TBWDP 0001-2022 北京市酒莊葡萄酒中生物胺限量及檢測(cè)方法

ICS67.160.10CCSX62T/BWDP0001-2022LimitanddeterminationofbiogenicaminesinBeijingWinerywines2022-10-28發(fā)布北京酒莊葡萄酒發(fā)展促進(jìn)會(huì)發(fā)布1針對(duì)目前北京市酒莊葡萄酒中生物胺含量較低，葡萄酒釀造過(guò)程中生物胺含量監(jiān)測(cè)頻繁，批次多等問(wèn)題，我們提出此標(biāo)準(zhǔn)，與現(xiàn)存的GB5009.208-2016標(biāo)準(zhǔn)相比，縮短了生物胺含量的檢測(cè)時(shí)間，提高了其檢測(cè)限和定量限，滿足了釀酒過(guò)程調(diào)控及生物胺含量測(cè)定的需求。本文件按照GB/T1.1《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件參考GB/T5009.208—2016，主要變化如下：——增加了葡萄酒樣品前處理方法（交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮吸附，凈化樣品，提高檢測(cè)分辨率——修改了液液萃取所用溶劑（用乙酸乙酯代替乙醚，節(jié)省成本并減少有毒有害試劑的使用——修改了檢測(cè)儀器（檢出限從2-5mg/L提高到1.5-4.2μg/L，定量限從5-10mg/L提——修改了流動(dòng)相和洗脫梯度（檢測(cè)時(shí)間從35min縮短到6min）。建立了更加快速、高效的檢測(cè)葡萄酒中生物胺的超高效液相色譜方法，縮短了分析時(shí)間（6min提高了分析靈敏度和準(zhǔn)確度（最低檢測(cè)限為1.5-4.2μg/L，最低定量限為5-14.1本文件所規(guī)定附錄為資料性附錄。請(qǐng)注意本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別這些專利的責(zé)任。本文件由北京酒莊葡萄酒發(fā)展促進(jìn)會(huì)提出并歸口。本文件起草單位：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)、北京酒莊葡萄酒發(fā)展促進(jìn)會(huì)、北京龍熙堡葡萄酒業(yè)有限公司、北京紫霧采邑酒業(yè)有限公司、北京沃德酒莊有限公司、北京萊恩堡葡萄酒業(yè)有限公本文件主要起草人：游義琳、黃衛(wèi)東、戰(zhàn)吉宬、韓冰、周慧、伍天陽(yáng)、謝一丁、李禮、劉雪瑋、郝越、王明飛。本標(biāo)準(zhǔn)于2022年10月28日首次發(fā)布。1北京市酒莊葡萄酒中生物胺限量及檢測(cè)方法本文件規(guī)定了北京市酒莊葡萄酒中色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺和精胺含量的測(cè)定方法和限量標(biāo)準(zhǔn)的要求。本文件適用于北京市酒莊葡萄酒中生物胺的限量控制和測(cè)定方法。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T5009.208-2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中生物胺的測(cè)定GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法。3術(shù)語(yǔ)和定義本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。4限量要求根據(jù)前期對(duì)北京市酒莊葡萄酒中生物胺含量的調(diào)查，規(guī)定限量標(biāo)準(zhǔn)如表1所示（此限量標(biāo)準(zhǔn)的提出僅針對(duì)本標(biāo)準(zhǔn)中的檢測(cè)方法）。表1生物胺限量標(biāo)準(zhǔn)—338——25原理試樣用交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮凈化，丹磺酰氯衍生，乙酸乙酯液液萃取，C18色譜柱分離，超高效液相色譜—紫外檢測(cè)器檢測(cè)或二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)，以保留時(shí)間定性，內(nèi)標(biāo)法定量。6試劑和材料除非另有說(shuō)明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。6.1.1氫氧化鈉（NaOHCAS號(hào)：13106.1.2丹磺酰氯（C12H12ClNO2S純度＞99%，CAS號(hào)：605-65-2。6.1.3乙酸銨（CH3COONH4色譜純，CAS號(hào)：631-61-8。6.1.4碳酸氫鈉（NaHCO3CAS號(hào)：144-55-8。6.1.5乙腈（CH3CN色譜純，CAS號(hào)：75-05-8。6.1.6丙酮（C3H6O色譜純，CAS號(hào)：67-64-1。6.1.7乙酸乙酯（C4H8O2色譜純，CAS號(hào)：141-78-6。6.1.8鹽酸（HCl，37%CAS號(hào)：7647-01-0。6.1.9氨水（H5NO，25-28%CAS號(hào)：1336-21-6。