第三章亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的分離與鑒定

第一篇組成人體的細(xì)胞第三章亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的分離與鑒定細(xì)胞由各種亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)組成。其重要的研究手段之一是分離純化亞細(xì)胞組分，觀察它們的結(jié)構(gòu)或進(jìn)行生化分析。離心技術(shù)是實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的基本手段。一般認(rèn)為，轉(zhuǎn)速為10～25Kr/min的離心機(jī)稱為高速離心機(jī)；轉(zhuǎn)速超過25Kr/min，離心力大于89Kg者稱為超速離心機(jī)。目前超速離心機(jī)的最高轉(zhuǎn)速可達(dá)100Kr/min，離心力超過500Kg第一節(jié)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分離的技術(shù)分離亞細(xì)胞組分的第一步是制備組織勻漿或細(xì)胞勻漿。勻漿（Homogenization）是在低溫條件下，將組織或細(xì)胞放在勻漿器中加入等滲勻漿介質(zhì)（即0.25moL/L蔗糖一0.003mol/L氯化鈣溶液）研磨，使細(xì)胞被機(jī)械地研碎成為各種亞細(xì)胞組分和包含物的混合物。分離亞細(xì)胞組分的第一步是分級分離。它通過由低速到高速離心技術(shù)，使非均一混合體中的顆粒按其大小輕重分批沉降到離心管的不同部位，再分部收集，即可得到各種亞細(xì)胞組分。由于樣品中各種大小和密度不同的顆粒在離心開始時(shí)是均勻分布于整個(gè)離心管中，故每級分離得到的第一次沉淀必然不是純的最重的顆粒，須經(jīng)反復(fù)懸浮和離心加以純化。分離亞細(xì)胞組分主要離心技術(shù)是差速離心和密度梯度離心。差速離心（differentialcentrifugation）是在密度均一的介質(zhì)中由低速到高速逐級離心，用于分離不同大小的細(xì)胞和細(xì)胞器。在差速離心中細(xì)胞器沉降的順序依次為：細(xì)胞核、線粒體、溶酶體與過氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高爾基體、最后為核糖體。由于各種細(xì)胞器在大小和密度上相互重疊，一般重復(fù)2～3次效果會好一些。通過差速離心可將細(xì)胞器初步分離，但常需進(jìn)一步通過密度梯離心再行分離純化。密度梯度離心（densitygradientcentrifugation）是用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過重力或離心力場的作用使細(xì)胞分層、分離。這類分離又可分為速度沉降和等密度沉降兩種。密度梯度離心常用的介質(zhì)為氯化銫，蔗糖和多聚蔗糖。分離活細(xì)胞的介質(zhì)要求：能產(chǎn)生密度梯度，且密度高時(shí)，粘度不高；pH中性或易調(diào)為中性；濃度大時(shí)滲透壓不大；對細(xì)胞無毒。①速度沉降（velocitysedimentation）主要用于分離密度相近而大小不等的細(xì)胞或細(xì)胞器。這種方法所采用的介質(zhì)密度較低，介質(zhì)的最大密度應(yīng)小于被分離生物顆粒的最小密度。生物顆粒（細(xì)胞或細(xì)器）在十分平緩的密度梯度介質(zhì)中按各自的沉降系數(shù)以不同的速度沉降而達(dá)到分離；②等密度沉降（isopycnicsedimentation）適用于分離密度不等的顆粒。細(xì)胞或細(xì)胞器在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)足夠大離心力和足夠長時(shí)間則沉降或漂浮到與自身密度相等的介質(zhì)處，并停留在那里達(dá)到平衡，從而將不同密度的細(xì)胞或細(xì)胞器分離。