FDA批準(zhǔn)羅氏Cobas試劑盒(用于肺癌EGFR突變和結(jié)直腸癌KRAS突變檢測)；中國CFDA于2018年批準(zhǔn)的艾德生物Super-ARMS試劑盒(用于肺癌EGFR血液檢測)。定量檢測時注意檢測下限附近的突變；設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)品；用不同方法進(jìn)行交叉檢測比較；驗證機制。1、ctDNA釋放少2、檢測靈敏度低靶向治療預(yù)期效果好1、時間異質(zhì)性2、空間異質(zhì)性3、檢測錯誤靶向治療預(yù)期效果不好6、組織陽、ctDNA陰與組織陰、ctDNA陽分析二、研究結(jié)果-ctDNA檢測結(jié)果分析與報告與報告ctDNA檢測的陽性結(jié)果可以有效指導(dǎo)治療ctDNA檢測結(jié)果為陰性的患者還需要盡可能通過組織檢測進(jìn)行驗證7.ctDNA應(yīng)用原則三、研究結(jié)果-

ctDNA臨床應(yīng)用有效性8.對ctDNA臨床已有轉(zhuǎn)化研究進(jìn)行了總結(jié),指出ctDNA的變化與多種實體瘤的腫瘤治療應(yīng)答相關(guān)；ctDNA檢測可先于影像學(xué)發(fā)現(xiàn)耐藥突變，為臨床提前調(diào)整治療方案改變腫瘤結(jié)局提供可能；ctDNA監(jiān)測與多個癌種復(fù)發(fā)風(fēng)險相關(guān)。9.對ctDNA監(jiān)測常規(guī)應(yīng)用于臨床：缺少如下工作無前瞻性研究證據(jù)（現(xiàn)有研究多屬回顧性研究）證明：ctDNA檢測的性能驗證：檢測的特異性、敏感度、不同平臺檢測的結(jié)果比較依據(jù)ctDNA檢測結(jié)果改變治療方案能夠確實改變腫瘤結(jié)局或節(jié)省成本；ctDNA可用于經(jīng)治后微小殘留病復(fù)發(fā)監(jiān)測；ctDNA用于復(fù)發(fā)監(jiān)測的假陰性及假陽性率；ctDNA進(jìn)行癌癥篩查的可行性1、雖然在某些類型的晚癌中ctDNA檢測法有效，但在大多數(shù)晚期癌癥中，ctDNA分析都缺乏足夠證據(jù)，表明其臨床有效性和實用性。2、ctDNA檢測結(jié)果與腫瘤組織活檢結(jié)果不一致時，建議以腫瘤組織基因分型結(jié)果為準(zhǔn)。3、沒有足夠證據(jù)表明ctDNA檢測能用于癌癥早篩、治療監(jiān)測和預(yù)后檢測。4、目前ctDNA臨床應(yīng)用的證據(jù)不足，不可盲目崇拜。但是，已有多項前瞻性的研究正在進(jìn)行中，期望未來能夠有更多可靠的證據(jù)。三、研究結(jié)論ctDNA檢測技術(shù)SangerSequencing（“金標(biāo)準(zhǔn)”）ARMS（AmplificationRefractoryMutationSystem）Mutant

WildARMS-qPCR（突變擴增阻滯系統(tǒng)）25ADxARMS-qPCR價格便宜，已在國內(nèi)商品化Cobas@ARMS-qPCR靈敏度高于ADx，尚未在國內(nèi)上市DuillardJY，OstomsG，eta1.BrJcancer，2014，110(1)：55-62ARMS技術(shù)利用特異引物對突變靶序列進(jìn)行高精準(zhǔn)PCR擴增放大，與此同時，利用探針對擴增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，在實時熒光定量PCR平臺上實現(xiàn)對樣品DNA中稀有突變的檢測，以達(dá)到對基因突變檢測的高特異性和高靈敏度。26=NoPCRProduct=WideTypePCRProduct=MutantPCRProduct樣品分割1digitalPCRPCR2熒光采集3定量檢測4優(yōu)勢：（1）定量檢測（2）更靈敏能夠檢測含量極低的核酸序列，可檢測單拷貝模板，靈敏度可達(dá)0.1%。（3）更精確終點PCR檢測，不依賴Ct值，不依賴擴增效率；精確分辨微小差異。微滴式芯片式通過直接計數(shù)每個孔內(nèi)的熒光信號得到同一樣品中等位基因(或野生型與突變型)的數(shù)目和比值。配制反應(yīng)液將引物、探針、DNA模板、ddPCR

supermix配制成20ul反應(yīng)液，加入到微滴發(fā)生卡上1引物和探針ddPCR反應(yīng)液DNA模板DG8微滴發(fā)生卡檢測微滴將96孔板放入微滴分析儀，順序吸取每個樣品的微滴并隨載液流逐一通過雙色檢測器4

