《高粱屬品種鑒定 InDel分子標(biāo)記法（征求意見稿）》

ICS65.020.10CCSB0532IdentificationofSorghumMoenchusingInDelmarkeIDB32/TXXXX—2024 II 12規(guī)范性引用文件 3術(shù)語和定義 4縮略語 1 26主要儀器設(shè)備及試劑 27溶液配制 28引物相關(guān)信息 29參照品種 210操作程序 211結(jié)果統(tǒng)計(jì) 512結(jié)果判定 5 7 9 DB32/TXXXX—2024本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提出并歸口。本文件起草單位：江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所、貴州省旱糧研究所。本文件主要起草人：鐘小仙、薛文韜、朱莉、高杰、劉智微、陳曉強(qiáng)。1DB32/TXXXX—2024高粱屬品種鑒定InDel分子標(biāo)記法本文件規(guī)定了利用核苷酸插入和缺失序列（InDel：Insert-delete）分子標(biāo)記進(jìn)行高粱屬(SorghumMoench)品種DNA指紋鑒定的試驗(yàn)方法、數(shù)據(jù)采集、結(jié)果記錄及判斷標(biāo)準(zhǔn)。本文件適用于高粱屬酒用、糧用和飼用高粱、甜高粱、蘇丹草、高丹草、擬高粱中的DNA分子數(shù)據(jù)采集和品種鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T3543.2農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程扦樣GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法NY/T2594植物品種鑒定DNA分子標(biāo)記法總則3術(shù)語和定義NY/T2594界定的術(shù)語和定義適用于本文件。4縮略語下列縮略語適用于本文件。bp：basepair，堿基對(duì)。CTAB：cetyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化銨。DNA：deoxyribonucleicacid，脫氧核糖核酸。dNTPs：deoxyribonucleosidetriphosphate，脫氧核糖核苷三磷酸。EDTA：ethylenediaminetetraaceticacid，乙二胺四乙酸。PCR：polymerasechainreaction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。InDel：insertanddelete，插入和缺失序列。SDS：sodiumdodecylsulfate，十二烷基硫酸鈉。Taq酶：Taq-DNApolymerase，耐熱DNA聚合酶。TAE：Tris-acetate-EDTA，三羥甲基氨基甲烷-乙酸-乙二胺四乙酸。Tris：Tris(hydroxymethyl)methylaminomethaneTHAM，三羥甲基氨基甲烷。TE：Tris-EDTA，三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸。TD-PCR：Touch-downPCR，降落PCR。2DB32/TXXXX—20245原理不同高粱屬品種由于遺傳組成不同，在基因組DNA中某InDel位點(diǎn)存在大片段序列差異，這種差異可通過瓊脂糖凝膠電泳或熒光毛細(xì)管電泳檢測(cè)，從而對(duì)不同品種進(jìn)行區(qū)分鑒定。6主要儀器設(shè)備及試劑主要儀器設(shè)備及試劑見附錄A。7溶液配制溶液配制方法見附錄B。8引物相關(guān)信息引物序列及相關(guān)信息見附錄C。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)時(shí)選擇普通引物；利用熒光毛細(xì)管電泳檢測(cè)時(shí)選擇熒光標(biāo)記引物，熒光標(biāo)記位于正向引物5'端，熒光標(biāo)記推薦使用6-FAM，允許配合HEX、TAMRA、ROX其他三色熒光標(biāo)記多重電泳。采集指紋、構(gòu)建數(shù)據(jù)庫時(shí)，一般使用全部引物；品種鑒定時(shí)，允許利用附錄C中的引物序貫檢測(cè)，當(dāng)檢測(cè)到的差異位點(diǎn)數(shù)能判定送檢樣品與參照樣品不同時(shí)，即可停止檢測(cè)。