第四章核酸操作的基本技術(shù)

第四章核酸操作的基本技術(shù)新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院第四章核酸操作的基本技術(shù)核酸的操作技術(shù)是基因工程最基本的技術(shù)之一在基因工程技術(shù)中，研究的對(duì)象和材料都涉及到核酸核酸技術(shù)包括：核酸的提取與純化、檢測(cè)與保存、凝膠電泳、分子雜交等第一節(jié)核酸的提取與純化制備核酸的根本要求：保持核酸的完整性，既保持天然狀態(tài)細(xì)胞內(nèi)核酸酶活力很高，防止核酸酶對(duì)核酸的降解防止化學(xué)因素（酸、堿等）和物理因素（高溫、機(jī)械剪切等）RNase分布廣，活力很高（RNA)DNA分子長(zhǎng)、容易斷裂，防止張力剪切作用第一節(jié)核酸的提取與純化提取純化核酸分為三大步細(xì)胞破碎除去與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)及多糖脂等雜質(zhì)除去其他雜質(zhì)核酸一、基本原理（一）化學(xué)試劑提取法CTAB法SDS法（二）離心分離法（一）化學(xué)試劑提取法CTAB法CTAB(十六烷基三乙基溴化銨)是一種去污劑，可溶解細(xì)胞膜，它能與核酸形成復(fù)合物，在高鹽溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，當(dāng)降低溶液鹽濃度到一定程度（0.3mol/LNaCl）時(shí)，從溶液中沉淀，通過(guò)離心就可將CTAB-核酸的復(fù)合物與蛋白，多糖類(lèi)物質(zhì)分開(kāi)。最后通過(guò)乙醇或異丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或異丙醇而除去。

（一）化學(xué)試劑提取法SDS法研磨的組織細(xì)胞用熱的SDS裂解后，加入高濃度的KAc，0℃放置以除去蛋白和多糖類(lèi)雜質(zhì)，最后用乙醇或異丙醇沉淀。

質(zhì)粒pBSSKpET28c(+)pBSKSChiA（二）離心分離法根據(jù)核酸長(zhǎng)度大小的不同進(jìn)行純化超速離心凝膠電泳超速離心根據(jù)樣品的質(zhì)量來(lái)進(jìn)行分離，稱(chēng)為速度區(qū)帶離心沉降的速度與樣品的質(zhì)量、密度、離心力大小、介質(zhì)的摩擦力大小有關(guān)。根據(jù)樣品的密度大小不同而進(jìn)行分離，稱(chēng)為密度梯度離心質(zhì)量和密度大的顆粒比小的沉降快，介質(zhì)密度與樣品的密度相等時(shí)，樣品停止移動(dòng)，停留在該介質(zhì)密度的位置上氯化銫密度梯度離心法溴化乙錠(EB)是一種吖啶類(lèi)染料，它可以插入DNA的堿基對(duì)之間，使DNA的體積增大，浮力密度變小。EB容易插入線狀的DNA，而與環(huán)狀質(zhì)粒DNA的結(jié)合量小于與線狀染色體DNA的結(jié)合量，從而使兩者的浮力密度出現(xiàn)懸殊的差別，更利于離心時(shí)分離。

氯化銫密度梯度離心法CsCl是一種高分子量的重金屬鹽。在高速離心條件下，就會(huì)在離心管中形成CsCl密度梯度。將DNA樣品加EB與CsCl一起離心，當(dāng)DNA的沉降速度與擴(kuò)散速度達(dá)到平衡狀態(tài)時(shí)，DNA就形成一穩(wěn)定的區(qū)帶。在合適的CsCl密度梯度范圍中，DNA就處在一定的位置上，這時(shí)DNA的浮力密度就等于該位置上的CsCl的密度。由于質(zhì)粒DNA的浮力密度大于線狀染色體DNA的浮力密度，染色體DNA的區(qū)帶在上層，質(zhì)粒DNA的區(qū)帶在下層。兩者能明顯地分開(kāi)而達(dá)到分離的目的。氯化銫密度梯度離心法在提取的樣品中，還含有大量RNA。一般來(lái)說(shuō)，DNA與RNA的浮力密度是與CsCl、H20相互作用有關(guān)，而RNA在CsCl中總是與Cs+相結(jié)合，故密度很大。在超速離心時(shí)，RNA將沉入離心管底，這樣就可以與質(zhì)粒DNA相分離。（三）一般過(guò)程供體細(xì)胞培養(yǎng)收集(菌體)細(xì)胞細(xì)胞破碎分離總DNA

