第五章-微生物發(fā)酵及工藝控制

第五章微生物發(fā)酵及工藝控制第一節(jié)基本概念第二節(jié)發(fā)酵的基本原理第三節(jié)發(fā)酵過(guò)程及其工藝控制第四節(jié)問(wèn)題分析及處理手段第五節(jié)發(fā)酵過(guò)程參數(shù)的檢測(cè)第六節(jié)發(fā)酵過(guò)程中的新技術(shù)化學(xué)工業(yè)出版社學(xué)習(xí)目標(biāo)了解基本概念、各種發(fā)酵方法、發(fā)酵基本過(guò)程、發(fā)酵過(guò)程中的新技術(shù)、過(guò)程參數(shù)檢測(cè)及其自動(dòng)控制；理解動(dòng)力學(xué)方程，能夠運(yùn)用動(dòng)力學(xué)方程，特別是分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)方程進(jìn)行計(jì)算分析；熟練分析發(fā)酵過(guò)程中的各種影響因素及各有關(guān)問(wèn)題，掌握發(fā)酵工藝控制方法及生產(chǎn)中出現(xiàn)的各種問(wèn)題的處理手段。第一節(jié)基本概念菌體量一般指微生物菌體干重量。生長(zhǎng)期指微生物接種后，經(jīng)短暫遲滯期后，至某種必需營(yíng)養(yǎng)消耗造成生長(zhǎng)限制這一時(shí)期。這一時(shí)期微生物快速生長(zhǎng)，菌體濃度迅速增加。生產(chǎn)期微生物開(kāi)始積累代謝產(chǎn)物的時(shí)期。二次或隱性生長(zhǎng)由于細(xì)胞的自溶作用，一些新的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，諸如細(xì)胞內(nèi)的一些糖類蛋白質(zhì)等被釋放出來(lái)，又作為細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而使活細(xì)胞在穩(wěn)定期又緩慢地生長(zhǎng)，通常稱二次或隱性生長(zhǎng)。生長(zhǎng)相關(guān)型（偶聯(lián)型）它的特點(diǎn)是菌體生長(zhǎng)、碳源利用和產(chǎn)物形成幾乎都在相同的時(shí)間出現(xiàn)高峰，即表現(xiàn)出產(chǎn)物形成直接與碳源利用有關(guān)。這一型中又分為兩種情況，即菌體生長(zhǎng)型和代謝產(chǎn)物型。

其它類型:菌體生長(zhǎng)型、代謝產(chǎn)物型、生長(zhǎng)不相關(guān)型、生長(zhǎng)部分相關(guān)型。臨界比生長(zhǎng)速率在發(fā)酵過(guò)程中，不斷有菌體細(xì)胞的衰老和死亡，也不斷有生物合成酶系的蛻變與失活。為了使死亡的細(xì)胞和失活的酶系不斷得到更新，就必須保持一定的菌體生長(zhǎng)速率。滿足這種更新需要，從而確保產(chǎn)物持續(xù)合成（即保持比生產(chǎn)率穩(wěn)定）的最低比生長(zhǎng)速率稱為臨界比生長(zhǎng)速率，它因菌體細(xì)胞的壽命和酶系的穩(wěn)定性而異。第二節(jié)發(fā)酵的基本原理一、發(fā)酵方法根據(jù)發(fā)酵條件要求不同，微生物發(fā)酵過(guò)程可分為好氧發(fā)酵和厭氧發(fā)酵。好氧發(fā)酵有液體表面培養(yǎng)發(fā)酵、多孔或顆粒固體培養(yǎng)基表面上發(fā)酵和通氧深層發(fā)酵幾種方法。厭氧發(fā)酵采用不通氧的深層發(fā)酵。深層發(fā)酵反應(yīng)在一定徑高比的圓柱形發(fā)酵罐內(nèi)完成。就其操作方式和工藝流程可分為分批式發(fā)酵、流加式發(fā)酵、半連續(xù)發(fā)酵、灌流式發(fā)酵及連續(xù)發(fā)酵等幾種方法。分批式（Batchfermentation）發(fā)酵又稱間歇式(Intermittentfermentation)發(fā)酵或不連續(xù)式(Discontinuousfermentation)發(fā)酵，也稱原位發(fā)酵，是把培養(yǎng)液一次性裝入發(fā)酵罐，滅菌消毒后接入一定量的種子液，在最佳條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間完成菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成積累后，將全部培養(yǎng)物取出，結(jié)束發(fā)酵培養(yǎng)。然后清洗發(fā)酵罐，裝料、滅菌后再進(jìn)行下一輪分批操作。流加式發(fā)酵又稱單一補(bǔ)料分批發(fā)酵（Fed-batchfermentation），是指在分批式操作的基礎(chǔ)上，開(kāi)始時(shí)投入一定量的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，到發(fā)酵過(guò)程適當(dāng)時(shí)期，開(kāi)始連續(xù)補(bǔ)加碳源或（和）氮源或（和）其它必須物質(zhì)，但不取出培養(yǎng)液，直到發(fā)酵終點(diǎn)，產(chǎn)率達(dá)最大化，停止補(bǔ)料，最后將發(fā)酵液一次全部放出?？刂屏骷邮讲僮鞯男问接袃煞N，即反饋控制和無(wú)反饋控制。半連續(xù)式發(fā)酵(Semi-continuousfermentation)又稱反復(fù)分批式或換液式補(bǔ)料發(fā)酵。是指菌體和培養(yǎng)液一起裝入發(fā)酵罐，在菌體生長(zhǎng)過(guò)程中，每隔一定時(shí)間取出部分發(fā)酵培養(yǎng)物（行業(yè)中稱為“帶放”），同時(shí)補(bǔ)充同等數(shù)量的新的培養(yǎng)基，然后繼續(xù)培養(yǎng)，直到發(fā)酵結(jié)束，取出全部發(fā)酵液。與流加式操作相比，半連續(xù)式操作過(guò)程發(fā)酵罐內(nèi)得到培養(yǎng)液總體積保持不變，同樣可起到解除高濃度基質(zhì)和產(chǎn)物對(duì)發(fā)酵的抑制作用。灌流式發(fā)酵（Perfusionfermentation）是指菌體與培養(yǎng)液一起裝入發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)過(guò)程中一方面不斷補(bǔ)充新培養(yǎng)基，同時(shí)取出部分條件培養(yǎng)液，但菌體仍然滯留在發(fā)酵罐內(nèi)。灌流式操作，能及時(shí)除去有害的代謝產(chǎn)物，并補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，滿足了菌體進(jìn)一步生長(zhǎng)的需求。通過(guò)調(diào)節(jié)灌流速度，可把菌體發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程控制在穩(wěn)定的、低廢物水平狀態(tài)下。連續(xù)式發(fā)酵（continuousfermentation）是指菌體與培養(yǎng)液一起裝入發(fā)酵罐，在菌體培養(yǎng)過(guò)程中，不斷補(bǔ)充新培養(yǎng)基，同時(shí)取出包括培養(yǎng)液和菌體在內(nèi)的發(fā)酵液，發(fā)酵體積和菌體濃度等不變，使菌體處于恒定狀態(tài)的發(fā)酵條件，促進(jìn)了菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的積累。連續(xù)操作保持反應(yīng)體積不變，發(fā)酵罐內(nèi)物系的組成將不隨時(shí)間而變。連續(xù)發(fā)酵使用的反應(yīng)器可以是攪拌罐式反應(yīng)器，也可以是管式反應(yīng)器。連續(xù)發(fā)酵的控制方式有兩種：一種為恒濁器（turbidostat）法，即利用濁度來(lái)檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，通過(guò)自控儀表調(diào)節(jié)輸入料液流量，以控制培養(yǎng)液中菌體濃度達(dá)到恒定值；另一為恒化器（chemostat）法，它與前者相似之處是維持一定的體積，不同之處是菌體的密度不是直接控制的，而是通過(guò)恒定輸入的養(yǎng)料中某一種生長(zhǎng)限制基質(zhì)的濃度來(lái)控制。二、發(fā)酵動(dòng)力學(xué)發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究?jī)?nèi)容主要包括：①細(xì)胞生長(zhǎng)和死亡動(dòng)力學(xué)；②基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)；③氧消耗動(dòng)力學(xué)；④CO2生成動(dòng)力學(xué)；⑤產(chǎn)物合成和降解動(dòng)力學(xué)；⑥代謝熱生成動(dòng)力學(xué)。菌體生長(zhǎng)速率在液體培養(yǎng)基中微生物群體生長(zhǎng)，其生長(zhǎng)速率通常用單位體積來(lái)表，指單位體積、單位時(shí)間里生長(zhǎng)的菌體量；在固體培養(yǎng)基表面上的微生物群體生長(zhǎng)，其生長(zhǎng)速率以單位表面積來(lái)表示，指單位時(shí)間、單位表面積上生長(zhǎng)的菌體量。比生長(zhǎng)速率是菌體濃度除菌體的生長(zhǎng)速率，或菌體濃度除菌體的繁殖速率。在平衡條件下，比生長(zhǎng)速率μ基質(zhì)的消耗速率指單位時(shí)間、單位體積發(fā)酵液中消耗的基質(zhì)量，可表示為：