等密度沉降通常在較高密度的介質(zhì)中進(jìn)行。介質(zhì)的最高密度應(yīng)大于被分離組分的最大密度。再者，這種方法所需要的力場通常比速度沉降法大10~100倍，故往往需要高速或超速離心，離心時(shí)間也較長。大的離心力、長的離心時(shí)間都對細(xì)胞不利。因此，這種方法適于分離細(xì)胞器，而不太適于分離和純化細(xì)胞。分離亞細(xì)胞組分的第三步是對分級分離得到的組分進(jìn)行分析，以確認(rèn)。常要的分析方法包括形態(tài)和功能鑒定。第二節(jié)細(xì)胞核與線粒體的分級分離一、所需試劑及設(shè)備小白鼠、冰塊、玻璃勻漿器、普通離心機(jī)、臺式高速離心機(jī)、普通天平、光學(xué)顯微鏡、載玻片、蓋玻片、刻度離心管、高速離心管、滴管、10ml量筒、25m1燒杯、玻璃漏斗、解剖剪、鑷子、吸水紙、紗布、蠟盤、平皿、牙簽。0.25moL/L蔗糖一0.003mol/LCaCl2溶液、1%甲苯胺蘭染液、0.02%詹納斯綠B染液、0.9%NaCl溶液。附:溶液的配制：1/300詹納斯綠染液：取詹納斯綠1克，加Riger氏液300ml1/3000中性紅染液：稱取中性紅(Neutralred)O.1g，加蒸餾水300ml。室溫保存.RingerSolution：NaCl0KCl0CaCl20蒸餾水100m10.25mol/L蔗糖一0.003mom/L氯化鈣溶液：蔗糖85.5gCaCl20.33g蒸餾水1000ml二、操作步驟（一）制備肝細(xì)胞勻漿將小白鼠用頸椎脫位法處死，迅速開腹取肝，剪成小塊(去除結(jié)締組織)盡快置于盛有0.9%NaCl的燒杯中，反復(fù)洗滌，除去血污，用濾紙吸去表面的液體。稱取1g肝組織(濕重)放在小平皿中，用量筒量取8ml預(yù)冷的0.25moL/L蔗糖—0.003mol/LCaCl2溶液，先加少量該溶液于平皿中，盡量剪碎肝組織后，再全加入。剪碎的肝組織倒入勻漿管中，使勻漿器下端浸入盛有冰塊的器皿中，左手持之，右手將勻漿搗桿垂直插入管中，上下轉(zhuǎn)動研磨3一5次，用8層紗布(先用蔗糖液濕潤)過濾勻漿于離心管中，然后制備涂片=1\*GB3①，做好標(biāo)記，自然干燥。（二）分級分離與觀察1.細(xì)胞核的分離提取與觀察將裝有濾液的離心管配平后，放入普通離心機(jī)，以2500rpm，離心15min；緩緩取上清液，移入高速離心管中，放在冰塊中，待分離線粒體用；同時(shí)涂一張上清液片=2\*GB3②，做好標(biāo)記，自然干燥；余下的沉淀物進(jìn)行下一步驟。用6m1蔗糖一氯化鈣溶液懸浮沉淀物，以250Orpm離心15min棄上清，將殘留液體用吸管吹打成懸液，滴一滴于干凈的載片上，即涂片=3\*GB3③，自然干燥。將涂片=1\*GB3①=2\*GB3②=3\*GB3③用1%甲苯胺蘭染色后蓋片即可觀察。2.線粒體的分離提取與觀察將上述裝有上清液的高速離心管，從裝有冰塊的燒杯中取出，配平后，以17000rpm離心20min，棄上清，留取沉淀物。加入0.25moL/L蔗糖—0.003mol/L氯化鈣溶液1m1，用吸管吹打成懸液，以17000rpm離心20min，將上清吸入另一試管中，留取沉淀物，加入蔗糖一氯化鈣溶液0.1ml混勻成懸液(可用牙簽)。取上清液和沉淀懸液，分別滴一滴于干凈載玻片上(分別標(biāo)記=4\*GB3④=5\*GB3⑤涂片)，各滴一滴0.02%詹納斯綠B染液蓋上蓋片染色20min。油鏡下觀察，顆粒狀的線粒體被詹納斯綠B染成藍(lán)綠色。第三節(jié)微粒體的分離細(xì)胞通過勻漿破碎時(shí)，細(xì)胞質(zhì)膜碎成片段，這些膜片段的末端融合形成的直徑小于100nm的小泡。來自不同細(xì)胞器（細(xì)胞核、線粒體、質(zhì)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等）的小泡有不同的特性，所以可以將這些小泡相互分離。由內(nèi)膜系統(tǒng)衍生而來的小膜泡形成相似大小的膜泡異質(zhì)性集合體，稱微粒體（microsome）。分離微粒體的方法是利用分級離心方法，去掉細(xì)胞核、線粒體后，經(jīng)超速離心法而制備。具體步驟如下。1.