分離細(xì)胞器分離總RNA

分離細(xì)胞器DNARNApoly(A)RNA

特異性RNA

染色體DNA(組建基因組文庫(kù))

DNA分離純化過(guò)程

破碎細(xì)胞+DNA抽提液(EDTA、去污劑、還原劑)65℃溫育20’冰浴冷卻離心去細(xì)胞碎片苯酚抽提法①

CsCl密度梯度離心②①苯酚抽提法上清液緩沖液用水飽和苯酚抽提2~3次上層液相用氯仿抽至界面無(wú)蛋白變性物上層液相用兩倍體積冷乙醇沉淀沉淀物用70%冷乙醇洗滌,干燥溶于緩沖液加入RNAase處理除去RNA苯酚氯仿抽提沉淀干燥

酚/氯仿抽提DNA蛋白質(zhì)②

CsCl密度梯度離心

上清液加入固體CsCl與EtBr溶液室溫下超速離心(45,000rpm）16小時(shí)穿孔取出DNA（320nm）異丙醇抽提溴乙錠緩沖液透析除去殘余CsCl

兩倍體積冷乙醇沉淀DNA離心、洗滌、干燥proteinsocDNAL-DNAcccDNARNAs細(xì)胞器DNA的分離植物組織用核分離緩沖液勻漿過(guò)濾濾液離心(2000g,10’,4℃)核緩沖液使核裂解(含0.5%TritonX-1抽提DNA植物組織細(xì)胞器緩沖液勻漿離心(100g,10’,4℃)除去細(xì)胞核離心(1800g,10’,4℃)分離葉綠體離心(10,000g,10’,4℃)分離線粒體DNase除去細(xì)胞器外DNA加入EDTA使DNase失活純化細(xì)胞器細(xì)胞器裂解提取DNA質(zhì)粒載體DNA的分離關(guān)鍵：如何使質(zhì)粒DNA與宿主染色體DNA分開(kāi)原理：質(zhì)粒DNA比染色體DNA小得多，在DNA抽提過(guò)程中，染色體DNA斷裂成小片段(線狀)，質(zhì)粒DNA仍保持超螺旋構(gòu)型

質(zhì)粒載體DNA的分離超速離心：利用兩種DNA分子的大小和空間構(gòu)型變性法：在變性條件下使染色體DNA變?yōu)閱捂?，而質(zhì)粒DNA仍保持環(huán)狀結(jié)構(gòu)，當(dāng)變性條件發(fā)生迅速變化時(shí)，前者仍不能復(fù)性，而后者又可回復(fù)到天然構(gòu)型。變性條件可采用加熱煮沸法或堿變性法RNA的分離與純化制備RNA的關(guān)鍵—防止內(nèi)外源RNase的作用RNase的特點(diǎn)：抗酸抗堿,具很廣pH作用范圍;抗高溫嚴(yán)寒(0~65℃均具活性）；抗變性劑解決辦法外源RNase—高溫，焦磷酸二乙酯(DEPC)處理所有溶液（Tris·HCl除外）和器皿，操作者帶手套內(nèi)源RNase—高溫抽提，強(qiáng)蛋白質(zhì)變性劑，RNase抑制劑，蛋白酶K等RNA的分離與純化破碎細(xì)胞核蛋白復(fù)合體充分變性，即使核蛋白迅速與核酸分離抑制內(nèi)源RNase以及污染的外源RNase的活性將RNA與DNA、蛋白質(zhì)和多糖分開(kāi)細(xì)胞裂解物