分析數(shù)據(jù)有熒光信號的微滴為陽性，無熒光信號的微滴為陰性，軟件記錄每個樣品里陽性微滴的比例5微滴分析器

顯示結(jié)果軟件自動分析數(shù)據(jù)，并以多種方式顯示檢測結(jié)果6PCR擴增將微滴轉(zhuǎn)移到96孔PCR板上，于PCR儀上進(jìn)行擴增3PCR熱循環(huán)儀制備微滴將微滴反生卡放入微滴生成器，在2.5分鐘內(nèi)將每個20ul反應(yīng)液分成20000個微滴2微滴生成器微滴式數(shù)字PCR的基本流程dropletdigitalPCR（bio-rad微滴式）28QuantStudio?3D數(shù)字PCR系統(tǒng)（life芯片式）將探針，DNA和預(yù)混液混合1放置刮片3放置芯片蓋4放置芯片2采集信號8PCR7將樣本分配至20，000個孔6加樣529NGS（next-generationsequencing）IlluminaLife

---表皮生長因子受體(EGFR)是原癌基因C-erbB-1(HER-1)的表達(dá)產(chǎn)物，定位于細(xì)胞膜上。

---EGFR酪氨酸激酶功能區(qū)由外顯子18-24編碼。

---在中國，50%左右的非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者能檢測到18-21外顯子突變，含突變患者對TKIs藥物（酪氨酸激酶抑制劑）反應(yīng)性好。

---多項臨床研究顯示：EGFR-TKIs靶向治療可顯著延長患者的PFS（無進(jìn)展生存期），提高患者的生活質(zhì)量。

晚期NSCLC檢測EGFR基因突變LungcancerCausedbyairpollutionandsmoking.IthashighprevalenceandistheleadingcauseofcancermortalityinChina

Mostpatients(60%-70%)werediagnosedatlatestage(ⅲB,orⅳ),andhavelostthechanceforsurgicalcure.Theprognosisisstillpoorsofar.Mostpatientswithadvancedlungcancerreceivechemotherapyorconcurrentchemoradiotherapy.IfEGFRsensitivemutationintissueispositive,thepatientwillreceiveTKItherapyasthefirstlinetreatment.31LungcancerHistologicalclassificationNSCLCSquamouscarcinomasAdenocarcinoma(30~50%EGFRsensitivemutationpositive)SCLC(smallcelllungcancer)RECISTcriteriainsolidtumorsisappliedintheevaluationoftherapeuticresponsebasedonCTscan.CTscanhasX-rayradiationandcontrastmaterialusedmaycauseacutekidneyinjury.SerumNSEandProGRParerecommendedtoevaluateresponsestochemotherapyforSCLC.However,theroleofsolubletumormarkersinresponseassessmentinNSCLCisunclear.

32肺癌早期發(fā)現(xiàn)早治療5年生存期顯著延長85%8.9月92%肺癌藥物對平均生存時間延長8.9月（2002年到2012年，美國FDA一共批準(zhǔn)了71個抗腫瘤藥，其中包括52個靶向藥）1A肺癌患者10年生存率92%（第一個大樣本10年生存率，2006年，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志）85%肺癌病人在中晚期被發(fā)現(xiàn)IV期肺癌5年生存率4%

（美國NCI流行病調(diào)查數(shù)據(jù)，2015）

4%低劑量螺旋CT的高假陽性美國政府肺癌篩查臨床試驗(NLST)研究了53454例臨床結(jié)果，2011年發(fā)表在新英蘭醫(yī)學(xué)雜志2.年齡：55-74歲；吸煙史30年以上；隨訪時間6.5年3.24.2%發(fā)現(xiàn)肺內(nèi)陽性結(jié)節(jié)，96.4%為假陽性低劑量螺旋CT篩查良性結(jié)節(jié)肺癌第一部分Lungcancerscreening

---表皮生長因子受體(EGFR)是原癌基因C-erbB-1(HER-1)的表達(dá)產(chǎn)物，定位于細(xì)胞膜上。

---EGFR酪氨酸激酶功能區(qū)由外顯子18-24編碼。

---在中國，50%左右的非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者能檢測到18-21外顯子突變，含突變患者對TKIs藥物（酪氨酸激酶抑制劑）反應(yīng)性好。

---多項臨床研究顯示：EGFR-TKIs靶向治療可顯著延長患者的PFS（無進(jìn)展生存期），提高患者的生活質(zhì)量。

晚期NSCLC檢測EGFR基因突變非小細(xì)胞肺癌靶向藥物2003年EGFR基因突變EGFR-TKIsGefitinib吉非替尼2004年EGFR基因突變EGFR-TKIsErlotinib厄洛替尼2011年ALK、cMET基因突變ALK/cMET-TKIsCrizotinib克唑替尼2014年EGFR-T790M基因突變EGFR-TKIsCO-1686、AZD9291抑制T790M耐壓突變

BSC2–5monthsSingle-agentplatinum

6–8monthsPlatinum-baseddoublets

8–10monthsMedianSurvivalTime(months)Schiller,etal.NEJM2002Sandler,etal.NEJM20060 2 4 6 8 10 12 24+2000s1990s1980s1970s

