《紫花苜蓿高通量基因型鑒定分析技術(shù)規(guī)程》征求意見稿

1T/THXCYxxx-xxxx紫花苜蓿高通量基因型鑒定分析技術(shù)規(guī)程本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了紫花苜蓿（MedicagosativaL.）基因型高通量鑒定的主要技術(shù)內(nèi)容，包括紫花苜蓿gDNA提取與檢測、cGPS測序文庫構(gòu)建、生物分析流程等。紫花苜蓿高通量基因型鑒定分析基于紫花苜蓿60K液相芯片開展靶向捕獲測序，能夠?qū)Υ笠?guī)模紫花苜蓿群體開展高效、精準(zhǔn)、低成本地基因型分型檢測，基于分型結(jié)果，可在紫花苜蓿育種或輔助育種中開展應(yīng)用，主要包括群體遺傳主效基因選擇、分子標(biāo)記輔助育種定向改良、全基因組選擇育種、紫花苜蓿品種真實(shí)性鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位和種質(zhì)資源遺傳多樣性評價等。本標(biāo)準(zhǔn)適用于紫花苜蓿高通量基因型鑒定分析。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T30989—2014高通量基因測序技術(shù)規(guī)程GB/T40171—2021磁珠法DNA提取純化試劑盒檢測通則DB32/T3860—2020玉米品種及純度鑒定技術(shù)規(guī)程SNP標(biāo)記法T/JSFT/JSF001—2024美洲黑楊性別苗期鑒定技術(shù)規(guī)程——SSR分子標(biāo)記法3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1基因gene位于染色體上編碼一個特定功能產(chǎn)物（如蛋白質(zhì)或RNA分子）的一段核苷酸序列，是遺傳信息的基本單位。3.2文庫library2T/THXCYxxx-xxxx通過生物來源、人工合成或克隆技術(shù)等得到的重建分子群，如基因組文庫。3.3探針probe能識別特定堿基序列的、經(jīng)過人工標(biāo)記的一小段單鏈核酸分子。3.4高通量基因測序high-throughputgenesequencing區(qū)別于傳統(tǒng)雙脫Sanger測序，高通量測序能夠一次并行對大量核酸片段序列進(jìn)行大規(guī)模平行測定的技術(shù)，通常一次測序反應(yīng)能產(chǎn)出不低于100Mb的測序數(shù)據(jù)。3.5基因型genotype指一個生物體內(nèi)的DNA所包含的基因，也就是說該生物的細(xì)胞內(nèi)所包含的、它所特有的那組基因。3.6引物primer在DNA復(fù)制過程中，結(jié)合于模板鏈上并作為復(fù)制延伸的起始位點(diǎn)和/或終止位點(diǎn)的，具有一定長度和順序的寡核苷酸鏈。3.7DNA聚合酶DNApolymerase以一條DNA鏈作為模板合成一條新的DNA鏈時所需要的酶。3.8DNA連接酶DNAligase在DNA復(fù)制、修復(fù)和重組過程中，由發(fā)揮作用的催化磷酸二酯鍵合成的酶。3.9SNP標(biāo)記SNPmarker是指在基因組上單個核苷酸的變異，形成的遺傳標(biāo)記，其數(shù)量很多，多態(tài)性豐富。3.10液相基因芯片liquid-phasegenechip是通過挑選目標(biāo)區(qū)域多態(tài)性高、缺失率低、分布均勻的標(biāo)記位點(diǎn)信息作為參考設(shè)計(jì)探針，并合成特異性液相芯片，在液相環(huán)境下對目標(biāo)區(qū)域序列的定向捕獲富集和高通量測序。3.11cGPSGenotypingbyPinpointSequencingofliquidcapturedtargets3T/THXCYxxx-xxxx基于優(yōu)化的熱力學(xué)穩(wěn)定性算法模型對目標(biāo)區(qū)間序列進(jìn)行特異性探針設(shè)計(jì)，利用合成的特異性探針對位于不同基因組位置的多個不同目標(biāo)序列進(jìn)行液相雜交捕獲富集，然后對捕獲富集的目標(biāo)區(qū)間進(jìn)行文庫構(gòu)建和二代高通量測序，從而獲得目標(biāo)區(qū)間內(nèi)的所有SNP/InDel標(biāo)記位點(diǎn)的基因型。4儀器與設(shè)備4.1渦旋震蕩器4.2移液器4.3離心機(jī)4.4磁力架4.5高通量自動化核酸提取儀或工作站4.6微量紫外分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀4.7PCR儀4.8熒光定量PCR儀4.9電泳儀4.10凝膠成像系統(tǒng)4.11真空濃縮儀4.12ArrayTape基因分型系統(tǒng)4.13SNPlineSNP分型系統(tǒng)4.14Illumina測序平臺4.15服務(wù)器5測定為保證測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量，在樣品提取、文庫構(gòu)建、雜交捕獲和測序各環(huán)節(jié)均設(shè)置質(zhì)控點(diǎn)，對每一個步驟都進(jìn)行嚴(yán)格質(zhì)控，從根本上確?；蛐头中蛿?shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。5.1樣品DNA提取與質(zhì)控采集待檢測紫花苜蓿材料的新鮮葉片，利用磁珠法從組織中提取gDNA，按照GB/T30989-2014的規(guī)定執(zhí)行。用Qubit熒光定量儀檢測DNA樣品的濃度；用1%瓊脂糖凝膠電4T/THXCYxxx-xxxx泳檢測DNA樣品的完整性，DNA體積≥50μL，濃度≥10ng/μL；OD260/280值=1.8-2.0，OD260/230值≥1.8的樣品用于文庫制備。