9參照品種參照品種用于輔助確定送檢樣品在某個(gè)位點(diǎn)的等位變異，宜與送檢樣品同時(shí)檢測(cè)。參照品種包括BTx623、Rio、Tx430、紅纓子、江蘇甜高粱地方種（編號(hào)：SS2015）、蘇丹草2098和蘇牧3號(hào)（擬高粱×蘇丹草雜交種），參照品種在以上引物的擴(kuò)增片段中至少有一個(gè)品種與其他不同。參照品種及相關(guān)信息見附錄C。10操作程序10.1樣品準(zhǔn)備送檢樣品可為種子、幼苗及其葉片等新鮮組織或器官。種子樣品需扦樣時(shí)，應(yīng)符合GB/T3543.2的規(guī)定。每份樣品不少于30個(gè)個(gè)體植株或種子，等量混合分析，必要時(shí)進(jìn)行個(gè)體檢測(cè)。10.2DNA提取稱取500mg四葉期幼苗新鮮葉片，用液氮冷凍后迅速磨成粉末；或稱取500mg種子，常溫下研磨成粉末后60目過篩。將幼苗葉片粉末轉(zhuǎn)入2.0mL離心管中，加入700μL65℃預(yù)熱的CTAB提取液后混勻；或稱取100mg過篩種子粉末，加入700μL65℃預(yù)熱的SDS提取液后混勻；二者均再加入10μLRNaseA酶溶液（10mg/mL）。水浴或金屬浴65℃加熱45min，每隔15分鐘顛倒混勻一次。加熱取3DB32/TXXXX—2024出離心管，冷卻至室溫（20-25℃)。室溫通風(fēng)櫥內(nèi)加入700μL的三氯甲烷:異戊醇混合液（24:1劇烈混勻。室溫10000rpm離心10min，取上清液至1.5ml離心管中。加入-20℃預(yù)冷的異丙醇（1倍體積）或無水乙醇（2倍體積）于1.5ml離心管中，輕輕混勻。-20℃靜置1h以上后，室溫12000rpm離心10min，棄上清。75%乙醇漂洗兩次、100%乙醇漂洗一次后，室溫晾干DNA，再加入適量的TE緩沖液溶解于試管中，4℃下保存?zhèn)溆谩NA原液于0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)量。-20℃下保存?zhèn)溆谩Ｗⅲ阂陨蠟橥扑]的DNA提取方法，DNA質(zhì)量能夠滿足PCR擴(kuò)增要求的其他DNA提取方法均適用。DNA溶液的紫外吸光度OD260與OD280的比值宜介于1.7~2.0。10.3PCR擴(kuò)增10.3.1反應(yīng)體系PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的總體積和各組分的終濃度參照表1配制，可以依據(jù)試驗(yàn)條件調(diào)整。表1中的緩沖液若含有Mg2+，不再加MgCl2溶液，加等體積雙蒸水替代。表1PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系--a每一種類的濃度。10.3.2反應(yīng)程序TD-PCR反應(yīng)程序1956372955772725min20s20s5min12cycles30cycles4DB32/TXXXX—2024TD-PCR反應(yīng)程序2956072955472725min20s20s5min12cycles30cycles10.4PCR產(chǎn)物檢測(cè)10.4.1瓊脂糖凝膠電泳制膠稱取4g瓊脂糖于三角瓶中并加入100mL的1×TAE緩沖液，微波爐加熱至沸騰后取出，稍冷卻后加入一定量核酸染料（具體用量視核酸染料類型而定搖勻后倒入水平制膠框，插上制樣梳。電泳將膠板安裝于電泳槽上，在電泳正極槽和負(fù)極槽各加入適量1×TAE緩沖液，使其沒過點(diǎn)樣孔。移液器吸取6-8μLPCR產(chǎn)物和DL2000DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物。除送檢樣品外，還應(yīng)同時(shí)加入?yún)⒄掌贩N擴(kuò)增產(chǎn)物。80V恒壓電泳，電泳時(shí)間參考檸檬黃指示帶移動(dòng)的位置。檸檬黃指示帶在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%瓊脂糖膠電泳的移動(dòng)位置與50bp擴(kuò)增產(chǎn)物泳動(dòng)的位置大致相當(dāng)。通常黃色指示帶到達(dá)膠板底部，電泳結(jié)束。電泳參考時(shí)間分別為1.0h。電泳結(jié)束后關(guān)閉電源，取出膠板。