基質(zhì)的消耗速率常以單位體積發(fā)酵液內(nèi)干菌體質(zhì)量表示，稱基質(zhì)的比消耗速率，以Qs表示ms——以基質(zhì)消耗表示的維持代謝系數(shù)（維持因數(shù)），維持（M）是指活細(xì)胞群體在沒(méi)有實(shí)質(zhì)性的生長(zhǎng)（即生長(zhǎng)和死亡處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)）和沒(méi)有胞外代謝產(chǎn)物合成情況下的生命活動(dòng)。所需能量由細(xì)胞物質(zhì)的氧化或降解產(chǎn)生。這種用于“維持”的物質(zhì)代謝稱維持代謝，叫做內(nèi)源代謝（對(duì)好氧發(fā)酵稱“呼吸”），代謝釋放能叫維持能。代謝產(chǎn)物的生成速率指單位體積、單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物的生成量，記為up

。如果產(chǎn)物生成速率以單位體積發(fā)酵液內(nèi)干菌體質(zhì)量為基準(zhǔn)時(shí)，稱產(chǎn)物的比生成速率，記為QP

。當(dāng)以產(chǎn)物CO2記時(shí)，產(chǎn)物的比生成速率常表示為

。好氧微生物發(fā)酵反應(yīng)中生成CO2量相對(duì)于氧的消耗，稱呼吸商（RQ）微生物發(fā)酵動(dòng)力學(xué)微生物分批培養(yǎng)動(dòng)力學(xué)方程

Monod方程在特定溫度、pH值、營(yíng)養(yǎng)物類型、營(yíng)養(yǎng)物濃度等條件下，微生物細(xì)胞的比生長(zhǎng)速率與限制性營(yíng)養(yǎng)物的濃度之間存在如下關(guān)系：KS——限制性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的飽和常數(shù)，g/L。KS的物理意義為當(dāng)比生長(zhǎng)速率為最大比生長(zhǎng)速率一半時(shí)的限制性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度。它的大小表示了微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收親和力大小。KS越大，表示微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收親和力越?。环粗驮酱?。分批培養(yǎng)中基質(zhì)的消耗速率us分批培養(yǎng)中產(chǎn)物的形成速率up產(chǎn)物形成與細(xì)胞生長(zhǎng)部分相關(guān)（混合型）產(chǎn)物形成與細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)（偶聯(lián)型）產(chǎn)物形成與細(xì)胞生長(zhǎng)不相關(guān)（非生長(zhǎng)偶聯(lián)型）第三節(jié)發(fā)酵過(guò)程及其工藝控制發(fā)酵過(guò)程的影響因素溫度

溫度是指發(fā)酵罐中所維持的溫度。溫度影響微生物發(fā)酵化學(xué)反應(yīng)速度；溫度也會(huì)影響發(fā)酵液的物理性質(zhì)，通過(guò)影響粘度、溶解氧量、氧的傳遞速率等間接影響微生物代謝產(chǎn)物合成；溫度也會(huì)改變產(chǎn)物合成方向；溫度對(duì)菌的調(diào)節(jié)機(jī)制亦有關(guān)系。發(fā)酵溫度取決于發(fā)酵過(guò)程中能量變化，一般與內(nèi)在因素有關(guān)。菌體生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中產(chǎn)生的熱是內(nèi)在因素，稱為生物熱，是不可改變。另外，與外在因素（攪拌熱、蒸發(fā)熱、輻射熱及冷卻介質(zhì)移出的熱量有關(guān)。pH值

在發(fā)酵過(guò)程中，培養(yǎng)基的pH值同溫度一樣影響各種酶的活性，進(jìn)而影響產(chǎn)生菌的生長(zhǎng)繁殖及產(chǎn)物的合成。pH值對(duì)微生物生長(zhǎng)影響很明顯，pH值不當(dāng)，將嚴(yán)重影響菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成。不同微生物最適生長(zhǎng)pH值和最適生產(chǎn)pH值不同。發(fā)酵過(guò)程中pH值的變化是各種酸和堿的綜合結(jié)果。一方面是培養(yǎng)基中含有酸性成份（或雜質(zhì)）。糖被菌體吸收利用后，產(chǎn)生有機(jī)酸，并分泌至培養(yǎng)液中。一些生理酸性物質(zhì)（硫酸銨等）被菌體利用后，會(huì)促使氫離子濃度增加，pH值下降。另一方面水解酪蛋白和酵母粉等培養(yǎng)基成份，在其利用后會(huì)產(chǎn)生NH3，造成培養(yǎng)液堿性。一些生理堿性物質(zhì)（硝酸鈉、氨基酸、尿素、氨水等）被菌體利用后，將釋放出游離NH3或生成堿使pH值上升。溶氧量

氧是細(xì)胞呼吸的底物，氧濃度的變化對(duì)細(xì)胞影響很大，也反映了設(shè)備的性能。溶氧量是指溶于培養(yǎng)液中的氧，常用絕對(duì)含量表示，也可用飽和氧濃度的百分?jǐn)?shù)表示。溶解氧對(duì)菌體生長(zhǎng)影響是直接的，適宜的溶解氧量保證菌體內(nèi)的正常氧化還原反應(yīng)。細(xì)胞內(nèi)氧化還原反應(yīng)乃至物質(zhì)之間的轉(zhuǎn)化也需要氧的參與。菌體質(zhì)量及濃度

生產(chǎn)菌種生長(zhǎng)的快慢和產(chǎn)物合成的多少在很大程度上取決于菌體的質(zhì)量及菌體的濃度。在適當(dāng)比生長(zhǎng)速率下，發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)率與菌體濃度成正比關(guān)系。菌濃愈大，產(chǎn)物的產(chǎn)量就越大。但是菌濃過(guò)高，則會(huì)產(chǎn)生其它的影響。如營(yíng)養(yǎng)的物質(zhì)消耗過(guò)快，培養(yǎng)液的營(yíng)養(yǎng)成分發(fā)生明顯的改變，有毒物質(zhì)的積累，就可能改變菌體的代謝途徑，特別是對(duì)培養(yǎng)液中的溶解氧影響更為顯著。為了獲得更高的生產(chǎn)率，需要采用攝氧速率與傳氧速率相等時(shí)的菌體濃度，即臨界菌體濃度。。培養(yǎng)基

