DB37T 3005-2017 豬流行性腹瀉病毒分離與RT-PCR檢測技術(shù)

DB37/T3005—2017豬流行性腹瀉病毒分離與IDB37/T3005—2017本標(biāo)準(zhǔn)由山東省畜牧業(yè)專業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草單位：山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：吳家強、陳智、陳蕾、趙鵬偉、郭立輝、于江、李俊、杜以軍、孫文博、叢曉燕、時建立、王金寶。本標(biāo)準(zhǔn)為首次發(fā)布。1DB37/T3005—2017豬流行性腹瀉病毒分離與RT-PCR檢測技術(shù)DMEM:細(xì)胞培養(yǎng)基(Dulbecco'sModifiedEagle'sMedium)。CPE:致細(xì)胞病變效應(yīng)(cellcytopathiceffect)。4.1.8雙抗(100×)(青霉素10000IU/mL,鏈霉素10000μg/mL)。4.1.10Vero細(xì)胞。2DB37/T3005—20174.2RT-PCR檢測需要的儀器與試劑4.2.6超低溫冰箱：可控溫至-70℃。外R5’-AACCCTAAGAGGGGCATAGA-3’,PEDV內(nèi)F5’-GGGCGCCTGTATAGAGTTTA-3’,PEDV內(nèi)R5'-AGACCACCAAGAATGTGTCC-3’。5方法5.1樣品采集5.1.1活體采樣搖一次)。之后加入終濃度為5μg/mL胰酶的維持液(不含血清)。37℃培養(yǎng)3d,其間逐日觀察。傳3DB37/T3005—20175.4.1樣品RNA的提取冰上靜置5min。rpm4℃離心15min。5.4.1.4棄去上清，用1mL預(yù)冷的75%乙醇輕輕沖洗1.5mL離心管，以12000rpm4℃離心5min。5.4.1.5棄去上清，以7500rpm4℃離心5min,吸取殘留液體，在冰盒上靜置5min～15min,使5.5第一鏈cDNA合成將配好的反應(yīng)體系輕輕混勻，如用0ligo(dT)18(0.1μg/μL),42℃孵育30min。如用Random6結(jié)果判定6.1病毒分離檢測4(資料性附錄)試劑的配制無水乙醇A.21%瓊脂糖凝膠瓊脂糖0.5×TAE緩沖液A.3細(xì)胞生長液含10%的胎牛血清和1%雙抗的DMEM。A.4胰酶稱取10mg溶于10mL去離子水中，充分溶解后0.22μm濾器過濾除菌，分裝滅菌的1.5mL離心管，-20℃保存。A.5接種病毒后維持液含1%雙抗的DMEM(不含血清)。5DB37/T3005—2017(規(guī)范性附錄)RT-PCR反應(yīng)體系成分12×TSReactionMix成分2RandomPrimer(N19)(0.1μg/μL)orOligo(dT)18(0.1μg/μL)成分3EasyScriptTMRTEnzymeMix成分4RNA成分5DEPC水成分1成分2ForwardPrimer(10μM)成分32×Tra