低氧微環(huán)境促進人嗅黏膜間充質(zhì)干細胞增殖

低氧微環(huán)境促進人嗅黏膜間充質(zhì)干細胞增殖及其機制的研究Thestudyofhypoxicmicroenvironmentpromotingolfactorymucosamesenchymalstemcells(OM-MSCs)toproliferateanditsmechanism背景—干細胞春天

干細胞移植治療神經(jīng)損傷及修復(fù)一直是神經(jīng)學(xué)科界研究的熱點。目前，有研究證實胚胎干細胞、神經(jīng)干細胞、多能干細胞等均對神經(jīng)修復(fù)治療有效，而這些細胞仍然存在著一些如：倫理、免疫排異及細胞來源不足等問題。間充質(zhì)干細胞（MSCs）背景—間充質(zhì)干細胞

種子細胞Seedwhatisit?背景—OM-MSCs2008年研究者在人鼻嗅黏膜中發(fā)現(xiàn)嗅黏膜間充質(zhì)干細胞（olfactorymucosamesenchymalstemcells，OM-MSCs）[1]，也稱為外胚間充質(zhì)干細胞(OE-MSC)，同時又被稱為固有層間充質(zhì)干細胞(LP-MSC)。Lindsay,S.L.,Riddell,J.S.,andBarnett,S.C.(2010).Olfactorymucosafortransplant-mediatedrepair:acomplextissueforacomplexinjury.Glia58,125–134.Lindsay,S.L.,Johnstone,S.A.,Mountford,J.C.,Sheikh,S.,Allan,D.B.,Clark,L.,andBarnett,S.C.(2013).HumanmesenchymalstemcellsisolatedfromolfactorybiopsiesbutnotboneenhanceCNSmyelinationinvitro.Glia61,368–382.OM-MSCs可表達間充質(zhì)干細胞的標(biāo)記物，同時也具有自己的特點基因聚類分析提示，OM-MSCs與BMSCs是密切相關(guān)，具有同源性的。Delorme,B.,Nivet,E.,Gaillard,J.,Haupl,T.,Ringe,J.,Deveze,A.,Magnan,J.,Sohier,J.,Khrestchatisky,M.,Roman,F.S.,etal.(2010).Thehumannoseharborsanicheofolfactoryectomesenchymalstemcellsdisplayingneurogenicandosteogenicproperties.StemCellsDev.19,853–866.Lindsay,S.L.,Johnstone,S.A.,Mountford,J.C.,Sheikh,S.,Allan,D.B.,Clark,L.,andBarnett,S.C.(2013).HumanmesenchymalstemcellsisolatedfromolfactorybiopsiesbutnotboneenhanceCNSmyelinationinvitro.Glia61,368–382.OM-MSC背景—OM-MSCs脂肪組織、骨組織誘導(dǎo)Lindsay,S.L.,Johnstone,S.A.,Mountford,J.C.,Sheikh,S.,Allan,D.B.,Clark,L.,andBarnett,S.C.(2013).HumanmesenchymalstemcellsisolatedfromolfactorybiopsiesbutnotboneenhanceCNSmyelinationinvitro.Glia61,368–382.Delorme,B.,Nivet,E.,Gaillard,J.,Haupl,T.,Ringe,J.,Deveze,A.,Magnan,J.,Sohier,J.,Khrestchatisky,M.,Roman,F.S.,etal.(2010).Thehumannoseharborsanicheofolfactoryectomesenchymalstemcellsdisplayingneurogenicandosteogenicproperties.StemCellsDev.19,853–866.相比BMSC，OM-MSCs展現(xiàn)出更強大的增殖效率和更短的倍增時間。背景—OM-MSCs增殖迅速背景—OM-MSCs分布廣泛OM-MSCs不受獲取部位的影響，廣泛獲取上鼻甲、中鼻甲、下鼻甲、鼻中隔，皆可培養(yǎng)出OM-MSCs，且培養(yǎng)出的細胞生物學(xué)特性沒有差異。aged10–19yearsaged20–39yearsaged40–59yearsaged60–75years10–19y