培養(yǎng)基的成分對(duì)工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)尤為重要。先進(jìn)的培養(yǎng)基組成對(duì)高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)和經(jīng)濟(jì)發(fā)酵的過(guò)程是關(guān)鍵因素。因?yàn)榕囵B(yǎng)基組成不僅影響微生物的生長(zhǎng)繁殖過(guò)程，也影響產(chǎn)物合成過(guò)程。二氧化碳二氧化碳是微生物在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中的代謝產(chǎn)物，也是合成某些產(chǎn)物的基質(zhì)。通常二氧化碳對(duì)菌體生長(zhǎng)有直接影響。二氧化碳也影響發(fā)酵產(chǎn)物的形成。二氧化碳可能使發(fā)酵液pH下降，進(jìn)而影響細(xì)胞生長(zhǎng)、繁殖及產(chǎn)物合成，二氧化碳可能與其它物質(zhì)及生長(zhǎng)必需的金屬離子發(fā)生化學(xué)反應(yīng)形成碳酸鹽沉淀，或造成氧的過(guò)量消耗使溶解下降，從而間接地影響發(fā)酵產(chǎn)物的合成。加料方式

加料方式有以下三種：一次性加料、一次性投入主料中間補(bǔ)料方式、連續(xù)加料。泡沫

發(fā)酵培養(yǎng)液中存在一定數(shù)量的泡沫是正常的，泡沫的存在可以增加氣-液接觸的面積，增加氧在發(fā)酵液中的傳遞。但如果培養(yǎng)液中長(zhǎng)時(shí)間存在大量的泡沫，則會(huì)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)生極其不利的影響：①降低了發(fā)酵罐的裝料系數(shù)；②影響了菌體的生長(zhǎng)；③增加了染菌的機(jī)會(huì)；④泡沫降低發(fā)酵物產(chǎn)量，大量存在時(shí)，會(huì)從排氣管中排出泡沫，引起“逃液”現(xiàn)象。壓力罐壓是指罐體內(nèi)的壓力，由壓力表讀出。培養(yǎng)基滅菌和發(fā)酵過(guò)程都需要檢測(cè)壓力變化，罐壓的意義在于罐體內(nèi)維持正常壓力防止外界空氣進(jìn)入造成雜菌污染。因此，必須使發(fā)酵系統(tǒng)壓力保持高于外界大氣壓力，罐壓影響CO2和O2的溶解度，增加罐壓，氣體溶解度提高，縮小氣泡體積，可避免“逃液”現(xiàn)象。但過(guò)高壓力影響微生物DNA復(fù)制，使DNA含量下降，從而降低生長(zhǎng)速度，高壓還降低微生物的硫酸鹽還原能力。攪拌

攪拌影響氣體的傳遞速度和發(fā)酵液混合均勻程度。攪拌可以阻止或減少菌絲結(jié)成團(tuán)塊和顆粒，減小菌絲和液體間的擴(kuò)散阻力，利于溶解氧進(jìn)入菌體，同時(shí)盡快排出細(xì)胞代謝產(chǎn)生的廢氣和廢物，有利于細(xì)胞的代謝活動(dòng)。產(chǎn)物濃度產(chǎn)物濃度是指發(fā)酵液中所含目標(biāo)產(chǎn)物的量?？梢杂觅|(zhì)量表示，也可用標(biāo)準(zhǔn)單位表示，如μg/ml和效價(jià)單位u/ml等。產(chǎn)物量的高低反映了發(fā)酵是否正常，并可判斷發(fā)酵周期。產(chǎn)物濃度高，設(shè)備的生產(chǎn)能力大，便于發(fā)酵液的后處理，但過(guò)分提高產(chǎn)物濃度可能會(huì)使設(shè)備生產(chǎn)能力下降（因?yàn)橐娱L(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間），也可能造成對(duì)菌體代謝抑制或阻遏，還可能發(fā)生其它反應(yīng)而降低最終產(chǎn)品收得率，對(duì)后序處理不利。產(chǎn)物濃度過(guò)高有時(shí)也抑制菌體本身生長(zhǎng)，對(duì)發(fā)酵不利。發(fā)酵時(shí)間發(fā)酵時(shí)間是指菌種接入發(fā)酵罐之時(shí)起至發(fā)酵液從罐內(nèi)放出為止的時(shí)間間隔。發(fā)酵時(shí)間盡可能短，還要考慮提高產(chǎn)物收得率，降低物耗率，以提高經(jīng)濟(jì)效益。過(guò)度縮短發(fā)酵時(shí)間，就會(huì)減少產(chǎn)物的產(chǎn)量，另外發(fā)酵液中還殘存較多量糖、氨基酸、消沫油、無(wú)機(jī)鹽離子等對(duì)發(fā)酵液過(guò)濾和產(chǎn)物提取時(shí)的樹(shù)脂交換有影響，增加溶媒萃取中乳化作用等。發(fā)酵過(guò)程工藝控制溫度的控制工業(yè)上發(fā)酵溫度控制，一般通過(guò)自動(dòng)控制或手動(dòng)控制調(diào)節(jié)夾套或蛇管中的換熱介質(zhì)量及溫度的方案來(lái)實(shí)現(xiàn)溫度調(diào)節(jié)。pH值的控制工業(yè)上控制pH值的方法①根據(jù)菌種特性和培養(yǎng)基性質(zhì)，選擇適當(dāng)培養(yǎng)基成份和配比，有些成分可在中間補(bǔ)料時(shí)補(bǔ)充調(diào)節(jié)；②加入適量緩沖溶劑,以控制培養(yǎng)基pH的變化。常用緩沖溶劑有碳酸鈣、磷酸鹽等；③直接加酸加堿進(jìn)行控制；④其它。如采用多加油、糖的辦法,以及適當(dāng)降低空氣流量來(lái)調(diào)節(jié)，以降低pH值；補(bǔ)加酸堿物質(zhì)(尿素等)；提高通氣量加速脂肪酸代謝也可調(diào)節(jié)，以提高pH；采用中空纖維過(guò)濾器進(jìn)行細(xì)胞循環(huán)(過(guò)濾發(fā)酵液,除去酸等)亦可使pH升高。溶氧的控制溶解氧量的調(diào)節(jié)可通過(guò)調(diào)節(jié)通氣量大小及攪拌強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)（空氣流量增大、增加攪拌轉(zhuǎn)速可使供氧量提高，反之下降）。控制發(fā)酵液中菌絲濃度也可調(diào)節(jié)氧的供需情況，通過(guò)控制培養(yǎng)基濃度來(lái)實(shí)現(xiàn)菌絲濃度控制。生產(chǎn)中還可以通過(guò)調(diào)節(jié)罐溫、排去二氧化碳、改善發(fā)酵液的物理性質(zhì)、液化培養(yǎng)基、中間加水、使用表面活性劑等方法來(lái)控制溶氧濃度?？刂蒲a(bǔ)料速率及罐壓及空氣中氧氣含量也可調(diào)節(jié)溶氧量。菌體質(zhì)量與濃度控制工業(yè)上控制菌體濃度是通過(guò)定期測(cè)定發(fā)酵液中菌體的濃度，進(jìn)而采取適當(dāng)手段控制菌體濃度范圍。主要依靠調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的中限制性基質(zhì)的濃度來(lái)控制菌體的比生長(zhǎng)速率，進(jìn)而控制菌體的濃度。還可以利用菌體代謝產(chǎn)生二氧化碳量來(lái)控制補(bǔ)料率和稀釋率，以控制菌體生長(zhǎng)和濃度?？刂平臃N量的大小，也可控制發(fā)酵液中的菌體濃度。對(duì)于補(bǔ)料分批發(fā)酵，可以控制稀釋率的大小，來(lái)控制菌體的濃度。發(fā)酵過(guò)程培養(yǎng)基濃度控制