5.2cGPS文庫構(gòu)建與質(zhì)控a.利用酶切試劑將DNA樣品酶切成100-500bp大小片段后，加入Taq酶進(jìn)行末端修復(fù)，并在3’端加上A堿基，用瓊脂糖凝膠電泳檢測片段大小。b.使用T4連接酶連接測序接頭與DNA片段兩端，利用磁珠對連接產(chǎn)物進(jìn)行純化。純化后的產(chǎn)物用Qubit熒光定量儀檢測濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測片段大小。c.對純化后的連接產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用磁珠對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行片段篩選。片段篩選后的產(chǎn)物用Qubit熒光定量儀檢測濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測片段大小。d.取200ng質(zhì)檢合格的PCR產(chǎn)物構(gòu)建雜交文庫，使用真空濃縮儀對混合文庫進(jìn)行濃縮。之后加入基因組封阻試劑、RNA酶抑制劑（RnaseBlock）與探針液后，50℃孵育16小時-24小時完成雜交反應(yīng)；將磁珠加入到雜交產(chǎn)物中進(jìn)行目標(biāo)區(qū)段捕獲，室溫結(jié)合30min-60min，吸附探針和目的區(qū)間結(jié)合體；使用清洗液清洗捕獲產(chǎn)物，去除非特異性結(jié)合片段；再進(jìn)行一輪PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物使用片段分選磁珠進(jìn)行純化，去除多余引物和引物二聚體，即完成cGPS測序文庫構(gòu)建。5.3上機(jī)測序文庫構(gòu)建完成后，利用Qubit熒光定量儀對文庫濃度進(jìn)行測定，采用Agilent2100/2200Bioanalyzer檢測文庫質(zhì)量，文庫片段大小應(yīng)在250bp-500bp之間。文庫質(zhì)檢合格后，按照測序平臺的標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行上樣及測序。6.生物信息分析基于紫花苜蓿液相芯片捕獲技術(shù)的基因型鑒定分析流程主要分為以下四部分：（1）測序數(shù)據(jù)質(zhì)控：將原始下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾并評估測序質(zhì)量，并進(jìn)行污染檢測；（2）比對及質(zhì)控：將過濾后的測序數(shù)據(jù)比對到參考基因組，并計(jì)算相應(yīng)質(zhì)控指標(biāo)；（3）變異檢測及注釋：檢測單核苷酸變異（SNP）、小片段插入缺失變異（InDel）及注釋；5T/THXCYxxx-xxxx（4）檢測指標(biāo)計(jì)算：根據(jù)變異檢測結(jié)果，統(tǒng)計(jì)樣本水平及位點(diǎn)水平的質(zhì)控指標(biāo)。6.1測序數(shù)據(jù)質(zhì)控6.1.1測序數(shù)據(jù)格式高通量測序得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)堿基識別（BaseCalling）分析轉(zhuǎn)化為測序序列（Reads結(jié)果以FASTQ（簡稱為fq）文件格式存儲，F(xiàn)ASTQ文件的名稱、堿基序列以及其對應(yīng)的測序質(zhì)量信息。6.1.2原始數(shù)據(jù)過濾測序得到的紫花苜蓿原始測序序列（RawReads使用fastp軟件對原始序列進(jìn)行過濾，去除含有接頭污染的Reads和低質(zhì)量的Reads，得到高質(zhì)量的CleanReads，使用CleanReads進(jìn)行后續(xù)分析。6.1.3測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估堿基測序質(zhì)量值反映測序錯誤率，每個堿基的測序錯誤率是通過將測序Phred數(shù)值（Phredscore，Qphred）按照特定公式進(jìn)行轉(zhuǎn)換后計(jì)算得出，而測序質(zhì)量值是在堿基識別過程通過一種預(yù)測堿基判別發(fā)生錯誤概率模型計(jì)算得到。6.1.4測序數(shù)據(jù)堿基含量檢測堿基分布檢查用于檢測有無AT、GC分離現(xiàn)象。理論上G和C堿基及A和T堿基含量每個測序循環(huán)上應(yīng)分別相等，且整個測序過程穩(wěn)定不變，呈水平線。6.1.5測序數(shù)據(jù)污染檢測從每個樣品的fastq文件中隨機(jī)選擇10,000條序列，利用blastn將序列比對到NCBINT數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行污染評估。6.2參考基因組比對6T/THXCYxxx-xxxx利用比對軟件BWA，將過濾后的CleanReads與紫花苜蓿參考基因組（“新疆大葉”或“中苜4號”基因組）進(jìn)行比對，定位CleanReads在參考基因組上的位置，統(tǒng)計(jì)比對結(jié)果。比對率能反映樣本、建庫及測序、紫花苜蓿60K液相基因芯片標(biāo)記序列的質(zhì)量以及測序數(shù)據(jù)與紫花苜蓿參考基因組的相似程度。6.3目標(biāo)位點(diǎn)變異分析基因組變異是指在基因組水平上核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性，包括SNP、InDel等?；贑leanReads參考基因組序列比對結(jié)果，通過突變分析軟件GATK的檢測工具HaplotypeCaller進(jìn)行靶向位點(diǎn)的基因型檢測。利