Platinum-baseddoublet+Avastinfornon-SQC

12.3months

BSC=bestsupportivecareTKITherapyasfirst-lineforthepatientswithEGFRmutationEGFR-TKIs靶向治療可顯著延長患者的無進(jìn)展生存期DiseaseguidedapproachPathologicguidedapproachMolecularapproachPersonalizedMedicineNowadaysClinicalOncologyPathologicOncologyMolecularOncologyKrisMG,etal.JAMA.2014May21;311(19):1998-2006.yearMST（m）1960s42002s7.4-8.12014smutationtargetedtherapyMST（y）++3.5+-2.4--2.140基因檢測指導(dǎo)用藥：肺癌為例RelativeAbundanceofEGFRMutationsPredictsBene?tFromGe?tinibTreatmentforAdvancedNon–Small-CellLungCancerQingZhou,etal.JClinOncol,2011,29(24):3316-3321.42PlasmactDNAtestingiscurrentlythemostpromisingliquidbiopsytechnologyforTKIuse,benefitpredictionandmonitoringtumorevolution.Kaplan-Meiercurvesof(A)PFSand(B)OSaccordingtoanalysisofsensitiveEGFRmutation(19delorL858R)inTKI-naiveplasmasamplesidentifiedbyddPCR(n=73).XueYang,etal.Oncotarget,2016.7(15):20810-20824434445MetastaticlesionstherapyHistologicalSubtype有足夠的樣本來確定組織學(xué)亞型（如有需要可考慮重復(fù)取材）戒煙咨詢集成姑息治療腺癌大細(xì)胞癌NSCLCNOSEGFR突

變檢測

（1類）ALK檢測

（1類）EGFR±ALK應(yīng)該作為多基因檢測/二代測序的一部分cc

EGFR突變和ALK均為陰性或未知EGFR突變陽性一線治療前發(fā)現(xiàn)EGFR突變化療期間發(fā)現(xiàn)EGFR突變厄洛替尼(1類)或阿法替尼（1類）中斷或完成現(xiàn)有化療后開始厄洛替尼或阿法替尼治療或現(xiàn)有化療聯(lián)合厄洛替尼或阿法替尼（2B類）鱗狀細(xì)胞癌考慮EGFR突變和ALK檢測特別是從不吸煙患者或小活檢或混合樣本EGFR±ALK應(yīng)該作為多基因檢測/二代測序的一部分cc雙藥聯(lián)合化療（1類）或抗血管生成藥物+化療ALK陽性轉(zhuǎn)移灶First-linetreatment一線治療前發(fā)現(xiàn)ALK重排化療期間發(fā)現(xiàn)ALK重排克唑替尼(1類)中斷或完成現(xiàn)有化療后開始克唑替尼治療TestResultEGFR突變陽性ALK陽性EGFR突變和ALK均為陰性或未知腺癌、大細(xì)胞癌、NSCLCNOS腺癌、大細(xì)胞癌、NSCLCNOS雙藥聯(lián)合化療（1類）支持治療TissueEGFRmutationdetectionisusedforguidinglatestagelungcancerTKIselection.464748研究結(jié)果EGFR基因突變檢測推薦流程腫瘤組織標(biāo)本檢測結(jié)果為首選判定標(biāo)準(zhǔn)，ctDNA檢測結(jié)果作為補充判定標(biāo)準(zhǔn)。歐美研究結(jié)果51?數(shù)字PCR在晚期肺癌靶點檢測中有何應(yīng)用？血漿EGFR敏感熱點突變靶點檢測血漿EGFR敏感熱點突變靶點監(jiān)測一線治療前的血漿豐度預(yù)測獲益外科患者殘留病變檢測和治療決策、復(fù)發(fā)和生存預(yù)測稀有EGFR突變檢測方法的開發(fā)和檢測對策？

開發(fā)出LDTs、

集中檢測實時動態(tài)監(jiān)測——L858R----T790M

文獻(xiàn)中方法學(xué)比較研究背景52文獻(xiàn)出處組織和血漿配對樣本量組織EGFR檢測方法組織檢測陽性率血漿EGFR檢測方法血漿檢測陽性率靈敏度特異度一致率CCA.2016.鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院61對，ⅢA-ⅣAmoyARMS-PCR60.7%cSMART60.7%72-100%>94%

72.1%

CancerLetters.2016.天津醫(yī)科大學(xué)33對，ⅢA-ⅣNGS(IonPGM)21.2%NGS(IonPGM)33.3%57.1%69.2%66.7%TranslationalOncology2014.上海胸科醫(yī)院121對，ⅢB-ⅣAmoyARMS-PCR97.5%AmoyARMS-PCR76.0%80.2%70%73.5%AmJClinOncol.2013.韓國大學(xué)安南醫(yī)院57對，ⅢB-ⅣSanger21.1%PNA19.3%66.7%93.3%87.7%LungCancer.2011.紀(jì)念斯隆31對，III-IV限制性片段長度多態(tài)性（L858R）熒光定量PCR(E19-dels)58.1%質(zhì)譜法35.5%44.4%84.6%61.3%OncoTargetsandTherapy.2012.中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院34對，ⅢB-ⅣQiagenARMS-PCR23.5%DHPLC，ME-PCR,ARMS-PCR15.7%27.5%29.4%25%50%25%92.3%100%96.2%76.5%88.2%79.4%ChineseMedicalJournal.2011.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院73，IIIB-IV病理檢測EGFRL858R或E19-del的患者directDNAsequencing，DHPLC，ARMS-PCR6.8%30.1%38.4%6.8%30.1%38.4%--LungCancer.2015.阿斯利康38對，ⅢA-Ⅳ不同醫(yī)院的病理結(jié)果E19-del(73.7%)L858R(26.3%)T790M(73.9%)羅氏ARMS-PCR,63.2%86%100%89%23.7%90%100%97%18.4%41%100%57%QIAGENARMS-PCR,60.5%82%100%87%18.4%78%100%95%13.2%29%100%48%BIO-RADddPCR,----97%100%90%23.7%31.6%71%83%74%存在的問題：不同方法檢測血漿EGFR的性能存在差異；沒有系統(tǒng)的比較每一個平臺檢測血漿EGFR的性能；即便有比較多個平臺，但沒有將NGS和質(zhì)譜納入系統(tǒng)評價；同一平臺檢測血漿EGFR的不同熱點突變的性能有差異。Problems?