凝膠成像從膠板中取出瓊脂糖凝膠，放置于凝膠成像系統(tǒng)的顯影板上，依據(jù)對(duì)應(yīng)儀器的顯影操作軟件進(jìn)行影像分析，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶圖譜及條帶大小。10.4.2熒光毛細(xì)管電泳PCR產(chǎn)物樣品準(zhǔn)備5DB32/TXXXX—2024吸取帶有6-FAM熒光標(biāo)記引物的擴(kuò)增產(chǎn)物1μL，加入基因分析儀配套電泳板中。板中各孔分別加入0.1μL分子量內(nèi)標(biāo)LIZ1200和8.9μL去離子甲酰胺，在PCR儀上95℃變性3min，取出后立即置于冰上，冷卻10min以上，瞬時(shí)離心10s后備用。等位變異檢測(cè)打開基因分析儀，檢查儀器工作狀態(tài)和試劑狀態(tài)。將裝有樣品的配套電泳板放置于樣品架基座上，打開數(shù)據(jù)收集軟件，按照基因分析儀使用手冊(cè)進(jìn)行操作。基因分析儀自動(dòng)運(yùn)行參數(shù)，并保存電泳原始數(shù)據(jù)文件。10.5數(shù)據(jù)分析10.5.1數(shù)據(jù)讀取每個(gè)InDel位點(diǎn)的等位變異參照擴(kuò)增片段大小命名，見附錄C。對(duì)于瓊脂糖電泳，將送檢樣品在某一位點(diǎn)擴(kuò)增片段的遷移位置與對(duì)應(yīng)的參照品種進(jìn)行比較，確定送檢樣品在該位點(diǎn)的等位變異。對(duì)于熒光毛細(xì)管電泳，通過參照品種消除不同批次間或者不同型號(hào)基因分析儀間可能存在的系統(tǒng)誤差，使用片段分析軟件讀取送檢樣品在該位點(diǎn)的等位變異。純合位點(diǎn)的等位變異數(shù)據(jù)記為X/X，雜合位點(diǎn)的等位變異數(shù)據(jù)記錄為X/Y，其中X、Y分別為該位點(diǎn)上的兩個(gè)等位變異，小片段數(shù)據(jù)在前，大片段數(shù)據(jù)在后。缺失位點(diǎn)的等位變異數(shù)據(jù)記錄為0/0。示例1：樣品在某個(gè)位點(diǎn)上僅出現(xiàn)一個(gè)等位變異，為246bp，則該位點(diǎn)的等位變異數(shù)據(jù)記錄為246/246。示例2：樣品在某個(gè)位點(diǎn)上有兩個(gè)等位變異，分別為246bp、429bp，則該位點(diǎn)的等位變異數(shù)據(jù)記錄為10.5.2數(shù)據(jù)比對(duì)將送檢樣品與參照樣品每個(gè)位點(diǎn)的等位變異數(shù)據(jù)逐一比對(duì)，按照位點(diǎn)相同、差異、數(shù)據(jù)缺失、無法判定等情形，記錄每個(gè)位點(diǎn)的結(jié)果。11結(jié)果統(tǒng)計(jì)統(tǒng)計(jì)比對(duì)結(jié)果為位點(diǎn)差異的情況，計(jì)算差異位點(diǎn)數(shù)。12結(jié)果判定6DB32/TXXXX—2024當(dāng)品種間差異位點(diǎn)數(shù)＞2，判定為“不同”；當(dāng)品種間差異位點(diǎn)數(shù)≤2，判定為“疑同”；當(dāng)品種間差異位點(diǎn)數(shù)≤2，但存在位點(diǎn)數(shù)據(jù)缺失或無法判定情形時(shí)，不作判定。12.2結(jié)果表述差異位點(diǎn)數(shù)為，判定為。當(dāng)存在位點(diǎn)數(shù)據(jù)缺失或無法判定情形時(shí)，表述具體情況。7DB32/TXXXX—2024（規(guī)范性）主要儀器設(shè)備及試劑A.1主要儀器設(shè)備A.1.1PCR擴(kuò)增儀。A.1.2恒壓電泳儀：最高電壓不低于200V，具有恒電壓和恒電流功能。A.1.3水平電泳槽及配套的制膠附件。A.1.4離心機(jī)。A.1.5水平搖床。A.1.6電子天平：感量為0.1g和0.001g。A.1.7微量移液器：規(guī)格分別為10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL，連續(xù)可調(diào)。A.1.8磁力攪拌器。A.1.9核酸濃度測(cè)定儀或超微量紫外分光光度計(jì)。A.1.10微波爐。A.1.11高壓滅菌鍋。A.1.13水浴鍋。A.1.14低溫冰箱。A.1.15制冰機(jī)。A.1.16凝膠成像系統(tǒng)。A.1.17基因分析儀：基于毛細(xì)管電泳，有片段分析功能和數(shù)據(jù)分析軟件，最低區(qū)分力1bp。A.1.18其他相關(guān)儀器和設(shè)備。