胍鹽法

總RNA分子雜交法—

特異RNA分子

熱苯酚法凝膠電泳圍RNA大小分級(jí)分離大小范蔗糖密度梯度離心

一定

LiCl/核酸序列

尿素法離心分級(jí)分離親和層析法—poly（A）RNA分子

高速離心法

全部多聚核糖體

上清液鎂鹽沉淀法蔗糖密度梯度離心—結(jié)合與游離多聚核糖體分級(jí)分離法

蔗糖連續(xù)密度—一定范圍大小核糖體多聚核糖體RNA免疫沉淀法——特異性多聚核糖體

第二節(jié)核酸的檢測(cè)與保存一、核酸的檢測(cè)二、核酸的保存一、核酸的檢測(cè)紫外光譜分析法通常以A260值為1相當(dāng)于50ug/mL雙螺旋DNA，或40ug/mL單鏈DNA(或RNA),或20ug/mL寡核苷酸計(jì)算核酸的純度純DNA的A260/A280應(yīng)大于1.8純RNA的A260/A280應(yīng)大于2.0一、核酸的檢測(cè)熒光分析法采用熒光物質(zhì)轉(zhuǎn)移的待測(cè)物質(zhì)結(jié)合，通過(guò)測(cè)定熒光的強(qiáng)度來(lái)間接測(cè)定待測(cè)物質(zhì)的濃度及含量凝膠電泳法估計(jì)DNA的濃度二、核酸的保存影響核酸保存的關(guān)鍵因素保存液的酸堿度保存溫度核酸制品的保存方法第三節(jié)核酸的凝膠電泳在生理?xiàng)l件下，核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基團(tuán)成離子化狀態(tài)，DNA和RNA的多核苷酸鏈呈現(xiàn)出多聚陰離子的特性在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)，在一定電場(chǎng)下，分子量小的比較大遷移的要快些第三節(jié)核酸的凝膠電泳

種類(lèi)

按凝膠材料分:聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠電泳(普通瓊脂糖和低熔點(diǎn)瓊脂糖)按電泳裝置分:水平式/瓊脂糖凝膠;豎式/聚丙烯酰胺凝膠兩種方法比較：分離效果和分離范圍;操作難易第三節(jié)核酸的凝膠電泳用途瓊脂糖凝膠用于DNA和RNA的常規(guī)分析；聚丙烯酰胺凝膠常用于小分子核酸分析。凝膠電泳的一般程序制膠點(diǎn)樣電泳染色觀察（一）瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖是一種天然聚合長(zhǎng)鏈狀分子(線性多糖聚合物)，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。DNA分子在堿性緩沖液中帶負(fù)電荷，在外加電場(chǎng)作用下向正極泳動(dòng)。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同DNA的分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時(shí)的泳動(dòng)率就不同，從而分出不同的區(qū)帶。瓊脂糖凝膠電泳法分離DNA，主要是利用分子篩效應(yīng)，遷移速度與分子量的對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系。因而就可依據(jù)DNA分子的大小使其分離。該過(guò)程可以通過(guò)把分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物和樣品一起進(jìn)行電泳而得到檢測(cè)。（二）用瓊脂糖凝膠電泳分析核酸的影響因素凝膠濃度DNA分子的大小與構(gòu)象電泳緩沖液指示劑：溴酚蘭（bromophenol

blue,Bb)呈藍(lán)紫色；二甲苯腈（xylene

cyanol,Xc)藍(lán)色染色瓊脂糖含（%）DNA片段的有效分離范圍(kb)0.35-600.51-300.61-200.70.8-121.00.5-101.20.4-61.50.2-42.00.1-3分離不同大小DNA片段的合適瓊脂糖凝膠濃度植物總（核）DNA樣品應(yīng)呈現(xiàn)一條遷移率很小的整齊條帶。質(zhì)粒DNA應(yīng)呈現(xiàn)一到三條不同構(gòu)型的條帶，這時(shí)表明所提樣品較純。溴酚藍(lán)前的熒光區(qū)是樣品中存有的RNA雜質(zhì)。若質(zhì)粒DNA樣品在遷移率小的地方還有熒光條帶，表明質(zhì)粒DNA樣品中有細(xì)菌的染色體DNA污染。常用的電泳緩沖液4℃保存?zhèn)溆?二、聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）根據(jù)電泳樣品的電荷、分子大小及形狀的差別分離物質(zhì)。介質(zhì)既具有分子篩效應(yīng)，又具有靜電效應(yīng)，分辨率高于瓊脂糖凝膠電泳。適用于低分子DNA（1~1000bp）、蛋白質(zhì)、寡核苷酸的分離和DNA的序列分析。具有分離只相差一個(gè)核苷酸的不同DNA片段的特性。聚丙烯酰胺凝膠（polyacrylamidegel,PAG）的聚合反應(yīng)單體：丙烯酰胺（Acr）；交聯(lián)劑：甲叉雙丙烯酰胺（Bis）；催化劑：過(guò)硫酸胺或核黃素；加速劑：四甲基乙二胺（TEMED）；產(chǎn)物：三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠。CH2=CHC=ONH2CH2=CHC=ONHCH2NHC=OCH2=CH-CH2-CH-[CH2-CH-]nCH2-CH-C=OC=ONH2NHCH2NHC=O-CH2-CH-[CH2-CH-]nCH2-CH-C=OC=ONHNH2丙烯酰胺N,N’-甲叉雙丙烯酰胺聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝膠的優(yōu)點(diǎn)分辨率高比瓊脂糖凝膠的載樣量大回收的DNA樣品純度極高在聚丙烯酰胺凝膠分子的交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中，帶有酰胺側(cè)鏈的C-C聚合物不帶或少帶離子側(cè)鏈基團(tuán)聚丙烯酰胺凝膠無(wú)色透明，比瓊脂糖凝膠的紫外線吸收低、抗腐蝕性強(qiáng)、機(jī)械強(qiáng)度高、韌性好聚丙烯酰胺凝膠電泳的一般程序緩沖液：TBE；染色：銀染法垂直的圓盤(pán)電泳和板狀電泳制膠點(diǎn)樣電泳染色觀察AFLP的銀染檢測(cè)結(jié)果三、脈沖場(chǎng)凝膠電泳普通瓊脂糖凝膠分離DNA的范圍為0.2-20kb，利用脈沖電泳，可分離高達(dá)107bp的DNA片段。分子量大的DNA分子所需的松弛時(shí)間長(zhǎng)，分子量小的則短。脈沖時(shí)間是一個(gè)人為的固定值，用于向前移動(dòng)的時(shí)間則隨分子量大小而變化。分子量大的用于向前運(yùn)動(dòng)的時(shí)間少，移動(dòng)距離就短，分子量小的用于向前運(yùn)動(dòng)的時(shí)間多，移動(dòng)距離就長(zhǎng)。使不同大小分子量DNA分離的假說(shuō)。脈沖場(chǎng)凝膠電泳原理圖北