1.dPCR:

Canbequantitativeandsensitive,goodperformance,butonlyonelocuscanbetestedperreaction.

2.ARMS:

Qualitative,severallocusescanbetestedperreaction,butsensitivityeitherspecificityisdifferentbetweenmanufactures.

3.NGS:Quantitative,manygeneandlocusescanbetestedperreaction,sensitivityandspecificityisgood,butitisexpensive

4.ctDNA

ctDNAtestmethodisimproving,thesensitivityandspecificityofdifferentmanufacturesmustbevalidated.(forexampledifferentARMSplatform,differentNGSplatform)samplesizetissueplasmaSeSpCon33，ⅢA-ⅣNGS(IonPGM)NGS(IonPGM)57.1%69.2%66.7%121，ⅢB-ⅣADx-ARMSADx-ARMS80.2%70%73.5%34，ⅢB-ⅣQiagenARMSDHPLC，ME-PCR,ARMS25%50%25%92.3%100%96.2%76.5%88.2%79.4%73，IIIB-IVADx-ARMSSanger，DHPLC，ADx-ARMS6.8%30.1%38.4%--38，ⅢA-ⅣPathologyreportcobas-ARMS(19del,L858R,T790M)86%100%89%90%100%97%41%100%57%QIAGEN-ARMS(19del,L858R,T790M)82%100%87%78%100%95%29%100%48%ddPCR,(19del,L858R,T790M)---97%100%90%71%83%74%53validatetheaccuracyofNGScomparetheperformanceoffourplatformsofdetectingEGFRmutationsinplasma.ADx-ARMS,Cobas-ARMS，ddPCR,FireflyNGS20NSCLC(beforeorduringtreatment,PDorSDorPR)55tumortissue(primarylungtumortissueorlymphnodeorpleural)

peripheralblood(20mL,EDTA)

tDNA

cfDNA,germlineDNA

ADx-ARMS,NGS1.ToconfirmtheaccuracyofctDNAtest:

matchedtumortissuesweresampled;NGSandARMSwasusedtodetectEGFRmutationsintissue.2.TomaximizetherepresentationofallplasmaEGFRmutationlevels:

patientswithmutantandwild-typeEGFRstatusintumortissuewereincluded.

somepatientswereenrolledduringtreatmentwithapartialresponseorstablediseaseorprogressivedisease.3.ToincreasetherepresentationofdrugresistancemutationssuchasT790M:

somepatientsunderongoingtreatmentwithEGFR-TKI-1stwereincluded.Cross-platformcomparisonoftheperformanceofARMS,ddPCRandNGS-basedmethodsfordetectingEGFRmutationswithhighandlowlevelsinctDNA