A.2主要試劑除非另有說明，在分析中均使用分析純?cè)噭.2.1十六烷基三甲基溴化銨（CTAB，C19H42BrN，CAS號(hào)：57-09-0）。A.2.2十二烷基硫酸鈉（SDS，C12H25SO4Na，CAS號(hào)：151-21-3）。A.2.3NP-40：TERGITOL表面活性劑。A.2.4吐溫20（Tween-20，C58H114O26，CAS號(hào)：9005-64-5）。A.2.5三氯甲烷（CHCl3，CAS號(hào)：67-66-3）。A.2.6異戊醇（C5H12O，CAS號(hào)：123-51-3）。A.2.7異丙醇（C3H8O，CAS號(hào)：67-63-0）。A.2.8乙二胺四乙酸二鈉（Na2EDTA·2H2O，C10H14N2Na2O8，CAS號(hào)：139-33-3）。8DB32/TXXXX—2024A.2.9三羥甲基氨基甲烷（Tris，C4H11NO3，CAS號(hào)：77-86-1）。A.2.10濃鹽酸（HCl，CAS號(hào)：7647-01-0）。A.2.11氫氧化鈉（NaOH，CAS號(hào)：1310-73-2）。A.2.1210×PCR緩沖液：含Mg2+25mmol/L。A.2.134種脫氧核糖核苷酸：dATP、dTTP、dGTP、dCTP。A.2.14氯化鈉（NaCl，CAS號(hào)：7647-14-5）。A.2.15TaqDNA聚合酶（Taq酶，CAS號(hào)：9012-90-2）。A.2.16DL2000DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物：DNA片段分布范圍至少在50bp~2000bp。A.2.17甲酰胺（CH3NO，CAS號(hào)：75-12-7）。A.2.18RNaseA酶（核糖核酸酶，CAS號(hào)：9001-99-4）。A.2.19核酸染料：SYBRGreen、SYBRSafe、SYBRGold、GelGreen、GelRed任一種均可。A.2.20乙酸（C2H4O2，CAS號(hào)：16676-96-3）。A.2.21無水乙醇（C2H6O，CAS號(hào)：64-17-5）。A.2.22基因分析儀用丙烯酰胺膠液。A.2.23基因分析儀用分子量內(nèi)標(biāo)Liz1200。A.2.23基因分析儀用電泳緩沖液。A.2.24基因分析儀用光譜校準(zhǔn)基質(zhì)。9DB32/TXXXX—2024（規(guī)范性）溶液配制試劑配制用水需符合標(biāo)準(zhǔn)GB/T6682的要求。B.1DNA提取B.1.10.5mol/LEDTA溶液186.1gNa2EDTA·2H2O溶于800mL水中，加NaOH溶液調(diào)pH至8.0，加水定容至1000mL，121℃高壓滅菌20min。B.1.20.5mol/LHCl溶液25mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為36%~38%濃鹽酸，加水定容至500mL。B.1.31mol/LNaOH溶液40.0gNaOH溶于800mL水中，加水定容至1000mL。B.1.41mol/LTris-HCl溶液121.1gTris堿溶于800mL水中，加HCl調(diào)pH至8.0，加水定容至1000mL，121℃高壓滅菌20min。B.1.5CTAB提取液20.0gCTAB、81.7gNaCl、100mL1mol/LTris-HCl溶液和40mL0.5mol/LEDTA溶液，加水定容至1000mL，121℃高壓滅菌20min，4℃保存。B.1.6SDS提取液5.0gSDS、5mlNP-40、5mlTween-20、10mL1mol/LTris-HCl溶液和10mL0.5mol/LEDTA溶液，加水定容至1000mL，4℃保存。B.1.7TE緩沖液5mL1mol/LTris-HCl溶液和1mL0.5mol/LEDTA溶液，加HCl調(diào)pH至8.0，加水定容至500mL，121℃高壓滅菌20min，4℃保存。B.2PCR擴(kuò)增試劑的配制B.2.1dNTP溶液用TE緩沖液分別配制dATP、dTTP、dCTP、dGTP終濃度為100mmol/L的儲(chǔ)存液。各取20μL混合，加120μLTE緩沖液定容，配制成每種脫氧核糖核苷酸終濃度為10mmol/L的工作液，121℃高壓滅菌20min，-20℃保存。B.2.2InDel引物溶液開蓋前瞬時(shí)離心10s，按照說明書加TE緩沖液，分別配制正向引物和反向引物終濃度為100μmol/L的儲(chǔ)存液。取10μL儲(chǔ)存液，加90μLTE緩沖液配制成終濃度10μmol/L的工作液。