發(fā)酵過(guò)程培養(yǎng)基濃度可采用補(bǔ)料或補(bǔ)加滅菌水來(lái)加以控制。補(bǔ)加滅菌水除了可以調(diào)節(jié)濃度外，還可降低發(fā)酵液的粘度。另外，也可采用適量速效和遲效碳源、氨源配比來(lái)控制基質(zhì)濃度，以滿足機(jī)體生長(zhǎng)需要及避免速效營(yíng)養(yǎng)物的分解代謝阻遏。控制碳源濃度可采用經(jīng)驗(yàn)方法和動(dòng)力學(xué)方法，在發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)補(bǔ)料控制。為了調(diào)節(jié)發(fā)酵過(guò)程中菌體生長(zhǎng)和防止衰老自溶，通過(guò)補(bǔ)加氮源，控制其濃度。主要方法有：補(bǔ)加具有生長(zhǎng)代謝調(diào)節(jié)作用的有機(jī)氮源，如酵母粉、玉米漿、尿素、氨水及硫酸銨等。發(fā)酵后期，糖利用緩慢，菌體濃度變薄，pH下降，加尿素后改變并提高產(chǎn)量；當(dāng)pH下降，常用氨水調(diào)節(jié)；當(dāng)pH升高時(shí)，可用硫酸銨調(diào)節(jié)。其它無(wú)機(jī)化合物的控制采用補(bǔ)加或一次性加入至培養(yǎng)基中，其濃度要經(jīng)試驗(yàn)進(jìn)行確定。前體濃度控制采用少量多次或連續(xù)流加的方法加入。二氧化碳的控制

生產(chǎn)上一般采取調(diào)節(jié)攪拌速率及通氣量的方法控制調(diào)節(jié)液相中二氧化碳濃度。加料方式的控制補(bǔ)料操作控制系統(tǒng)分為有反饋控制和無(wú)反饋控制兩類。壓力的控制不同生物對(duì)壓力環(huán)境的耐受程度不同，一般維持在0.2～0.5×105pa?？刂乒迚悍椒ㄒ话銥檎{(diào)節(jié)空氣進(jìn)口閥門(mén)或排氣出口閥門(mén)的開(kāi)啟度，變化進(jìn)入或排出氣體的流量，維持工藝所需的壓力。發(fā)酵時(shí)間的控制

放罐時(shí)間有的掌握在菌絲開(kāi)始自溶（一般菌絲自溶前總有些跡象，如氨基氮開(kāi)始升高，pH上升，菌絲碎片增多，過(guò)濾速率降低等）前；有的掌握在部分菌絲自溶后；有的用殘留糖/氮作為放罐標(biāo)準(zhǔn)，以使菌體內(nèi)的殘留產(chǎn)品都全部釋放出來(lái)。生產(chǎn)中如出現(xiàn)異常：如染菌、代謝異常時(shí)，應(yīng)根據(jù)不同情況對(duì)發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行進(jìn)行調(diào)整，一般按正常確定時(shí)間進(jìn)行。放罐前的發(fā)酵控制在接近放罐時(shí)，補(bǔ)糖、補(bǔ)料或加消沫劑都要慎重考慮殘留物質(zhì)對(duì)提煉工序的影響。補(bǔ)糖需根據(jù)后期糖的消耗速率，計(jì)算到放罐時(shí)允許的殘?zhí)橇縼?lái)控制。消沫劑（尤其是消沫油）在不必要時(shí)可早些停止添加。其它，如通氨水、滴加葡萄糖或調(diào)節(jié)pH值等也應(yīng)根據(jù)發(fā)酵具體情況，盡量早些結(jié)束。染菌及其防治、處理1．染菌分析培養(yǎng)液是否污染菌可從三方面進(jìn)行分析：無(wú)菌試驗(yàn)、培養(yǎng)液的顯微鏡檢查、培養(yǎng)液生化指標(biāo)變化情況。無(wú)菌試驗(yàn)是判斷染菌的主要依據(jù)。◆無(wú)菌試驗(yàn)①顯微鏡檢查法（鏡檢法）用革蘭染色法對(duì)樣品進(jìn)行涂片、染色，然后在顯微鏡下觀察微生物的形態(tài)特征，根據(jù)生產(chǎn)菌與雜菌的特征進(jìn)行區(qū)別、判斷是否染菌。如發(fā)現(xiàn)有與生產(chǎn)菌形態(tài)特征不一樣的其它微生物的存在，就可判斷為發(fā)生了染菌。第四節(jié)