將體重約為300g饑俄20h后的大鼠斷頭，取出肝臟，洗滌，剪碎，加2倍體積的介質(zhì)溶液（含0.15mol/L蔗糖，0.025mol/LKCl，0.1mol/LTris-HClpH7.4,0.005mol/LMgCl2），在玻璃勻漿器中勻漿；2.15000g×10min離心，棄沉淀，取上清；3.100000g×60min離心，棄上清，取沉淀，沉淀即為微粒體；4.將微粒體保存在介質(zhì)溶液中。第四節(jié)溶酶體的分離溶酶體是由一層單位膜包圍，內(nèi)含多種酸性水解酶的泡狀結(jié)構(gòu)。溶酶體含有40多種水解酶，其中包括蛋白酶、核酸降解酶和糖苷酶等。其主要功能是對細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的消化作用。此外溶酶體與器官形成、激素分泌的調(diào)節(jié)以及某些疾病的發(fā)生密切相關(guān)?？刹捎萌缦路椒ǚ蛛x獲得。1.制備蔗糖梯度溶液：取帶有兩個(gè)小杯的梯度混合器，兩個(gè)小杯分別裝入117ml2.1mol/L蔗糖和13ml1.1mol/L的蔗糖；2.將大鼠處死取出腎臟，以1:8（重量/體積）比例加入0.3mol/L蔗糖，然后在玻璃勻漿器中勻漿腎臟組織；3.以150g×10min離心，棄沉淀，取上清液，9000g×3min4.沉淀從上至下依次為白色、黃褐色、暗褐色三種不同顏色層，上層為膜成分的混合物，中層為線粒體部分，最底層則為半純化的溶酶體。先用吸管小心吸掉上層，然后沿管壁加入幾毫升0.3mol/L蔗糖，慢慢搖管使界面層懸浮起來?xiàng)壷?。?.3mol/L蔗糖洗滌1次，底層溶酶體部分懸浮在2.5ml0.3mol/L蔗糖中；5.將2ml懸浮的半純化的溶酶體鋪在蔗糖梯度上面，用玻璃棒攪動最上層的梯度，使梯度和溶酶體之間的界面破壞，然后100000g×150min離心，離心結(jié)果可見：梯度溶液分3條明顯的帶和較少的沉淀。最下層的暗黃色到褐色的帶即為純化的溶酶體。以上所有操作需在0~4℃第五節(jié)細(xì)胞總蛋白質(zhì)的分離提取細(xì)胞器是一種動態(tài)的結(jié)構(gòu)，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞核和高爾基體等，其蛋白質(zhì)組成除了駐留蛋白質(zhì)之外，還包括穿梭蛋白質(zhì)和瞬間相互作用的蛋白質(zhì)。對于這些組成成分的研究，即亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組研究將有助于對這些蛋白質(zhì)做全面的挖掘，從而對細(xì)胞器的功能作深入的闡述。蛋白質(zhì)提取與制備具體操作方法如下：一、材料的選擇早年為了研究的方便，盡量尋找含某種蛋白質(zhì)豐富的器官從中提取蛋白質(zhì)。但目前經(jīng)常遇到的多是含量低的器官或組織且量也很小，如下丘腦、松果體、細(xì)胞膜或內(nèi)膜等原材料，因而對提取要求更復(fù)雜一些。原料的選擇主要依據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?。一般要注意種屬的關(guān)系，事前調(diào)查制備的難易情況。二、蛋白質(zhì)的分離（一）細(xì)胞的破碎細(xì)胞的破碎材料選定通常要進(jìn)行處理。要剔除結(jié)締組織及脂肪組織。如不能立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，則應(yīng)冷凍保存。除了提取細(xì)胞外成分，對細(xì)胞內(nèi)及多細(xì)胞生物組織中的蛋白質(zhì)的分離提取均須先將細(xì)胞破碎，使其充分釋放到溶液中。不同生物體或同一生物體不同的組織，其細(xì)胞破壞難易不一，使用方法也不完全相同。如動物胰、肝、腦組織一般較柔軟，作普通勻漿器磨研即可，肌肉及心組織較韌，需預(yù)先絞碎再制成勻槳。

