免疫學(xué)診診斷技術(shù)

?體外診斷試劑分類?膠體金技術(shù)簡介?酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)簡介-體外診斷試劑1-1定義kJ體外診斷(IVD,InVitroDiagnosis)試劑,包括可單獨(dú)使用或與儀器、器具、設(shè)備或系統(tǒng)組合使用,在疾病的預(yù)防、診斷、治療監(jiān)測、預(yù)后觀察、健康狀態(tài)評(píng)價(jià)以及遺傳性疾病的預(yù)測過程中,在人體之外通過對(duì)人體的樣本(如血液、體液、組織等)進(jìn)行檢測而獲取臨床診斷倌息的產(chǎn)品和眼勞,包括儀器、試劑、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品等.原理是通過試劑和體內(nèi)物質(zhì)在體外的反應(yīng)強(qiáng)度或速度來判斷體內(nèi)物質(zhì)的性質(zhì)和數(shù)量,通過和標(biāo)準(zhǔn)品的比較來判斷人體的生理狀態(tài)。?臨床生化試劑:用化學(xué)方法使樣本產(chǎn)生變化,通過測吸光度,波長及顏色反應(yīng)等進(jìn)行疾病的診斷、治療和監(jiān)控,發(fā)展最早,最齊全,最大的一個(gè)版塊；?免疫診斷試劑:免疫生物學(xué)發(fā)展很快，利用抗原和抗體的特異性反應(yīng)的原理進(jìn)行疾病的診斷，在診斷試劑盒中品種最多:?分子診斷試劑:應(yīng)用分子生物學(xué)方法檢測患者體內(nèi)週傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)或表達(dá)水平的變化而做出診斷的技術(shù)，稱為分子珍斷。分子診斷的材料包括DNA.RNA和蛋白質(zhì)。PCR產(chǎn)品靈敏度高、特異性強(qiáng)、珍斷窗□期短，可進(jìn)行定性、定量檢測，可廣泛用于肝炎、性病、肺感染性疾病、優(yōu)生優(yōu)育、遺傳病基因、腫瘤等，填補(bǔ)了早期免疫檢測窗口期的檢測空白，為早期診斷、早期治療、安全用血提供了有效的幫助?；蛐酒欠肿由飳W(xué)、微電子、計(jì)算機(jī)等多學(xué)科結(jié)合的結(jié)晶，綜合了多種現(xiàn)代高精尖技術(shù)，被專家曾為診斷行業(yè)的終極產(chǎn)品#但其成本離、開發(fā)難度大，目前產(chǎn)品種類很少，只用于科研和藥物篩選等用途。illIIIIIIIIIIIIIII?功能檢測試劑:血凝試劑f看凝血狀態(tài)是否正常，常用于手術(shù)前或治療心肌梗塞,血栓等，凝血時(shí)間縮短常見于血栓性疾病:如心肌梗死，不穩(wěn)定型心絞痛、腦血管病變、糖尿病伴血管病變、肺梗死、深靜脈血栓形成、妊娠高血壓綜合征和腎病綜合征等;凝血時(shí)間延長見于先天性凝血因子缺乏:如咅型血友病等。?其他:細(xì)胞染色切片，鏡像等免疫學(xué)診斷試劑的類型及應(yīng)用?按方法分為間接免疫學(xué)試劑（如:protein-A不是很特異，易出假陽性）和直接免疫學(xué)試劑（如雙抗體夾心法，雙抗原夾心法，競爭法等）；?按示蹤劑分為放射免疫法，酶聯(lián)免疫法t熒光法，化學(xué)發(fā)光法，膠體金法，乳膠法等；?按照檢測物分為:傳染性疾病、激素、內(nèi)分泌、腫瘤、藥物檢測、血型鑒定等等。二膠體金技術(shù)簡介____S免疫層析膠體金技術(shù)是出現(xiàn)于20世紀(jì)80年代初期的一種獨(dú)特的免疫分析方式,該方法的核心技術(shù)是以條狀纖維居析材料為固相,通過毛細(xì)管作用使樣品溶液在層析材料上泳動(dòng),并同時(shí)使樣品中經(jīng)標(biāo)記物標(biāo)記的待測物與包被在層析材料上針對(duì)待測物的受體（如抗原或抗體）發(fā)生高特異、高親和性的免疫。量取超純水,加熱至沸騰,并保持微沸。加入15ml1%擰檬酸三鈉溶液,繼續(xù)煮沸5分鐘。加入1%的氯金酸繼續(xù)煮沸,待顏色有變化后計(jì)時(shí),煮沸l(wèi)Omin.停止攪拌,冷卻至室溫。GoodFig^ire2-qiuli^-p,ldpnrticries?BadgodWCfh^pM劣質(zhì)金外形不均一,且非球形,有凝集現(xiàn)象,顆粒間變異系數(shù)較大膠體金顆粒帶電情況基礎(chǔ)金核雙離子內(nèi)層負(fù)離子（AuC12—）外層離子層H+分散在膠體間的溶液中Zeta電位（又叫電動(dòng)電位或電動(dòng)電勢,是表征膠體分散系穩(wěn)定性的重要指標(biāo)）可以使膠體金顆粒之間相互排斥,以維持膠體金的穩(wěn)定狀態(tài)。膠體金粒徑(nm)1%擰棟酸三鈉加入雖(ml)膠體金特性呈色Amax162橙色518nm24.51.5橙紅522nm401紅色525nm71.50.7紫紅535nmDifferentsizesofcolloidalgoldparticles16ibw15Grm粒子大小不同,光吸收性不同,顏色亦不同。根據(jù)這一特點(diǎn),可用肉眼觀察膠體金的顏色或吸收峰波長大小可粗略估計(jì)金顆粒的大小。1%擰檬酸二鈉ml0.300.450.701.001.502.00金溶膠顏色藍(lán)灰紫灰紫紅紅橙紅橙吸收峰(nm)220240535525522518徑粒(nm)14797.571.54024.