6.2試劑配制6.2.1丹磺酰氯衍生劑溶液：準(zhǔn)確稱取100mg丹磺酰氯（6.1.2以丙酮為溶劑配制濃度為10mg/mL的衍生劑使用液。置4℃冰箱避光儲(chǔ)存，有效期為3個(gè)月。6.2.21mol/L鹽酸溶液：準(zhǔn)確量取8.6mL鹽酸（6.1.8）于100mL容量瓶中，用水定容至刻度。6.2.30.1mol/L鹽酸溶液：準(zhǔn)確量取1mol/L鹽酸溶液（6.2.2）10mL于100mL容量瓶中，用水定容至刻度。6.2.42mol/L氫氧化鈉溶液：稱取8g氫氧化鈉（6.1.1加入100mL水完全溶解。6.2.5飽和碳酸氫鈉溶液：稱取15g碳酸氫鈉（6.1.4加入100mL水溶解，取上清液即為飽和溶液。6.2.60.01mol/L乙酸銨溶液：稱取0.77g乙酸銨（6.1.3）溶解于水中，轉(zhuǎn)移至1000mL容量瓶中，用水定容至刻度。6.3標(biāo)準(zhǔn)品6.3.1色胺（C10H12N2，CAS號(hào)：61-54-1）標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞97%或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。6.3.2β-苯乙胺（C8H11N，CAS號(hào)：64-04-0）標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。6.3.3腐胺（C4H12N2，CAS號(hào)：110-60-1）標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。6.3.4尸胺（C5H14N2，CAS號(hào)：462-94-2）標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞97%或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。6.3.5組胺（C5H9N3，CAS號(hào)：51-45-6）標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞97%或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)3準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。6.3.6酪胺（C8H11NO，CAS號(hào)：51-67-2）標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。6.3.7亞精胺（C7H19N3，CAS號(hào)：124-20-9）標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。6.3.8精胺（C10H26N4，CAS號(hào)：71-44-3）標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。6.3.91,7-二氨基庚烷（C7H18N2，CAS號(hào)：646-19-5）標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。6.4標(biāo)準(zhǔn)溶液配制6.4.1生物胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的配制：分別準(zhǔn)確稱取10mg各種生物胺標(biāo)準(zhǔn)品，置于10mL小燒杯中，用0.1mol/L鹽酸溶液（6.2.3）溶解后轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶中，定容至刻度，混勻，配制成濃度為1000mg/L（以各種生物胺單體計(jì)）的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。置-20℃冰箱儲(chǔ)存，有效期為6個(gè)月。6.4.2生物胺標(biāo)準(zhǔn)混合使用液的配制：分別吸取1.0mL各生物胺單組分標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，置于同一個(gè)10mL容量瓶中，用0.1mol/L鹽酸溶液（6.2.3）稀釋至刻度，混勻，配制成生物胺標(biāo)準(zhǔn)混合使用液（100mg/L）。置-20℃冰箱儲(chǔ)存，有效期為3個(gè)月。6.4.3生物胺標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制：分別吸取0.10mL、0.25mL、0.50mL、1.0mL、1.50mL、2.50mL、5.0mL生物胺標(biāo)準(zhǔn)混合使用液（100mg/L6.4.2置于10mL容量瓶中，用0.1mol/L鹽酸溶液（6.2.3）稀釋至刻度，混勻，使?jié)舛确謩e為1.0mg/L、2.5mg/L、5.0mg/L、10.0mg/L、15.0mg/L、25.0mg/L、50.0mg/L，臨用現(xiàn)配。6.4.4內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的配制：準(zhǔn)確稱取10mg內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品(6.3.9)，置于10mL容量瓶中，用0.1mol/L鹽酸溶液（6.2.3）溶解后稀釋至刻度，混勻，配制成濃度為1000mg/L的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。