1.機(jī)械方法主要通過機(jī)械切力的作用使組織細(xì)胞破壞。常用器械有：①高速組織搗碎機(jī)（轉(zhuǎn)速可達(dá)10000rpm，具高速轉(zhuǎn)動的鋒利的刀片），宜用于動物內(nèi)臟組織的破碎；②玻璃勻漿器（用兩個(gè)磨砂面相互摩擦，將細(xì)胞磨碎），適用于少量材料，也可用不銹鋼或硬質(zhì)塑料等。小量的也可用乳缽與適當(dāng)?shù)木彌_劑磨碎提取，也可加氧化鋁、石英砂及玻璃粉磨細(xì)。但在磨細(xì)時(shí)局部往往生熱導(dǎo)致變性或pH顯著變化，尤其用玻璃粉和氧化鋁時(shí)。此外，磨細(xì)劑的吸附也可導(dǎo)致?lián)p失。2.物理方法主要通過各種物理因素的作用，使組織細(xì)胞破碎的方法。①反復(fù)凍融法：于冷藏庫或干冰反復(fù)于零下15～20℃使之凍固，然后緩慢地融解，如此反復(fù)操作，使大部分細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)顆粒破壞。由于滲透壓的變化，使結(jié)合水凍結(jié)產(chǎn)生組織的變性，冰片將細(xì)胞膜破碎，使蛋白質(zhì)可溶化，成為粘稠的濃溶液，但脂蛋白凍結(jié)變性；②冷熱變替法：將材料投入沸水中，于90℃左右維持?jǐn)?shù)min，立即置于冰浴中使之迅速冷卻，絕大部分細(xì)胞被破壞；=3\*GB3③超聲波法：暴露于9～10千兆聲波或10～500千兆超聲波所產(chǎn)生的機(jī)械振動，只要有設(shè)備該法方便且效果也好，但一次處理量較小。應(yīng)用超聲波處理時(shí)應(yīng)注意避免溶液中氣泡的存在。處理一些超聲波敏感的蛋白質(zhì)酶時(shí)宜慎重；=4\*GB3④加壓破碎法：加一定氣壓或水壓也可使細(xì)胞破碎。3.化學(xué)及生物化學(xué)方法這類方法包括①有機(jī)溶媒法：粉碎后的新鮮材料在0℃以下加入5～10倍量的丙酮，迅速攪拌均勻，可破碎細(xì)胞膜，破壞蛋白質(zhì)與脂質(zhì)的結(jié)合。蛋白質(zhì)一般不變性，被脫脂和脫水成為干燥粉末。用少量乙醚洗，經(jīng)濾紙干燥，如脫氫酶等可保存數(shù)月不失去活性；②自溶法：將待破碎的鮮材料在一定pH和適當(dāng)?shù)臏囟认?，利用自身的蛋白酶將?xì)胞破壞，使細(xì)胞內(nèi)含物釋放出來。比較穩(wěn)定，變性較難，蛋白質(zhì)不被分解而可溶化。利用該法可從胰臟制取羧肽酶。自體融解時(shí)需要時(shí)間，需加少量甲苯、氯仿等。應(yīng)防止細(xì)菌污染。于溫室30℃左右較早溶化。自體融解過程中pH顯著變化，隨時(shí)要調(diào)節(jié)pH。自溶溫度選在0～4℃，因自溶時(shí)間較長，不易控制，所以制備活性蛋白質(zhì)時(shí)較少用；=3\*GB3③酶法：與前述的自溶法同理，用胰蛋白酶等蛋白酶除去變性蛋白質(zhì)。但值得提出的是溶菌酶處理時(shí)，它能水解構(gòu)成枯草菌等菌體膜的多糖類。能溶解菌的酶分布很廣。尤其卵白中含量高，而多易結(jié)晶化。1g菌體加1～10mg溶菌酶，pH6.2～7.01h內(nèi)完全溶菌。于生理食鹽水或0.2mol蔗糖溶液中溶菌，雖失去細(xì)胞膜，但原形質(zhì)沒有脫出。除溶菌酶外，蝸牛酶及纖維素酶也常被選為破壞細(xì)菌及植物細(xì)胞用。表面活性劑處理較常用的有十二烷基磺酸鈉、氯化十二烷基吡啶及去氧膽酸鈉等。此外一些細(xì)胞膜較脆弱的細(xì)胞，可把它們置于水或低滲緩沖劑中透析將細(xì)胞脹破。（二）細(xì)胞器蛋白的分離制備某一種生物大分子需要采用細(xì)胞中某一部分的材料，或者為了純化某一特定細(xì)胞器上的生物大分子，防止其他細(xì)胞組分的干擾，細(xì)胞破碎后常將細(xì)胞內(nèi)各組分先行分離，對于制備一些難度較大需求純度較高的生物大分子是有利的。各類生物大分子在細(xì)胞內(nèi)的分布是不同的。DNA幾乎全部集中在細(xì)胞核內(nèi)。RNA則大部分分布于細(xì)胞質(zhì)。各種酶在細(xì)胞內(nèi)分布也有一定位置。因此制備細(xì)胞器上的生物大分子時(shí)，預(yù)先須對整個(gè)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和各類生物大分子在細(xì)胞內(nèi)分布有