問(wèn)題分析及處理手段②肉湯培養(yǎng)法用組成為0.3%牛肉膏、0.5%葡萄糖、0.5%氯化鈉、0.8%蛋白胨、0.4%酚紅溶液（pH=7.2）的葡萄糖酚紅肉湯作為培養(yǎng)基，將待檢樣品直接接入經(jīng)完全滅菌后的肉湯培養(yǎng)基中，分別于37℃、27℃進(jìn)行培養(yǎng)，隨時(shí)觀察微生物的生長(zhǎng)情況，并取樣進(jìn)行鏡檢，判斷是否有雜菌。此法常用于檢查培養(yǎng)基和無(wú)菌空氣是否帶菌，也可用于噬菌體的檢查。③平板劃線培養(yǎng)將待檢樣品在無(wú)菌平板上劃線，分別于37℃、27℃進(jìn)行培養(yǎng)，一般24小時(shí)后即可進(jìn)行鏡檢觀察，檢查是否染菌。為了提高平板培養(yǎng)的靈敏度，也可以將需要檢查的樣品先置于37℃條件下培養(yǎng)6小時(shí)，使雜菌迅速增殖后再劃線培養(yǎng)。④雙碟培養(yǎng)法種子罐和發(fā)酵罐培養(yǎng)基滅菌后就取樣，稱為消后取樣，以后通常種子罐及發(fā)酵罐每隔8小時(shí)取樣一次（？）（必要時(shí)種子罐每隔4小時(shí)取樣一次），種子罐取樣時(shí)在裝有9mL肉湯的試管內(nèi)加入2～5mL試樣，然后在無(wú)菌室內(nèi)通過(guò)無(wú)菌操作在事先鋪好瓊脂培養(yǎng)基的雙碟內(nèi)劃線。剩下的肉湯培養(yǎng)物，在37℃條件下培養(yǎng)6小時(shí)后復(fù)劃一次，即另劃一雙碟以作比較。發(fā)酵取樣時(shí)，用空白試管取樣5～15mL左右，于在37℃條件下培養(yǎng)6小時(shí)后劃碟，雙碟放置在37℃條件下培養(yǎng)，24小時(shí)內(nèi)的雙碟，每隔2～3小時(shí)在燈光下檢查一次，以防生長(zhǎng)緩慢的雜菌漏檢。2．染菌判斷（1）判斷依據(jù)以肉湯和雙碟培養(yǎng)的反應(yīng)為主，鏡檢為輔。每8(4、2)小時(shí)一次的無(wú)菌試驗(yàn)，至少用2只酚紅肉湯及1只雙碟同時(shí)取樣。試驗(yàn)時(shí)，如果肉湯連續(xù)三次發(fā)生變色反應(yīng)或產(chǎn)生混濁，或平板培養(yǎng)連續(xù)三次發(fā)現(xiàn)有異常菌落的出現(xiàn)，即可判斷為染菌。（2）染菌率的統(tǒng)計(jì)染菌罐批次應(yīng)包括染菌重消后的重復(fù)染菌批（次）在內(nèi)。3．染菌情況分析（1）染菌因素①公用系統(tǒng)a.空氣系統(tǒng)水冷式空氣冷卻器穿孔，導(dǎo)致空氣系統(tǒng)進(jìn)水；空氣夾套加熱器穿孔，導(dǎo)致蒸汽進(jìn)入空氣系統(tǒng)，使空氣的相對(duì)濕度在60%以上，導(dǎo)致空氣除菌過(guò)濾器失效。b.蒸汽系統(tǒng)不飽和蒸汽(過(guò)熱蒸汽和低溫過(guò)濕蒸汽)都將影響滅菌效果，尤其是過(guò)熱的干蒸汽，無(wú)法保證空罐滅菌的效果。c.種子系統(tǒng)設(shè)置接種站，將所有種子罐的接種管路都引至接種站。接種時(shí)，無(wú)論哪個(gè)種子罐的種子都將通過(guò)接種站和接種總管移入發(fā)酵罐。.這樣的配置易產(chǎn)生消毒死角，單罐染菌易造成整個(gè)系統(tǒng)污染，使種子罐和發(fā)酵罐的大規(guī)模染菌機(jī)率大為增加。d.補(bǔ)料系統(tǒng)總補(bǔ)料罐染菌造成整個(gè)補(bǔ)料系統(tǒng)和被補(bǔ)料發(fā)酵罐的染菌。e.培養(yǎng)基連消系統(tǒng)連續(xù)滅菌時(shí)管線較長(zhǎng)，連消塔、維持罐和管路內(nèi)壁易發(fā)生結(jié)垢現(xiàn)象。維持罐內(nèi)的存料由于長(zhǎng)期與高溫蒸汽接觸，易變性結(jié)塊，其中蛋白質(zhì)變性會(huì)形成海綿狀物質(zhì)，糖類變性會(huì)產(chǎn)生炭化物，這兩種物質(zhì)都具有很高的比表面積，容易“藏污納垢”，形成死角，導(dǎo)致培養(yǎng)基滅菌不徹底。連消塔混料不勻也會(huì)導(dǎo)致生料進(jìn)入維持罐而造成染菌。連消設(shè)備中的噴淋冷卻蛇管穿孔，導(dǎo)致噴淋冷卻水進(jìn)入已滅菌完畢的培養(yǎng)基中。連消系統(tǒng)的各個(gè)環(huán)節(jié)，例如閥門(mén)、法蘭墊片泄漏，也會(huì)造成打料系統(tǒng)染菌。②設(shè)備滲漏和死角a.閥門(mén)泄漏最常見(jiàn)，例如：種子罐排氣閥泄漏，導(dǎo)致接種時(shí)罐壓“掉壓”造成染菌。維持罐罐底閥滲漏，部分生料未經(jīng)維持而通過(guò)旁通管路進(jìn)入罐中。尤其值得注意的是罐上的冷卻水閥，一旦泄漏不僅會(huì)導(dǎo)致空罐滅菌溫度不夠，還可能由于冷水與蒸汽接觸時(shí)的劇烈撞擊導(dǎo)致冷卻盤(pán)管焊縫處的損壞滲漏。b.罐或空氣管路上監(jiān)控儀表套筒滲漏，導(dǎo)致導(dǎo)熱油流入罐中；減速機(jī)油封滲漏，導(dǎo)致潤(rùn)滑油沿?cái)嚢栎S流入罐中；罐內(nèi)冷卻盤(pán)管穿孔，導(dǎo)致冷卻水滲入罐中。c.設(shè)備存在死角

罐內(nèi)部件如擋板、人梯、攪拌軸拉桿、聯(lián)軸器、冷卻管及支撐件、監(jiān)控儀表套筒焊接處、空氣分布管內(nèi)、罐底閥等處容易存料，形成死角而造成染菌；罐頂部位，由于發(fā)酵過(guò)程中可能發(fā)生的泡沫頂罐，泡沫粘到發(fā)酵罐封頭上的人孔、視鏡口、各種接管口處，若清洗不及時(shí)不徹底，粘料會(huì)變成硬塊，形成死角。

③操作不合理固形物含量多的培養(yǎng)基滅菌不徹底。a.實(shí)罐滅菌罐內(nèi)空氣未排盡，形成“假壓力”，致使實(shí)際滅菌溫度不足；實(shí)罐滅菌升溫階段泡沫頂罐，泡沫中夾帶培養(yǎng)基滅菌不徹底；實(shí)罐滅菌過(guò)程中閥門(mén)調(diào)節(jié)迅速，料液大幅波動(dòng)。b.連續(xù)滅菌操作的致死溫度或維持時(shí)間不足；連續(xù)滅菌過(guò)程中閥門(mén)調(diào)節(jié)過(guò)于迅速，或蒸汽壓力劇烈波動(dòng)，都會(huì)導(dǎo)致維持罐內(nèi)料液發(fā)生返混，使滅菌時(shí)間無(wú)法保證，更嚴(yán)重的是未達(dá)到致死溫度的“生料”進(jìn)入維持罐而導(dǎo)致染菌。c.空罐滅菌閥門(mén)開(kāi)度不合理，造成罐內(nèi)蒸汽流動(dòng)不暢，形成死角。d.空氣除菌過(guò)濾器滅菌不合理，造成滅菌不徹底，造成過(guò)濾器濾芯的損壞，導(dǎo)致有菌空氣進(jìn)入罐中。e.罐的清洗工作不徹底，尤其是染菌罐的處理措施不到位。異常情況的發(fā)生也能導(dǎo)致染菌，比如大范圍的停電，造成空壓機(jī)停止運(yùn)行，空氣系統(tǒng)壓力“掉壓”，不僅導(dǎo)致罐壓“掉0”，嚴(yán)重的還可能發(fā)生料液倒流進(jìn)入空氣系統(tǒng)的現(xiàn)象，污染空氣過(guò)濾器。（2）染菌分析及判斷①染菌規(guī)模個(gè)別罐偶爾染菌應(yīng)重點(diǎn)分析滅菌操作過(guò)程是否合理，種子的無(wú)菌情況，其次要從罐體方面分析，檢查是否有設(shè)備閥門(mén)滲漏及死角現(xiàn)象。個(gè)別罐連續(xù)染菌應(yīng)重點(diǎn)從罐體設(shè)備本身尋找原因：檢查所有與罐直接相連的閥門(mén)是否泄漏，罐內(nèi)是否有滲漏和死角，檢查空氣除菌過(guò)濾器是否損壞失效。種子罐大規(guī)模染菌應(yīng)重點(diǎn)檢查斜面、母瓶的無(wú)菌狀況。發(fā)酵罐大規(guī)模染菌應(yīng)重點(diǎn)從補(bǔ)料系統(tǒng)方面查找原因。種子罐和發(fā)酵罐同時(shí)大規(guī)模染菌，空氣系統(tǒng)出現(xiàn)問(wèn)題的可能性是最大的。②染菌類型