20–39y40–59y60–75y志愿者的年齡不會影響OM-MSCs的增殖活力和生物學(xué)特性Hwang,S.H.,Park,S.H.,Choi,J.,Lee,D.C.,Oh,J.H.,Yeo,U.C.,Kim,S.W.,andSun,D.I.(2013).Age-relatedcharacteristicsofmultipotenthumannasalinferiorturbinate-derivedmesenchymalstemcells.PLoSOne8,e74330.背景—OM-MSCs安全性Shafiee,A.,Kabiri,M.,Ahmadbeigi,N.,Yazdani,S.O.,Mojtahed,M.,Amanpour,S.,andSoleimani,M.(2011).Nasalseptum-derivedmultipotentprogenitors:apotentsourceforstemcell-basedregenerativemedicine.StemCellsDev.20,2077–2091.通過慢病毒轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白，轉(zhuǎn)染后>98%細胞轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白。體內(nèi)和體外致瘤的實驗，在體外的軟瓊脂。OM-MSCs不會在軟瓊脂增殖，而MKN45腫瘤細胞系會出現(xiàn)典型的細胞克隆球。在體外注射OM-MSCs和MKN45腫瘤細胞系到免疫缺陷的小鼠上，MKN45細胞可出現(xiàn)明顯的腫瘤發(fā)生，而OM-MSCs注射部位未見明顯腫瘤發(fā)生。OM-MSCs作為新發(fā)現(xiàn)的一類間充質(zhì)干細胞，不僅具有間充質(zhì)干細胞的一般特性，相比BMSC還具有以下優(yōu)點[2]

:1)具有更高的增殖效率和更短的傳代時間2)來源于外胚層，相當(dāng)于BMSC、ADSC等細胞來源于中胚層，OM-MSCs來源于外胚層無需跨胚層分化為神經(jīng)元3)來源穩(wěn)定，嗅粘膜可終身更新，廣泛分布鼻腔內(nèi)，易于取材4)不受年齡限制，其生物學(xué)活性不隨年齡的增長而改變5)安全性高，染色體核組分析和腫瘤基因分析顯示體外無限傳代后沒有基因變異背景—OM-MSCs

目前，我們于國內(nèi)首次成功培養(yǎng)出了OM-MSCs并做了相關(guān)鑒定及成功建立了OM-MSCs培養(yǎng)體系。已發(fā)表與OM-MSCs培養(yǎng)鑒定相關(guān)文章背景—OM-MSCs有研究已證實了低氧能顯著影響B(tài)M-MSCs與人胚胎干細胞的增殖及細胞因子的分泌功能常規(guī)細胞體外培養(yǎng)的氧氣濃度約為21%，C02濃度約為5%，而人體正常組織和組織間隙中的氧氣濃度為3%-9%對于細胞增殖、功能都有著極為重要的作用2RenH,CaoY,ZhaoQ,etal.Proliferationanddifferentiationofbonemarrowstromalcellsunderhypoxicconditions.BiochemBiophysResCommun.2006.347(1):12-21.ForristalCE,WrightKL,HanleyNA,OreffoRO,HoughtonFD.Hypoxiainduciblefactorsregulatepluripotencyandproliferationinhumanembryonicstemcellsculturedatreducedoxygentensions.Reproduction.2010.139(1):85-97.背景—低氧微環(huán)境

通常將小于10%的氧氣濃度稱為低氧，但此濃度仍比人體正常組織及組織間隙的氧氣濃度要高，人體正常組織及組織間隙中的氧氣濃度約為3%-9%，血液中氧濃度約為1%-13%，而骨髓腔內(nèi)氧氣濃度僅1%-7%，所以本實驗我們選取3%O2的微環(huán)境來培養(yǎng)OM-MSCs，同時觀察研究低氧對其細胞增殖能力及細胞活性的影響。