置-20℃冰箱儲(chǔ)存，有效期為6個(gè)月。6.4.5內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)使用液的配制：吸取1.0mL內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（1000mg/L6.4.4）于10臨用現(xiàn)配。注：標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制濃度以各生物胺單體計(jì)算。所有標(biāo)準(zhǔn)溶液配制好后均需轉(zhuǎn)移至密閉棕色容器中，避光貯存。6.5流動(dòng)相配制6.5.2流動(dòng)相B：0.01mol/L乙酸銨：稱取0.77g乙酸銨（6.1.3）溶解于水中，轉(zhuǎn)移至1000mL容量瓶中，用水定容至刻度。7儀器和設(shè)備7.1超高效液相色譜儀（UPLC配有紫外檢測(cè)器或二極管陣列檢測(cè)器。7.2離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥5000r/min。7.3渦旋振蕩器。7.4水浴裝置。7.5氮吹儀。47.6天平：感量分別為0.01g和0.0001g。7.7超純水器。7.8有機(jī)濾膜針頭濾器：0.22μm。8分析步驟8.1試樣制備準(zhǔn)確量取葡萄酒樣品10mL，加入200μL內(nèi)標(biāo)使用液（100mg/L）(6.4.5)與樣品充分混勻，加入0.3g交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮振蕩提取30min，5000r/min離心10min，濾紙過(guò)濾，上清液待衍生。8.2試樣的衍生準(zhǔn)確量取1.0mL上清液于10mL塑料離心管中，依次加入1.0mL飽和碳酸氫鈉溶液渦旋混勻1min后置于60℃恒溫水浴鍋中衍生45min，取出冷卻至室溫，分別加入100μL氨水（25%6.1.9渦旋混合1min，靜置15min，再加入3mL乙酸乙酯（6.1.7渦旋振蕩2min，靜置分層后，轉(zhuǎn)移上層有機(jī)相（乙酸乙酯層）于10mL離心管中，水相（下層）再萃取一次，合并兩次乙酸乙酯萃取液，40℃水浴下氮吹近干。加入1mL乙腈（6.1.5）振蕩混勻，使殘留物溶解，0.22μm有機(jī)濾膜針頭濾器過(guò)濾，待測(cè)定。8.3標(biāo)準(zhǔn)的衍生：同8.2。8.4超高效液相色譜參考條件進(jìn)樣量10μL，柱溫40℃,流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.01mol/L乙酸銨溶液，流速0.3mL/min。梯度洗脫程序見(jiàn)表1。表2梯度洗脫程序表023468.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作將10μL系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的衍生液分別注入超高效液相色譜儀，測(cè)得目標(biāo)化合物的峰面積，以系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度為橫坐標(biāo)，以目標(biāo)化合物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖見(jiàn)圖A.1。8.6試樣溶液的測(cè)定將試樣的衍生溶液注入超高效液相色譜儀中，測(cè)得峰面積，以保留時(shí)間定性。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測(cè)液中各目標(biāo)化合物的濃度。若試樣溶液中測(cè)定組分濃度超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)5稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍再行測(cè)定。9結(jié)果計(jì)算和表述試樣中生物胺各組分含量按標(biāo)準(zhǔn)曲線法或按公式（1）計(jì)算獲得，計(jì)算結(jié)果應(yīng)扣除空白值，并保留兩位有效數(shù)字。式中：X—試樣中生物胺的含量，單位為毫克每升（mg/L);C—從標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的試樣中溶液生物胺的濃度，單位為毫克每升（mg/L);?—樣品稀釋倍數(shù)。10精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的15%。11檢出限和定量限11.1檢出限色胺2.2μg/L、β-苯乙胺3.1μg/L、腐胺2.8μg/L、尸胺2.3μg/L、組胺4.2μg/L、酪胺1.5μg/L、亞精胺1.5μg/L、精胺2.8μg/L。11.2定量限色胺7.2μg/L、β-苯乙胺10.4μg/L、腐胺9.5μg/L、尸胺7.7μg/L、組胺14.1μg/L、酪胺4.9μg/L、亞精胺5.0μg/L、