發(fā)酵過(guò)程染菌，多種菌型出現(xiàn)的機(jī)率多，單菌型機(jī)率較少。染的是耐熱芽孢桿菌時(shí)，這與培養(yǎng)基滅菌不徹底或設(shè)備內(nèi)有“死角”關(guān)系甚大。雜菌是不耐熱的球菌或桿菌時(shí)，可從空氣凈化系統(tǒng)、冷卻系統(tǒng)、種子帶菌、設(shè)備滲漏和操作等進(jìn)行追查。染大腸桿菌則懷疑是否有臟水污染，如蛇管穿孔。若污染是真菌，就可能是由于設(shè)備或冷卻盤(pán)管的滲透。③染菌時(shí)間消后培養(yǎng)基就染菌，通常是培養(yǎng)基或設(shè)備滅菌不徹底以及設(shè)備等原因造成的。消后未染菌，接種后開(kāi)始染菌，應(yīng)重點(diǎn)從母瓶狀況和接種操作環(huán)節(jié)方面查找原因。消后和接種都未染菌，發(fā)酵前期開(kāi)始染菌，且雜菌繁殖速度很快，應(yīng)重點(diǎn)從空氣系統(tǒng)查找原因。發(fā)酵中后期染菌，大多是因?yàn)檠a(bǔ)料系統(tǒng)方面的原因，也不排除空氣系統(tǒng)和設(shè)備方面的問(wèn)題。染菌原因復(fù)雜，可能是多種因素迭加而成的，因此對(duì)以上三方面的情況要結(jié)合分析，根據(jù)具體情況和實(shí)際經(jīng)驗(yàn)綜合判斷，絕不能硬搬硬套。

4．防止和制服染菌的方法（1）重視日常工作①觀察水冷式空氣冷卻器的出口溫度和下吹口水量，濕熱季節(jié)應(yīng)加大檢查頻率，發(fā)生穿孔現(xiàn)象能及時(shí)發(fā)現(xiàn)。觀察經(jīng)過(guò)空氣夾套加熱器加熱后的空氣溫度和預(yù)總空氣過(guò)濾器的下吹口排放情況，檢測(cè)各罐分過(guò)濾器的下吹口空氣濕度，保證進(jìn)罐的空氣相對(duì)濕度不高于60%。②空氣除菌過(guò)濾器定期滅菌。應(yīng)保證蒸汽的質(zhì)量，嚴(yán)格按操作規(guī)程操作，避免因溫度過(guò)高、流量過(guò)大或結(jié)束時(shí)的切換操作過(guò)猛而損壞濾芯。③觀察總蒸汽溫度和壓力是否對(duì)應(yīng)，保證所用蒸汽均為飽和蒸汽。如果是過(guò)熱蒸汽，應(yīng)使用蒸汽增濕裝置；如果是過(guò)濕蒸汽，應(yīng)適當(dāng)延長(zhǎng)空消時(shí)間。④定期拆檢連消塔、維持罐，檢查內(nèi)件堅(jiān)固情況、存料及結(jié)垢情況，及時(shí)清理內(nèi)垢。檢查噴淋冷卻管路及物料管路上相關(guān)閥門(mén)的泄漏情況。⑤強(qiáng)化菌種保藏管理，嚴(yán)格執(zhí)行無(wú)菌室管理制度，避免在種子擴(kuò)培、移種過(guò)程中發(fā)生污染。對(duì)菌種培養(yǎng)基和器具進(jìn)行嚴(yán)格的滅菌操作，保證滅菌鍋內(nèi)的空氣排盡，以免形成“假壓力”而導(dǎo)致滅菌不徹底。⑥認(rèn)真做好罐的清理、沖洗工作，清除死角。原則上每批罐放罐并將有害氣體置換完全后，應(yīng)下罐檢查。重點(diǎn)是清理易存料的罐內(nèi)部件如擋板、人梯、攪拌軸拉桿、聯(lián)軸器、冷卻管及支撐件、監(jiān)控儀表套筒焊接處、空氣分布管內(nèi)、罐底閥等；認(rèn)真沖洗罐頂部位的人孔、視鏡口、各種接管口，清除泡沫；檢查冷卻盤(pán)管、監(jiān)控儀表套筒、減速機(jī)軸封的情況，及時(shí)發(fā)現(xiàn)泄漏點(diǎn)。⑦定期進(jìn)行堿水煮罐。用堿水煮罐是最有效的辦法：堿水配制濃度不低于1mol/L，體積加到接近排氣口，蒸汽加熱至90℃以上，微開(kāi)罐底蒸汽閥，全開(kāi)排氣閥，保持堿水在微沸狀態(tài)，煮8小時(shí)以上。如果條件允許，通過(guò)連消系統(tǒng)將堿水打入罐中是更好的選擇。完成后通過(guò)罐底管路用空氣壓入另一個(gè)發(fā)酵罐繼續(xù)煮罐。一般三個(gè)月到半年煮一輪即可。⑧根據(jù)培養(yǎng)基情況選擇正確的滅菌形式。一般來(lái)說(shuō)，淀粉質(zhì)原料在升溫過(guò)快或混合不均勻時(shí)容易結(jié)塊，使團(tuán)塊中心部位“夾生”，蒸汽不易進(jìn)入，在發(fā)酵過(guò)程中這些團(tuán)塊會(huì)散開(kāi)，而造成染菌。同樣由于培養(yǎng)基中諸如麩皮、黃豆餅一類的固形物含量較多，在投料時(shí)濺到罐壁或罐內(nèi)的各種支架上，容易形成堆積，這些堆積物在滅菌過(guò)程中由于傳熱較慢，一些雜菌也不易被殺滅，在后續(xù)過(guò)程中堆積物重新返回至發(fā)酵液中造成染菌。淀粉類培養(yǎng)基的滅菌采用實(shí)罐滅菌較好，一般在升溫前先通過(guò)攪拌混合均勻，并加入一定量的淀粉酶進(jìn)行液化；有大顆粒存在時(shí)應(yīng)先經(jīng)過(guò)篩除去，再進(jìn)行滅菌；對(duì)于麩皮、黃豆餅粉一類的固形物含量較多的培養(yǎng)基，采用罐外預(yù)先配料，再轉(zhuǎn)至發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行實(shí)罐滅菌較為有效。⑨嚴(yán)格按標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行滅菌，合理控制滅菌指標(biāo)在規(guī)定范圍，避免超標(biāo)如：在實(shí)罐滅菌操作的升溫階段，應(yīng)合理控制主消蒸汽閥和排氣閥的開(kāi)度，防止升溫過(guò)快，一方面易發(fā)生泡沫頂罐而逃液；一方面冷空氣可能未完全排盡，使罐內(nèi)溫度與壓力表指示不對(duì)應(yīng)，產(chǎn)生所謂“假壓力”，培養(yǎng)基及罐頂局部空間的溫度達(dá)不到滅菌要求。⑩對(duì)發(fā)酵輔助設(shè)備儀表進(jìn)行定期保養(yǎng)和檢修（2）異常情況處理①對(duì)染菌罐放罐后的處理對(duì)于連續(xù)染菌的罐，除常規(guī)的下罐檢查、清理沖洗外，根據(jù)染菌原因的判斷，應(yīng)拆檢罐上所有閥門(mén)及相關(guān)管路上的閥門(mén)，進(jìn)行打壓試漏，泄漏的立即更換；拆檢相關(guān)設(shè)備，如維持罐、除菌過(guò)濾器等。這些工作完成后，在進(jìn)罐之前，還要進(jìn)行甲醛熏蒸12個(gè)小時(shí)以上。甲醛熏蒸對(duì)于淺表部位和排氣系統(tǒng)的滅菌效果較為明顯，但對(duì)硬垢的滅菌效果不理想，應(yīng)進(jìn)行堿水煮罐。以上工作都應(yīng)制度化、規(guī)范化，及時(shí)記錄，做到有章可尋，有據(jù)可查。②種子培養(yǎng)期染菌的處理對(duì)于已染菌的種子，不能移入發(fā)酵罐，應(yīng)經(jīng)滅菌后棄掉，并對(duì)種子罐及管道等進(jìn)行仔細(xì)檢查和徹底滅菌。同時(shí)采用備用種子，選擇生長(zhǎng)正常無(wú)雜菌的種子接入發(fā)酵罐，繼續(xù)進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)。如無(wú)備用種子，進(jìn)行“倒種”處理，接入新鮮的培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)。③發(fā)酵早期染菌處理如果早期染菌，原則上可適當(dāng)改變生長(zhǎng)參數(shù)，使有利于生產(chǎn)菌而不利于染菌的生長(zhǎng)，如降低發(fā)酵溫度、調(diào)節(jié)pH值、調(diào)整補(bǔ)料量、補(bǔ)加培養(yǎng)基等；加入某些抑制染菌的化合物，條件是這種化合物對(duì)生產(chǎn)菌無(wú)害，對(duì)生產(chǎn)影響不大和在下游精制階段能被完全去除；如培養(yǎng)基中碳、氮含量還比較高時(shí)，終止發(fā)酵，將培養(yǎng)基加熱至規(guī)定溫度，重新進(jìn)行滅菌處理后，再接入種子進(jìn)行發(fā)酵；如果染菌已造成很大危害，培養(yǎng)基中碳、氮源消耗量已比較多，則可放掉部分發(fā)酵液，補(bǔ)充新鮮的培養(yǎng)基，重新進(jìn)行滅菌后，再接種進(jìn)行發(fā)酵。④中后期染菌的處理