wasperformed565758Currentstudy

PreviousstudiesThress,K.S,Brant,Retal.LungCancer.2015Dec;90(3):509-15;Sarah-JaneDawson,DanaW.Yetal.NEnglJMed2013;368:1199-1209.596061Oncotarget,2017,8(7):12501-16Guidetodetectingepidermalgrowthfactorreceptor(EGFR)mutationsinctDNAofpatientswithadvancednon-small-celllungcancerNicolaNormannoCellBiologyandBiotherapyUnit,IstitutoNazionaleTumori“FondazioneGiovanniPascale”,IRCCS,Napoli,ItalyMarcG.DenisDepartmentofBiochemistry,NantesUniversityHospital,Nantes,FranceKennethS.ThressAstraZeneca,Waltham,MA,USAMarianneRatcliffeAstraZeneca,Macclesfield,UKMartinReck5DepartmentofThoracicOncology,LungenClinicGrosshansdorf,Grosshansdorf,AirwayResearchCenterNorth(ARCN),MemberoftheGermanCentreforLungResearch(DZL),GermanyKeywords:ctDNA,NSCLC,EGFR,T790EGFR檢測的建議：非小細(xì)胞肺癌血液EGFR基因突變檢測中國專家共識《非小細(xì)胞肺癌血液EGFR基因突變檢測中國專家共識》制訂專家組中華醫(yī)學(xué)雜志，2015，95（46）：3721-6胸部腫瘤內(nèi)科主導(dǎo)，病理科參與吳一龍廣東省人民醫(yī)院張緒超王潔北大腫瘤醫(yī)院（現(xiàn)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院）2018年進(jìn)行了修訂未發(fā)表血漿EGFR/T790M基因突變檢測標(biāo)準(zhǔn)流程2017年7月12日分子病理在線病理科室與臨床溝通的媒體，規(guī)范分子病理診斷再臨床上的應(yīng)用1.樣本類型的選擇與處理2.EGFR基因突變檢測方法選擇3.EGFR基因突變用于臨床診斷與耐藥監(jiān)測檢測流程主要內(nèi)容組織>血漿>血清>尿液、腦脊液等研究結(jié)果血漿樣本處理歐美：EDTA或枸櫞酸鈉抗凝管抽血10ml，4℃運輸樣本,4h內(nèi)完成血漿分離；使用含固定劑抗凝管4-37℃轉(zhuǎn)運樣本，，可保穩(wěn)定48-72h,甚至7-10d。中國分子病理：未使用固定劑，分離血漿時間，1小時內(nèi)中國內(nèi)科：未使用固定劑分離血漿時間，2小時內(nèi)歐美：二次離心，去除殘留細(xì)胞污染物中國分子病理：復(fù)雜：固定劑時，1600g/10min,4℃,每1ml一份，共5份，冷凍保存，使用前，16000g/10min,4℃.沒有固定劑：2000g/10min,4℃,2次，使用前，16000g/10min,4℃.中國內(nèi)科：最大離心力離心2次。有引文，但敘述簡單。歐美：-20℃短期儲存（1月），-80℃長期儲存（>9月）；干冰轉(zhuǎn)運中國分子病理：-80℃長期儲存（>9月）；中國內(nèi)科：-70℃研究結(jié)果ctDNA提取方法？歐美：血漿ctDNA含量低，一般樣品體積需>2ml推薦使用專門用于ctDNA提取的試劑盒

QIAamp?circulatingnucleicacidkit[QIAGEN,Manchester,UK],polymermediatedenrichment(PME)free-circulatingDNAextractionkit[AnalytikJena,Jena,GermanyDSPvirus/pathogenmidikitperformedonQIAsymphony?[QIAGEN,Hilden,Germany])中國分子病理：

QIAamp(55114)MagMAX(A29319)Cobas中國內(nèi)科：CFDA批準(zhǔn)的提取試劑2.EGFR基因突變檢測方法特異度靈敏度ARMS特異引物擴增歐盟批準(zhǔn)-指導(dǎo)TKI治療>5%ctDNAddPCRSangerpyrosequencing1%ctDNA0.1%ctDNA可定量一次檢測一個突變

位點單分子PCR反應(yīng)判定標(biāo)準(zhǔn)？NGS>0.1%ctDNA可定量多個突變位點同時檢測高通量平行深度測序數(shù)據(jù)量不足？臨床方法選擇傾向：特異度優(yōu)先，平衡考慮靈敏度全文總結(jié)和建議

所有晚期NSCLC患者均應(yīng)進(jìn)行EGFR基因突變狀態(tài)檢測指導(dǎo)臨床用藥1、腫瘤組織和血漿ctDNA應(yīng)相互補充用于EGFR基因突變檢測，結(jié)合病人臨床癥狀；2、腫瘤組織可保證檢測結(jié)果準(zhǔn)確；而血漿ctDNA檢測因其無創(chuàng)操作、樣本易獲得、可彌補組織檢測片面的優(yōu)勢，可作為其EGFR基因突變有效的替代手檢測段。選擇檢測準(zhǔn)確性和靈敏度的方法1、血液樣本使用EDTA、枸櫞酸鈉或含固定劑抗凝管，及時離心處理及凍存；2、保證足量的血漿樣本，選用專門的ctDNA提取試劑盒；3、使用檢測敏感度、特異度高的檢測手段，如ARMS和NGS；4、其他：探索采樣時間、操作者規(guī)范化培訓(xùn)等。ctDNA在腫瘤術(shù)后微小殘留評估及預(yù)測中的臨床應(yīng)用研究CirculatingtumorDNApredictssurvivalinpatientswithresectedhighriskstageII/IIImelanoma.71MolecularOncologyGroup,CancerResearchUKManchesterInstitute,Manchester,UK.WarwickClinicalTrialsUnit,UniversityofWarwick,Coventry,UK.OxfordExperimentalCancerMedicineCentre,UniversityofOxford,Oxford,UK.CambridgeUniversityHospitalsNHSFoundationTrust,Cambridge,UK.FacultyofBiology,MedicineandHealth,TheUniversityofManchester,Manchester,UK.TheChristieNHSFoundationTrust,Manchester,UK.Clinicaltrialnumber:ISRCTN81261306.KEYWORDS:CirculatingtumourDNA;adjuvant;melanoma;prognosisAnnalsofOncology,mdx717,/10.1093/annonc/mdx717Published:03November2017黑色素瘤Background:Patientswithhigh-riskstageII/IIIresectedmelanomacommonlydevelopdistantmetastases.Atpresent,wecannotdifferentiatebetweenpatientswhowillrecurorthosewhoarecuredbysurgery.WeinvestigatedifcirculatingtumorDNA(ctDNA)canpredictrelapseandsurvivalinpatientswithresectedmelanoma.Patientsandmethods:WeperformeddropletdigitalpolymerasechainreactiontodetectBRAFandNRASmutationsinplasmatakenaftersurgeryfrom161stageII/IIIhigh-riskmelanomapatientsenrolledintheAVAST-Madjuvanttrial.Results:MutantBRAForNRASctDNAwasdetected(≥1copyofmutantctDNA)in15/132(11%)BRAFmutantpatientsamplesand4/29(14%)NRASmutantpatientsamples.PatientswithdetectablectDNAhadadecreaseddisease-freeinterval(DFI;hazardratio[HR]3.12;95%confidenceinterval[CI]1.79-5.47;P<0.0001)anddistantmetastasis-freeinterval(DMFI;HR3.22;95%CI1.80-5.79;P<0.0001)versusthosewithundetectablectDNA.DetectablectDNAremainedasignificantpredictorafteradjustmentforperformancestatus(PS)anddiseasestage(DFIHR3.26,95%CI1.83-5.83,P<0.0001;DMFIHR?=?3.45,95%CI1.88-6.34,P<0.0001).Fiveyearoverallsurvival(OS)rateforpatientswithdetectablectDNAwas33%(95%CI14-55%)versus65%(95%CI56-72%)forthosewithundetectablectDNA.OSwassignificantlyworseforpatientswithdetectablectDNA(HR2.63;95%CI1.40-4.96);P=0.003)andremainedsignificantafteradjustmentforPS(HR2.50,95%CI1.32-4.74,P=0.005).Conclusion:ctDNApredictsforrelapseandsurvivalinhigh-riskresectedmelanomaandcouldaidselectionofpatientsforadjuvanttherapy.7273無疾病生存無轉(zhuǎn)移生存存活中國黑色素瘤患者BRAF基因突變分析