南

脈沖場(chǎng)電泳常規(guī)電泳

兩組電極，排列不均勻;一組電極，電場(chǎng)方向不變，電極排列均勻，定時(shí)改變電場(chǎng)方向，DNA分子的凈DNA移動(dòng)方向與電場(chǎng)方向相同。整個(gè)電泳移動(dòng)方向與兩電場(chǎng)呈45o，在電泳過(guò)過(guò)程保持電壓穩(wěn)定。常規(guī)方法制備DNA程中，電壓有時(shí)可隨時(shí)間的增加而樣品增加，制備DNA樣品與常規(guī)方法不同第四節(jié)核酸分子雜交一、探針的制備二、核酸雜交核酸分子雜交的基本原理具有互補(bǔ)序列的兩條核酸單鏈在一定條件下，按堿基配對(duì)原則形成雙鏈的過(guò)程。DNA變性DNA復(fù)性或雜交(hybridization)DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等一、探針的制備探針（probe)：是指經(jīng)放射性或非放射性等物質(zhì)標(biāo)記的已知或特定的DNA或RNA序列。DNA雜交—探針為DNA或RNARNA雜交—探針為DNA或cDNA（一）同位素標(biāo)記探針32P

，3H

，35S

用于核酸標(biāo)記，其中32P和35S使用頻率高。32P標(biāo)記核苷酸的α位或γ位，35S則是標(biāo)記核苷酸的α位.（二）非同位素探針生物素標(biāo)記探針地高辛標(biāo)記探針辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記探針生物素標(biāo)記探針生物素是一種水溶性維生素，可通過(guò)烯丙鍵與嘧啶環(huán)的C5位共價(jià)結(jié)合。生物素標(biāo)記的dUTP(biotin-II-dUTP)可代替dTTP而被合成進(jìn)DNA探針，這種探針能特異的與抗生素蛋白（avidin)結(jié)合。抗生素蛋白上結(jié)合的堿性磷酸酶可使反應(yīng)中的底物產(chǎn)生顏色，從而顯示探針?biāo)谖恢?。GCTTGAGCAGTAACCTG顯色酶Biotin生物素Avidin

生物素結(jié)合蛋白烷烴連接臂生色底物顏色產(chǎn)物生物素標(biāo)記探針dUTP-連接臂-甾醇半抗原digoxigeninDIG抗體-顯色酶交聯(lián)復(fù)合物地高辛標(biāo)記探針Dig-dUTP通過(guò)酶觸反應(yīng)摻入到DNA中去制成探針雜交加抗地高辛-酶的復(fù)合物—加底物—顯色辣根過(guò)氧化物酶（HRP)標(biāo)記探針HRP與帶正電荷的聚乙烯亞胺（polyethyleneimine)交聯(lián)結(jié)合，帶正電荷的復(fù)合物與帶負(fù)電荷的單鏈或雙鏈DNA結(jié)合，在戊二醛烯溶液作用下，HRP與DNA形成共價(jià)鍵，產(chǎn)生