a.加入一定量的殺菌劑或抗生素以及正常的發(fā)酵液，以抑制雜菌的生長(zhǎng)，繼續(xù)進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)。如抗生素發(fā)酵，發(fā)酵液中已產(chǎn)生一定濃度的抗生素，對(duì)染菌已有一定抑制作用。b.可降低培養(yǎng)溫度、降低通風(fēng)量、停止攪拌、少量補(bǔ)糖等。c.如果發(fā)酵液中產(chǎn)物濃度已達(dá)一定數(shù)值，則可放罐。對(duì)于沒(méi)有提取價(jià)值的發(fā)酵液，廢棄前應(yīng)加熱至120℃以上，保持30分鐘后才能排放。⑤噬菌體污染的防止及處理

噬菌體可通過(guò)環(huán)境污染、設(shè)備的滲漏或“死角”、空氣凈化系統(tǒng)、培養(yǎng)基滅菌過(guò)程、補(bǔ)料過(guò)程及操作過(guò)程等進(jìn)入發(fā)酵系統(tǒng)而引起染菌。感染噬菌體后，常使發(fā)酵液理化性質(zhì)發(fā)生變化。如氨基酸發(fā)酵過(guò)程中，感染噬菌體后，常使發(fā)酵液的光密度在發(fā)酵初期不上升或回降；pH值逐漸上升，可到8.0以上，氨的利用率停止；鏡檢時(shí)可發(fā)現(xiàn)菌體數(shù)量顯著減少，找不到完整的菌體；CO2排氣量異常，產(chǎn)物含量急劇下降；發(fā)酵液發(fā)紅、發(fā)灰、泡沫很多等。當(dāng)噬菌體危害嚴(yán)重時(shí)，稠厚的發(fā)酵液經(jīng)過(guò)數(shù)小時(shí)后即迅速變稀，泡沫增多，短期內(nèi)大量菌絲自溶，在平板上出現(xiàn)典型的噬菌斑，菌的代謝和產(chǎn)物合成均停滯。防止噬菌體污染是一項(xiàng)系統(tǒng)工程，從培養(yǎng)基的制備、滅菌，種子培養(yǎng)，空氣凈化系統(tǒng)，環(huán)境衛(wèi)生，設(shè)備、管道、車(chē)間布局及職工工作責(zé)任心等諸多方面，分段檢查把關(guān)，才能做到根治噬菌體的危害。生產(chǎn)中一旦污染噬菌體，可采取下列措施a.并罐法利用噬菌體只能在處于生長(zhǎng)繁殖細(xì)胞中增殖的特點(diǎn)，當(dāng)發(fā)現(xiàn)發(fā)酵罐初期污染噬菌體時(shí)，可采用并罐法。即將其它罐批發(fā)酵16～18小時(shí)左右的發(fā)酵液，以等體積混合后分別發(fā)酵，利用其活力旺盛的種子，不進(jìn)行加熱滅菌，亦不需另行補(bǔ)種，便可正常發(fā)酵。但要肯定，并入罐的發(fā)酵液不能染雜菌，否則兩罐都將染菌。b.輪換使用菌種或使用抗性菌株發(fā)現(xiàn)噬菌體后，停止攪拌，小通風(fēng)，降低pH值，立即培養(yǎng)要輪換的菌種或抗性種子，培養(yǎng)好后接入發(fā)酵罐，并補(bǔ)加1/3正常量的玉米漿（不調(diào)pH值）、磷酸鹽和鎂鹽。如pH值仍偏高，不開(kāi)攪拌，適當(dāng)通風(fēng)，至pH值正常，OD值增長(zhǎng)后，再開(kāi)攪拌正常發(fā)酵。c.放罐重消d.罐內(nèi)滅噬菌體法發(fā)現(xiàn)噬菌體后，停止攪拌，小通風(fēng)，降低pH值，間接加熱到70～80℃，并自頂蓋計(jì)量器管道（或接種，加油管）內(nèi)通入蒸汽，自排氣口排出。因噬菌體不耐熱，加熱可殺死發(fā)酵液內(nèi)的噬菌體，通蒸汽殺死發(fā)酵罐及管道內(nèi)的噬菌體。冷卻后，如pH值過(guò)高，停止攪拌，小通風(fēng)，降低pH值，接入2倍量的原菌種，至pH值正常后開(kāi)始攪拌。e.噬菌體污染情況嚴(yán)重，上述方法無(wú)法解決時(shí)，應(yīng)調(diào)換菌種，或停產(chǎn)全面消毒，待空間和環(huán)境中噬菌體密度下降后，再恢復(fù)生產(chǎn)。（3）合理安裝與設(shè)計(jì)①管路的配置和安裝。和無(wú)菌環(huán)境直接接觸的管路同樣也要求無(wú)菌，對(duì)這些管路的配置和安裝有三個(gè)原則：a與蒸汽管路直接或間接相連，可用蒸汽直接消毒;b管路盡量短，彎頭和閥門(mén)盡量少，閥門(mén)與罐體直接相連的短節(jié)在不影響操作的前提下盡量短;c直接與罐體相連的截止閥必須倒裝。②在發(fā)酵罐數(shù)量不大的情況下，建議采用公用接種管路方案，不要采用接種站方式。a發(fā)酵罐的排氣管路建議單獨(dú)配置，避免采用主管匯集的方式，如果通氣量較大，最好一臺(tái)罐的排氣管對(duì)應(yīng)一臺(tái)旋風(fēng)分離器，這樣就徹底避免了因逃液或倒壓引起的各罐串聯(lián)染菌的現(xiàn)象。b接觸無(wú)菌環(huán)境的管路最好使用不銹鋼材質(zhì)，法蘭、彎頭等管件焊接安裝時(shí)，必須采用氬氣保護(hù)焊接方式，避免采用電焊，以保證焊縫的平滑和潔凈，不留死角。c接觸料液的管路，其法蘭墊圈不要用石棉板材質(zhì)的，使用過(guò)程中會(huì)發(fā)生老化分層現(xiàn)象而形成死角，最好選用耐腐蝕且光滑的聚四氟乙烯材質(zhì)。墊片的安裝注意中心對(duì)正，以免凸出部位擋料，而凹入部位存料。發(fā)泡及其控制泡沫產(chǎn)生原因