北京腫瘤醫(yī)院惡性腫瘤發(fā)病機制及轉(zhuǎn)化研究教育部重點實驗室;100142,北京,北京大學(xué)臨床腫瘤學(xué)院,北京腫瘤醫(yī)院暨北京市腫瘤防治研究所腎癌黑色素瘤內(nèi)科目的:探討B(tài)RAF基因在中國人黏膜、肢端和非肢端皮膚黑色素瘤中的突變率和類型.方法:用PCR擴增和直接測序方法檢測90例中國惡性黑色素瘤(MM)患者腫瘤組織中BRAF外顯子11和15的突變情況.結(jié)果:黏膜、肢端和非肢端皮膚黑色素瘤患者腫瘤組織中BRAF基因的突變率分別為23.3%(7/30)、16.7%(5/30)和43.3%(13/30);25例BRAF基因突變中,1例為串聯(lián)突變,其它均為點突變;僅有1例BRAF基因突變位于第11外顯子,其余24例均位于BRAF第15外顯子.V600E突變占所有BRAF基因第15外顯子突變的83.3%(20/24).結(jié)論:BRAF基因在中國人非肢端皮膚黑色素瘤中突變率較高,且以該基因第15外顯子V600E點突變?yōu)橹?有可能成為靶向藥物作用的靶點.74II期結(jié)腸癌風(fēng)險分級回顧性研究（40844例）：傳統(tǒng)高風(fēng)險評估指標(biāo)：T4期、淋巴結(jié)采樣小于12個，穿孔，梗阻，切緣細(xì)胞陽性等研究高風(fēng)險評估指標(biāo)：傳統(tǒng)高風(fēng)險分級+CEA結(jié)直腸癌