B.3電泳DB32/TXXXX—2024B.3.110×TAE緩沖液Tris242g、乙酸57.1mL、Na2EDTA·2H2O37.2g，加水定容至1000mL。B.3.21×TAE緩沖液50mL10×TAE緩沖液，加水定容至500mL。DB32/TXXXX—2024（資料性）引物序列及相關(guān)信息引物名單及序列見表C.1。表C.1引物序列及相關(guān)信息引物編號(hào)引物名稱染色體位置引物序列（5'→3'）參照品種InDel位點(diǎn)多態(tài)性（bp）BTx623RioTx430紅纓子甜高粱地方種a蘇丹草b蘇牧3號(hào)11WS011F:CTCTTGAACACAATTATTGCGTCTTAGTGCR:GCATGGCTGTCTGACTCGACTAATa115021WS021F:CGCAGCAAAGCCAAACGATACTTR:GTGTGGTGGTGTGAGGTTACTCTC241428428428428a42831WS031F:CTCCGGGTTGTGGTAGCTTTR:CACTGCGGAGGATGACCATT778778529529529a77841WS041F:GCTGTGTCCACTCAACGGCTAGR:CACTAATCTATCCATCTAACCACCATTGAC816816816816816b32851WS051F:CATCCTCCTGTGTTCCGTCCR:CTGCTTCGTTTCGGAGGCTA477477477a115362WS061F:TCAAGACATATTGCAGGTTCCTGTTR:TGAGGTCTTCTTTGTTCAAGTTCCA301301259301301a30171WS072F:CGTGAGCGATCATCGGATCAACAAR:ACCTTGGCGTGCCGTGAGAT351296296296296a29681WS082F:TAGTCAGGTGAACAACAGATGGGAACR:CACAAGAAGAGAAATGAATGGACCAAGAAC283496283496496a49691WS092F:AGCATTTGTTCAGCACCTGTCACTAAR:TCTGCTCATGTTCCGGCTAATAACTATACa1321WS102F:CTCCATTGTTGCTCTTCTTCCCTCAAR:AACCCACGGTGGTAAACCTTTGC243243243590590a2431WS112F:GAGTCAAAGGGACACACTTGTTGGTR:CTCCTCTCTTCTTTCCTCCACCTCAA277501277501/a2771WS122F:ACTCCAACTCCGACACCGGCAAR:CATGCAAGTCATTGGACAGGAAGC814814814515515a8141WS133F:AGGATGAGGCGGATTCTTGGR:TCCATAGGCATTCATCGGTC278278355355355a3551WS143F:GAGATGTTAGTTTCTTCCTTGTCCATTGTGR:ATGACTGCTATACAGCCACCCTTCT689418689418689ac418/6891WS153F:CAATATCGTGTCCGTGAACTAGGCR:AGCTCAAAGTGGCTCGTAAGC257529529257529a2571WS163F:TCAACTAACTTGGACGCTTCACCTGR:CGACAGAGCCATGACCACAACC567a195DB32/TXXXX—2024表C.1引物序列及相關(guān)信息(續(xù)1)引物編號(hào)引物名稱染色體定位引物序列（5'→3'）參照品種InDel位點(diǎn)多態(tài)性（bp）BTx623RioTx430紅纓子甜高粱地方種a蘇丹草b蘇牧3號(hào)2WS173F:CCTCAACTGTGAATTGGTGACGGATATR:TCTACGGTCTTCGTGTCTAGCCTTC426a11412WS183F:TAAGCGGGCTCATTTGTACGAGTCTAR:GGAGAAGAAGAAGCGGTGGAGGT959959644959959a9592WS194F:GCTCAATCATGGGCTAACTAGACTCAAR:ATTTGCCTCTAATTTGCGAGACGAATC209a209201WS204F:GGAAGTCCAACAGCCCACCTCTR:ACCTATCGCCTCCCATGACCTTGa158211WS214F:CTTCCATACTCCATACCACGCTTGTR:CTGTTGGGCATTCTTAACGTCATTACC302302302219219a302221