THBIQA 0003.2-2024 食品中常見高組胺魚源性成分檢測方法 第2部分：日本靖實時熒光PCR法

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T/HBIQAT/HBIQA0003.2—2024食品中常見高組胺魚源性成分檢測方法2PCRDetectionofcommonHistamine-richfishderivedingredientinfoodPart2:ScomberjaponicasReal-timePCRmethod2024-08-15發(fā)布 2024-10-15實施河北省檢驗檢疫學(xué)會發(fā)布T/HBIQA0003.2—2024T/HBIQA0003.2—2024前 言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。T/HBIQA0003-2024《食品中常見高組胺魚源性成分檢測方法實時熒光PCR法系列標(biāo)準(zhǔn)》分為7個部分：1PCR2PCR3PCR4PCR5PCR6PCR法第7部分：藍點馬鮫實時熒光PCR法T/HBIQA0003.2-20242T/HBIQA0003.2—2024T/HBIQA0003.2—2024PAGEPAGE2食品中常見高組胺魚源性成分檢測方法第2部分：日本鯖實時熒光PCR法范圍本部分規(guī)定了食品中日本鯖源性成分的實時熒光PCR檢測方法。本部分適用于食品中日本鯖源性成分的定性檢測。本部分所規(guī)定方法的最低檢出限（LOD）為0.1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。（）GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T27403實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。日本鯖Scomberjaponicas又稱白腹鯖、日本鮐、鮐鲅魚、青花魚，屬于硬骨魚綱(Osteichthyes)、鱸形目(Perciformes)、鯖亞目(Scombroidei)、鯖科(Scombridae)、鯖屬(Scomber)。實時熒光PCR real-time在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號的積累實時監(jiān)控整個PCR擴增過程。Ct值 cyclethresholdvalue每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達到設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)?？s略語下列縮略語適用于本文件。PCR（Polymerasechainreaction）DNA（deoxyribonuleicacid）ATP-6atp6dNTP（deoxyribonucleosidetriphosphate）CTAB（cetyltrithylammoniumbromide）Tris：三羥甲基（tris（hydroxymethyl）aminomethane）EDTA（ethylenediaminetetraaceticacid）FAM（carboxyfluorescein）BHQ11原理實時熒光法是在提取樣品ATP-6性分析。試劑和材料GB/T66821表1引物和探針序列名稱序列（5′-3′）目的基因內(nèi)參照F:TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA真核生物18SrRNA基因R:AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTTP:FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACC-BHQ1日本鯖F:TTGCCCTTGGAGTTCGACTAACATP-6基因R:GCAGCTGTTGCGATTAGTTGAAP:FAM-CCAACCTTACAGCCGGCCACCTTC-BHQ1CTAB裂解液：20g/LCTAB，0.1mol/LTris-HCI（pH8.0），1.4mol/LNaCl，20mmol/LEDTA（pH8.0）。CTAB沉淀液：5g/LCTAB，40mmol/LNaCl。蛋白酶K（20mg/mL），-2075%熒光預(yù)混液（2×）。TE緩沖（Tris-ClEDTA沖液mmol/LTris-HCl mmol/LEDTA(pH8.0)。儀器和設(shè)備儀。12000g。7.5 （0.1μL～2.5μL,1μL～10μL,10μL～100μL，20μL～200μL,100μL～1000μL）pH0.1。0.01g。均質(zhì)器。檢驗步驟樣品前處理魚罐頭、魚腸、魚丸等食品取肉糜300mg，置于三氯甲烷:甲醇:水混合溶液(1:2:0.8)中室溫孵育過夜，去除油脂的肌肉組織可用于核酸提?。霍~肉、魚排、魚糜等魚肉制品取300mg，用生理鹽水清洗后，放入研缽中，在研缽中倒入液氮，將樣品在液氮中研磨成粉末或用冷凍研磨儀研磨成粉末。DNA50mg2mL1.5mL10μLK，10min12000r/min5400μL:12000r/min5，吸取上清液至另一新離心管中，加入0.8倍體積異丙醇，混勻后室溫下靜置1h12000r/min1050μLDNA-20℃DNADNA。DNA取適量DNA溶液原液，使用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計分別測定260nm和280nm處的吸光值A(chǔ)260和A280。DNA的濃度按照公式（1）計算：c=A260×N×50 （1）公式（1）中：c ——DNA（μg/μL）；A260——260nm處的吸光值；N ——當(dāng)A260/A280比值在1.7～2.0之間時，適宜于實時熒光PCR擴增。實時熒光檢測實時熒光反應(yīng)體系實時熒光PCR反應(yīng)參數(shù)見表2。每個樣品各做兩個平行管，可先將反應(yīng)試劑及引物預(yù)混成混合液。表2 實時熒光PCR反應(yīng)體系試劑名稱終濃度反應(yīng)體系/μL熒光PCR預(yù)混液（2×）1×12.5F(10μmol/L)400nmol/L1R(10μmol/L)400nmol/L1P(10μmol/L)400nmol/L1DNA模板(50-100ng/μL)—2.0補水至—25擴增條件℃預(yù)變性30℃15℃35s（），40試驗對照檢驗過程中分別設(shè)陽性對照、陰性對照和空白對照。以日本鯖提取的DNA為陽性對照，以已知不含有日本鯖的樣品提取的DNA為陰性對照，以滅菌水為空白對照。樣品、陽性對照、陰性對照、空白對照各設(shè)置兩個平行。質(zhì)量控制以下條件有一條不滿足時，實驗視為無效：Ct值>40.0。Ct值>40.0。Ct值<30.0Ct值＜30.0。結(jié)果判定在符合第9章的情況下，被檢樣品進行檢測時：a）Ct值≤35.0b）Ct值≥40.0c）35