整合腫瘤標(biāo)志物檢測可改善消化道腫瘤的預(yù)后評估兩種風(fēng)險分級與生存率的關(guān)系IncorporationofCEAImprovesRiskStratificationinStageIIColonCancer,2017納入CEA后導(dǎo)致高風(fēng)險病例大幅增加風(fēng)險分組普通風(fēng)險組高風(fēng)險組傳統(tǒng)分級17198例21890例研究分級12042例28802例高風(fēng)險病例增加16.9%IncorporationofCEAImprovesRiskStratificationinStageIIColonCancer,2017IncorporationofCEAImprovesRiskStratificationinStageIIColonCancer,2017手術(shù)手術(shù)+輔助化療術(shù)前CEA升高患者增加輔助化療獲益更大提示CEA增高的患者可考慮在手術(shù)后增加輔助化療在II期結(jié)腸癌中，術(shù)前CEA升高是一個獨立危險因素，與更差的生存相關(guān)。擁有鑒別高風(fēng)險患者，可改善患者風(fēng)險評估效能CEA升高具有作為增加輔助化療指標(biāo)的潛在價值，值得進(jìn)一步研究結(jié)論：IncorporationofCEAImprovesRiskStratificationinStageIIColonCancer,2017雜志：JAMAOncology影響因子：16.559分發(fā)表時間：2017年12月單位：美國紀(jì)念斯隆凱特琳癌癥中心作者：Konish等結(jié)腸癌切除術(shù)前及術(shù)后CEA濃度與癌癥轉(zhuǎn)歸的關(guān)系研究背景指南推薦結(jié)腸癌患者常規(guī)檢測術(shù)前CEA。盡管術(shù)后CEA持續(xù)升高與轉(zhuǎn)移性疾病的風(fēng)險增加相關(guān)，但術(shù)前CEA升高術(shù)后恢復(fù)正常的預(yù)后意義不明。為了探討術(shù)前CEA升高但術(shù)后恢復(fù)正常的結(jié)腸癌患者，與術(shù)前CEA正?；颊呦啾仁欠裼懈叩膹?fù)發(fā)風(fēng)險，該項回顧性隊列研究選取了2007年1月至2014年12月間確診Ⅰ~Ⅲ期并接受了根治性切除術(shù)的結(jié)腸腺癌患者。將患者分為術(shù)前CEA正常、術(shù)前升高但術(shù)后正常、術(shù)前和術(shù)后CEA均升高三組。并以3年無復(fù)發(fā)生存為主要評價指標(biāo)。研究方法研究結(jié)果1.研究對象基線資料該研究共納入914例患者。右半結(jié)腸癌468例（51.2%），左半結(jié)腸癌446例（48.8%）。術(shù)前CEA中值：2.8（1.9-4.6）ng/ml術(shù)后CEA中值：2.5（1.7-3.7）ng/ml隨訪時間中值：38（21-56）個月研究結(jié)果2.切除術(shù)前后CEA濃度與3年無復(fù)發(fā)生存率的關(guān)系風(fēng)險模型分析發(fā)現(xiàn)，相對于術(shù)前和術(shù)后CEA正常的患者，術(shù)后CEA升高的結(jié)腸癌患者其發(fā)生3年復(fù)發(fā)的風(fēng)險更大，發(fā)生時間更早；研究結(jié)果術(shù)前/術(shù)后CEA水平與結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)生存的相關(guān)性分析單因素分析結(jié)果：年齡、TNM分期、淋巴管浸潤情況及術(shù)后CEA升高均為3年無復(fù)發(fā)生存期的影響因素；多因素分析結(jié)果：術(shù)后CEA濃度升高是3年無復(fù)發(fā)生存的獨立影響因素；術(shù)后CEA增高是3年無復(fù)發(fā)生存期的獨立危險因素，但術(shù)后CEA恢復(fù)正常則并非風(fēng)險相關(guān)因素。研究者建議常規(guī)檢測術(shù)后CEA水平，術(shù)后CEA水平升高患者復(fù)發(fā)風(fēng)險增加，尤其是在術(shù)后12個月內(nèi)。CirculatingtumorDNAanalysisdetectsminimalresidualdiseaseandpredictsrecurrenceinpatientswithstageIIcoloncancer.86SciTranslMed.2016Jul6;8(346):346ra92.doi:10.1126/scitranslmed.aaf6219.SerialcirculatingtumourDNAanalysisduringmultimodalitytreatmentoflocallyadvancedrectalcancer:aprospectivebiomarkerstudyGUT.Received13December2017Revised15January2018Accepted18January2018EarlyDetectionofMolecularResidualDiseaseinLocalizedLungCancerbyCirculatingTumorDNAProfilingCANCERISCOVERYDecember201792Theidentificationofearly-stagebreastcancerpatientsathighriskofrelapsewouldallowtailoringofadjuvanttherapyapproaches.WeassessedwhetheranalysisofcirculatingtumorDNA(ctDNA)inplasmacanbeusedtomonitorforminimalresidualdisease(MRD)inbreastcancer.Inaprospectivecohortof55earlybreastcancerpatientsreceivingneoadjuvantchemotherapy,detectionofctDNAinplasmaaftercompletionofapparentlycurativetreatment—eitheratasinglepostsurgicaltimepointorwithserialfollow-upplasmasamples—predictedmetastaticrelapsewithhighaccuracy[hazardratio,25.1(confidenceinterval,4.08to130.5;log-rankP<0.0001)or12.0(confidenceinterval,3.36to43.07;log-rankP<0.0001),respectively].Mutationtrackinginserialsamplesincreasedsensitivityforthepredictionofrelapse,withamedianleadtimeof7.9monthsoverclinicalrelapse.WefurtherdemonstratedthattargetedcapturesequencinganalysisofctDNAcoulddefinethegeneticeventsofMRD,andthatMRDsequencingpredictedthegeneticeventsofthesubsequentmetastaticrelapsemoreaccuratelythansequencingoftheprimarycancer.Mutationtrackingcanthereforeidentifyearlybreastcancerpatientsathighriskofrelapse.SubsequentadjuvanttherapeuticinterventionscouldbetailoredtothegeneticeventspresentintheMRD,atherapeuticapproachthatcouldinpartcombatthechallengeposedbyintratumorgeneticheterogeneity.93雜志：Blood影響因子：13.164發(fā)表時間：2018年2月單位：瑞士貝林佐納腫瘤研究所作者：