WS224F:TCTCGGTCAGAAGCAAGCCTAACTR:CAGTAGGAAGTCATGTCATCAAGTATGTCT539310310310310a539231WS234F:TTGGTCGGAATTGATGAGACGAATCTTR:CCTCCTCCCTACGAGCAGTAGTAAA435435a435241WS244F:AGAATGAAGGTATGCGCTGTGTR:GAGGAGGAGAAGACGACGACAG263486486486486a486252WS255F:AAGCATCTTGATTAAGGACGGAATGGAR:TACATGCCTTGACAACGAACCTAGC406a190261WS265F:CATGATTGATTGACACGGCACATCTCR:GTTCCGCTTGCCATTCAGCATTATGa123271WS275F:TGGTGCAACTCCTCGCATTTCAAR:GACAACTCGCCATAATAATGTGCTGAG264362362264362a264282WS285F:ATTTCGGAAAGCTTACTCAGAGGGATAR:a879291WS295F:CTTGTGGTGACACGGTATCATACTCTTR:GCCTTCCCTCATCCTAACCTCAAC531531531a170301WS305F:TCCTCCCGAATTAGAAGACGAAACAAAGR:CAGTGAGATACCACATTGGAACTTGAGT211247211247247a211311WS316F:TTCTCTAAGCAACTCAGCAAGTCTCTR:CCGTTCCTTTCCATCCATCCATCA500500500500a149321WS326F:TCCTGTCTATGTGGTTGAAGCCTATAAGR:AATGACTGAAAGGCAACACAGAGAAAC491658658658658a658DB32/TXXXX—2024表C.1引物序列及相關(guān)信息(續(xù)2)引物編號(hào)引物名稱染色體定位引物序列（5'→3'）參照品種InDel位點(diǎn)多態(tài)性（bp）BTx623RioTx430紅纓子甜高粱地方種a蘇丹草b蘇牧3號(hào)331WS336F:AACACAAGTGGTTGCCTGATGAAGR:CGGATGAGCGATGGAACGAGTT257257257502502a257341WS346F:CGCACCAGTGTCAGCATGTGR:ACGGGCAAGCAAATCTCAATCC597362362362362a362351WS356F:GAGATGGCAATGCAAGAGTCGGR:CCAGGTCAGCAGTGAAGCAAACa128361WS366F:AGAGGCTGACAACCAGGCAGACR:ATACGTAGACAGCACCGCCATCC498a153371WS377F:GGTGATTGTGCAATGTGCATGATATAGACR:ACCACCGCTACACTCGCCAAA885885885a156381WS387F:AATCAAGCTGCAAATGCTATTGGTTCCR:CCGTGGATAACATAAGAATGGTAAGAGTGA298298485298298a298391WS397F:TCCACTGATGACACCATGCCTTCR:TTCATAATGCAGTTCCGCTCACAAG1005a156401WS407F:GGTGCTCCAGAGTTTCCTCAACAR:CCGACTGGTACGGGTACGAGTA300300300300300a348411WS417F:GTGACACTTTAGCACTTTCGTTTGTR:CGGCAGAAGGAGATCACGATACT396396396335335a335421WS427F:ACGCCCATAGCCTTGTTCTCTCAR:ACAGTTTGGTCGAAATTGACGAGACA225225458225225a225431WS438F:ATTCAGGAGAAATATGTGGGCATGTCAR:TTCTGTCGTTTCTACATCTTGGCTTGA422422a184442WS448F:GCCTCCTCGTGAGTTGAGCACTTR:GGACAACAACGGAATCGGTGGTGa256451WS458F:GCATGGAATCTTAACTCTTAGCTTCTCACR:CAATGGACTGGTTCTCGCTTCGT373373373a373461WS468F:GTTCCTGTGGGATGCTTCCTGACR:GCTCCAATATCTGTACTATTTCCTGACCAA418418418a172471WS478F:TTG