低氧裝置WangY,YangJ,LiH,etal.HypoxiapromotesdopaminergicdifferentiationofmesenchymalstemcellsandshowsbenefitsfortransplantationinaratmodelofParkinson'sdisease.PLoSOne.2013.8(1):e54296.背景—低氧微環(huán)境IsolationandCultureofhOM-MSCs.ExperimentalDesignRNAExtractionandRT-PCR.ELISA.OM-MSChypoxemiaHIF-1α技術(shù)路線圖結(jié)果Fig.1OM-MSCs的形態(tài)學(xué)特征.A:貼壁細胞從組織塊中爬出，并顯示出紡錘形外觀及放射狀的排列順序；.B-C:免疫熒光結(jié)果顯示：細胞表達MSC標(biāo)志物：Nestin、STRO。Scalebars:(a)50μm;(b)200μm;(c)200μm.CBFig.1OM-MSCs的形態(tài)學(xué)特征.D:流式細胞學(xué)術(shù)鑒定；細胞表達MSC標(biāo)記物：CD73,CD90,andCD105,不表達造血干細胞標(biāo)記物：CD34andCD45。結(jié)果結(jié)果

3％O2組3％O2組+YC-1組常氧組（21％O2）Fig.2：三組均在各自環(huán)境下培養(yǎng)光鏡圖。A-C：B圖的細胞數(shù)量顯著增多，A圖細胞數(shù)介于中間，C圖細胞數(shù)最少，說明低氧環(huán)境下能促進OM-MSCs的增殖。Fig.2：三組均在各自環(huán)境下培養(yǎng)后細胞計數(shù)統(tǒng)計圖。D：細胞數(shù)量統(tǒng)計圖（**代表P<0.01，*代表P<0.05）。結(jié)果DFig.3：低氧微環(huán)境促進OM-MSCs增殖的細胞周期流式檢測。A：為各組細胞周期檢測結(jié)果；結(jié)果AFig.3：低氧微環(huán)境促進OM-MSCs增殖的細胞周期流式檢測。B：百分比統(tǒng)計結(jié)果表格，其中PI（增殖系數(shù)）={(S+G2/M)÷(GO/1+S+G2/M)}×100％；結(jié)果顯示3％O2組的PI值大于21％O2組（**代表P<0.01，*代表P<0.05）n=3。C：統(tǒng)計結(jié)果圖（*代表P<0.05）n=3。結(jié)果BCFig.4：三組均在各自環(huán)境下培養(yǎng)72h后對其細胞的增殖細胞核抗原（PCNA）進行Westernblot檢測。檢測結(jié)果顯示:3％O2組中PCNA蛋白表達最高，3％O2+YC-1組的表達介于中間，而常氧組的表達最少，B圖為A圖的統(tǒng)計結(jié)果分析圖。此結(jié)果進一步證實了低氧具有促進OM-MSCs增殖的作用（**代表P<0.01，*代表P<0.05）。結(jié)果A3％O221％O23％O2+YC-1PCNAActinBFig.5：用細胞流式檢測各組OM-MSCs的凋亡情況。A：為各組細胞流式凋亡結(jié)果圖，B：為統(tǒng)計結(jié)果分析，結(jié)果顯示各組存活細胞及凋亡細胞比例無顯著統(tǒng)計學(xué)差異（**代表P<0.01，*代表P<0.05）。A結(jié)果B結(jié)果ABFig.6：HIF-1α及下游靶基因TWIST的Q-PCR檢測A：本實驗通過Q-PCR檢測各組HIF-1αmRNA表達情況顯示：低氧組中HIF-1α表達量最高，加了HIF-1α抑制劑的抑制劑組中HIF-1α表達僅為B組的一半，常氧組中HIF-1α表達則明顯最低。B：TWIST表達與HIF-1α一致。結(jié)果CDFig.6：HIF及下游靶基因TWIST的westernblot檢測C：低氧組中HIF-1α表達量最高，加了HIF-1α抑制劑的抑制劑組中HI