ValeriaSpina等經(jīng)典型霍奇金淋巴瘤--ctDNA揭示的遺傳學(xué)、克隆演化和殘留疾病一.研究背景及目的目前，對于經(jīng)典型霍奇金淋巴瘤基因組認(rèn)識較為缺乏，缺乏基因標(biāo)志物用于臨床診斷、治療和預(yù)后評估?，F(xiàn)有檢測方法：PET/CT被廣泛用于化療后的預(yù)后預(yù)測來指導(dǎo)早期治療強化或降級，然而約20-30％患者的PET/CT結(jié)果與臨床結(jié)局不一致，從而導(dǎo)致了臨床的過度治療或治療不足。血漿ctDNA可用于腫瘤基因分型，已有研究發(fā)現(xiàn)基因拷貝數(shù)異常、免疫球蛋白基因重排或者單基因突變可作為腫瘤標(biāo)志物。因此該研究旨在證明ctDNA在ctDNA揭示的遺傳學(xué)、克隆演化和殘留疾病。二、研究方法研究對象80例初次診斷未經(jīng)治療cHL患者32例難治性/復(fù)發(fā)cHL患者（均經(jīng)一線治療及自體移植術(shù)治療失?。?）血漿cfDNA（2）組織基因組DNA（gDNA）治療開始前（n=80）ABVD治療期間（第二療程開始時）（n=24）難治性階段（n=32）自體移植術(shù)前后（n=6）brentuximabvedotin治療失敗前后（n=5）nivolumab治療前和治療期間（n=5）HRS細(xì)胞的gDNA和無HRS細(xì)胞的活檢區(qū)域的腫瘤gDNA。配對的血樣：組織活檢后7-14天來自新診斷的彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（DLBCL）（n=19）和原發(fā)癌縱隔大B細(xì)胞淋巴瘤（PMBL）（n=3）的cfDNA和相應(yīng)的配對正常gDNA

分析以下生物材料：四、研究結(jié)果-預(yù)實驗CAPP-seq檢測cHL具有有效性（CAPP-seq）（targetedultra-deep-NGS）在所有檢測到的突變中發(fā)現(xiàn)，＞20%的患者檢測到多種非同義突變，其中STAT6的突變檢測率為37.5％，TNFAIP3的突變檢出率為35.0％，ITPKB的突變檢出率為27.5％在15例cHL患者的血漿ctDNA分析發(fā)現(xiàn)，主要有STAT6、ITPKB、TNFAIP3、和B2M基因檢出非同義突變活檢HRS細(xì)胞中檢測到的基因突變在ctDNA

中的檢出率為87.5%（84/96，95%CI：79.2%-92.8%）四、研究結(jié)果-ctDNA與組織比較初診cHL中的ctDNA基因分析四、研究結(jié)果-驗證

在納入研究的80例初診cHL患者中，發(fā)現(xiàn)ctDNA

基因突變檢出率為81.2%，平均每個患者5個突變。平均等位基因頻率為5.5%（0.29-74.0%），且87.3%的患者其等位基因頻率＞1%

治療前ctDNA濃度與病理分期、分級及GHSG風(fēng)險評分顯著相關(guān)，分期分級高及預(yù)后評估差的患者ctDNA突變濃度較高，提示ctDNA可作為腫瘤負(fù)荷評估的一種替代標(biāo)志物三、研究結(jié)果4.ctDNA用于動態(tài)監(jiān)測cHL的療效（24例）對24例cHL治療兩個療程后ctDNA濃度分析發(fā)現(xiàn)，治療后發(fā)展為進(jìn)展性疾病（PD）的患者較治愈的患者的ctDNA濃度變化顯著較小，提示治療后ctDNA濃度變化可作為療效監(jiān)測的生物標(biāo)志物三、研究結(jié)果4.ctDNA用于動態(tài)監(jiān)測cHL的療效（24例）

對預(yù)后生存分析發(fā)現(xiàn)，治療兩個療程后ctDNA濃度變化＜-2log倍的患者其預(yù)后生存較ctDNA濃度變化＞-2log倍顯著縮短，提示ctDNA在監(jiān)測cHL對預(yù)后生存的預(yù)測價值；同時比較ctDNA和PET/CT的預(yù)后價值發(fā)現(xiàn)，ctDNA對預(yù)后的評估更為準(zhǔn)確，提示ctDNA可作為PET/CT的補充，作為cHL的療效評估和預(yù)后監(jiān)測的動態(tài)生物標(biāo)志物ctDNA突變檢測與組織HRS細(xì)胞的基因突變一致性為87.5%，可輔助組織作為cHL的替代生物標(biāo)志物；cHL患者ctDNA中檢出的主要基因突變?yōu)镾TAT6、TNFAIP3、ITPKB，cHL治療前ctDNA突變頻率與腫瘤的分期分級及預(yù)后顯著正相關(guān)；ctDNA可用于難治性cHL的疾病進(jìn)展監(jiān)測；ctDNA可作為PDG-PET的有效補充，可作為cHL療效監(jiān)測的無創(chuàng)性動態(tài)生物標(biāo)志物。三、研究內(nèi)容HER-2蛋白介紹人表皮生長因子受體家族（HumanEpidermalGrowthFactorReceptor,HER）只有HER-2過表達(dá)會增強下游信號通路活化外周血HER2拷貝數(shù)研究（胃癌）HER-2/neu蛋白結(jié)構(gòu)示意HER-2/neu是跨膜蛋白，結(jié)構(gòu)上分為三個部分：胞外段，跨膜區(qū)和胞內(nèi)段HER-2/neu蛋白大小約185kDa(P185)胞外段跨膜區(qū)胞內(nèi)段酶切位點ClinCancer