發(fā)酵過(guò)程中通入大量空氣，并配有機(jī)械攪拌，將氣流粉碎產(chǎn)生大量氣泡。另外，菌體代謝過(guò)程中產(chǎn)生CO2氣體及代謝產(chǎn)物及菌體本身使發(fā)酵液粘度增大，引起泡沫產(chǎn)生。如培養(yǎng)基內(nèi)含有各種餅粉、酵母粉、蛋白胨、玉米漿等發(fā)泡性蛋白質(zhì)極易產(chǎn)生泡沫。泡沫的控制及消除減少泡沫形成的機(jī)會(huì)減少泡沫形成的機(jī)會(huì)是控制泡沫的內(nèi)在內(nèi)素。因此減少泡沫可以從通氣攪拌的劇烈程度、罐壓高低和培養(yǎng)基組成、原材料性質(zhì)等著手。消除已形成的泡沫生產(chǎn)上一般采用機(jī)械法、化學(xué)法和分離回流法進(jìn)行消泡。機(jī)械消泡是靠機(jī)械引起的強(qiáng)烈振動(dòng)或壓力的變化促使氣泡破裂。機(jī)械消泡可分為罐內(nèi)消泡和罐外消泡兩種方法。前者靠罐內(nèi)消泡漿轉(zhuǎn)動(dòng)打碎泡沫；后者是將泡沫引出罐外，通過(guò)噴嘴的加速作用或離心力來(lái)消除泡沫。

消沫劑消沫（化學(xué)消沫）是靠加入表面活性物質(zhì)，降低泡沫的局部表面張力，使泡沫破裂的方法。常用消沫劑主要有天然油脂類，高碳醇、脂肪酸和酯類，聚醚類，硅酮類4大類。其中以天然油脂類和聚醚類最為常用。消沫劑的用法可以一次添加、少次多量與多次少量，效果各不相同。分離回流法是利用特殊分離裝置，將逃逸泡沫中的氣體和料液、菌體分離，經(jīng)過(guò)過(guò)濾除菌的氣體排入大氣，而料液和菌體通過(guò)回流管回流入罐。這種設(shè)備稱為尾氣處理器，它利用逃液和排氣本身的動(dòng)力工作，沒(méi)有動(dòng)力和原料消耗，可有效增加裝料系數(shù)。適用于通氣量大，易產(chǎn)生泡沫的發(fā)酵生產(chǎn)，在需要嚴(yán)禁菌株外逃的場(chǎng)合，如基因工程菌的生產(chǎn)，則必須使用尾氣處理器。發(fā)酵液異常及其處理（1）發(fā)酵液轉(zhuǎn)稀①污染噬菌體，使菌體自溶?？裳a(bǔ)入抗噬菌體的種子液進(jìn)行挽救；②罐溫長(zhǎng)時(shí)間偏高，注意罐溫變化及時(shí)調(diào)整；③泡沫多，大量逃液，加消沫劑無(wú)效，被迫采取間歇停攪拌的方法，就在停攪拌的幾分鐘內(nèi)溶氧迅速下降到零，菌絲窒息死亡，造成菌絲自溶變稀。在剛出現(xiàn)變稀苗頭時(shí)及時(shí)補(bǔ)充氮源可以促進(jìn)繁殖新菌體，使發(fā)酵恢復(fù)正常；有些品種，補(bǔ)入碳源也可防止變稀。補(bǔ)入氮源或碳源后，由于改變了發(fā)酵液表面張力，泡沫上升的情況也有所改善。（2）發(fā)酵液過(guò)濃是發(fā)酵液中氮源過(guò)多，造成菌體濃度大大增加，降低了溶氧濃度，影響發(fā)酵正常進(jìn)行。向發(fā)酵罐內(nèi)補(bǔ)入大量水，除了使菌體濃度稍加稀釋外，還可降低發(fā)酵液粘度。視實(shí)際情況可分批或一次補(bǔ)水，補(bǔ)水量為發(fā)酵液體積5%～30%。（3）糖、氮代謝緩慢原因很多a孢子及種子質(zhì)量不好，培養(yǎng)基消毒不好，培養(yǎng)基中磷酸鹽濃度下降等。這類情況可以補(bǔ)充適量合適的氮源或補(bǔ)充一部分磷酸鹽。如鏈霉素發(fā)酵前期菌絲生長(zhǎng)階段，若磷酸鹽含量過(guò)低，必須立即補(bǔ)入一定量磷酸鹽，以利于生長(zhǎng)，補(bǔ)料過(guò)遲效果就差。b培養(yǎng)中期出現(xiàn)碳/氮緩慢利用時(shí)，補(bǔ)加10～20mg/kg無(wú)機(jī)磷會(huì)有一定效果。c發(fā)酵后期殘?zhí)翘邥r(shí)，可適當(dāng)提高罐溫，利于提高發(fā)酵單位及糖氮利用。有些品種發(fā)酵中，出現(xiàn)糖氮代謝及發(fā)酵單位生長(zhǎng)間歇停頓，影響生產(chǎn)，有時(shí)pH上升，氨水通不進(jìn)，發(fā)酵單位下跌，這往往與菌種的性能有關(guān)。（4）pH不正常由于培養(yǎng)基的滅菌質(zhì)量、原料質(zhì)量和水的pH值及發(fā)酵過(guò)程控制（如空氣流量太大，可以使pH上升；加糖、加油過(guò)多或過(guò)于集中可以引起pH下降等）引起的。當(dāng)pH不正常時(shí)，可以加入酸或堿來(lái)調(diào)節(jié)，也可以加入一些生理酸性或生理堿性物質(zhì)來(lái)調(diào)節(jié)。（5）菌體生長(zhǎng)異常

a種子質(zhì)量差或種子低溫放置時(shí)間長(zhǎng)，導(dǎo)致菌體數(shù)量較少、停滯期延長(zhǎng)、發(fā)酵液內(nèi)菌體數(shù)量增長(zhǎng)緩慢、外形不整齊、菌體濃度偏低；b環(huán)境條件差、培養(yǎng)基質(zhì)量不好、接種量太少等也會(huì)引起菌體生長(zhǎng)差、菌體濃度偏低；c罐溫長(zhǎng)時(shí)間偏高或停止攪拌時(shí)間較長(zhǎng)造成溶氧不足，或培養(yǎng)基滅菌不當(dāng)導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)條件差等影響菌體生長(zhǎng)差；d接種量大或營(yíng)養(yǎng)過(guò)于豐富將使菌體生長(zhǎng)過(guò)于迅速，菌濃過(guò)高。（6）溶解氧水平異常

污染好氧性雜菌，使溶解氧量在很短時(shí)間內(nèi)下降，直至接近零，且在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)不能回升；當(dāng)污染是非好氧性雜菌或噬菌體，使生產(chǎn)菌由于受污染而抑制生長(zhǎng)或造成溶菌，使耗氧量減少，溶解氧量升高；攪拌漿的脫落等也將造成溶解氧的突然下降。

四、其他（1）排氣中CO2異常如污染雜菌，糖耗加快，CO2含量增加；污染噬菌體后，糖耗減慢，CO2含量減少。（2）生產(chǎn)設(shè)備故障如遇罐內(nèi)攪拌葉脫落或軸套松脫無(wú)法運(yùn)轉(zhuǎn)等，可采取緊急措施，將發(fā)酵液壓入另一待放發(fā)酵液的空罐，繼續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)；待放發(fā)酵液的罐可采取空罐不消毒的措施來(lái)接受發(fā)酵液，如措施迅速得當(dāng)，可完全避免損失。此外，還有一些異常發(fā)酵現(xiàn)象，如在青霉素發(fā)酵過(guò)程中有時(shí)會(huì)出現(xiàn)菌絲畸形，長(zhǎng)不稠，不利用糖等現(xiàn)象，產(chǎn)生這種情況的原因沒(méi)有完全搞清楚，有時(shí)可能是多加了前體中毒現(xiàn)象