5152膠體金標(biāo)記技術(shù)的相關(guān)定義*免疫膠體金技術(shù)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種免疫標(biāo)記技術(shù)。*膠體金標(biāo)記膠體金標(biāo)記,實(shí)質(zhì)上是蛋白質(zhì)等髙分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。吸附機(jī)理一般認(rèn)為是膠體金顆粒表面負(fù)電荷,與蛋白質(zhì)的正電荷基團(tuán)因靜電吸附而形成牢固結(jié)合。用還原法可以方便地從氯金酸制備各種不同粒徑、也就是不同顏色的膠體金顆粒。這種球形的粒子對(duì)蛋白質(zhì)有很強(qiáng)的吸附功能,可以與葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、等非共價(jià)結(jié)合,免疫金標(biāo)記技術(shù)主要利用了金顆粒具有髙電子密度的特性,因而在基礎(chǔ)研宄和臨床實(shí)驗(yàn)中成為非常有用的工具,膠體金顆粒對(duì)蛋白質(zhì)有很強(qiáng)的吸附功能,而不被壞其生物活性,可以與蛋白質(zhì)等（葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白）等非共價(jià)結(jié)合,形成膠體金標(biāo)記物。色氨繁TryptophanQUeSH(a}charge(b)hydrophobic膠體金與蛋白質(zhì)的結(jié)合成功與否,取決于pH值,一般只有在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)(PI)略偏堿的條件下二者才能牢固地結(jié)合,因此,標(biāo)記之前須將膠體金溶液的pH值調(diào)至待標(biāo)記蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)略偏堿。需要提高膠體金的pH值時(shí)可用0.2molK2C03,需要降低膠體金的pH值時(shí)可用0.1NHC1。測定金溶液的pH可能損害pH測定計(jì)的探頭,因此,一般用精密的pH試紙測定其pH即可.附表:常用幾種蛋白質(zhì)標(biāo)記時(shí)膠體金所用的pH值過氧化術(shù)Kao蛋白質(zhì)pH類卵帖蛋白4.6抗體（Y球蛋白）9.0缸漿俐蘭萑白7.0親合恩析的IgG7.6n-I&球S白6.E單克逄犰灃8.2+牛血迫白S白6.5F(ab,

)j7.2半血演白3白半氣球白罷白結(jié)合肽5,515SPA（葡萄球苗蛋白）6.0蔥麻子ft物鐋血親I愛麻子植物凝血索Jf花生凝患素e.o6,3牛A嘀SS白結(jié)舍咦島泰5.3靈亂繭素6.9破傷區(qū)毒柰6.9□NA蚌c6.0AWjJcpantaijalectisi7.4RWse9.0大豆凝糶柰6,1舨?度脂孟白5.5L^nsQsiinai'isJectw5.9a：_巨球雖白6.0LotusTetragonalobuclectin6.3執(zhí)生物柰繭S（親合累n10.0荊豆礙集賽6.3漣晷抗生物李蛋白6.6SsndfSraeisIfciin6.2羑呸凝生童9.9&體金的注意事項(xiàng)制備髙（1）玻璃器皿必須徹底清洗,最好是經(jīng)過硅化處理的玻璃器皿,或用第一次配制的膠體金穩(wěn)定的玻璃器皿,再用雙餾水沖洗后使用。否則影響生物大分子與金顆粒結(jié)合和活化后金顆粒的穩(wěn)定性,不能獲得預(yù)期大小的金顆粒。（2）試劑配制必須保持嚴(yán)格的純凈,所有試劑都必須使用雙餾水或三餾水并去離子后配制,或者在臨用前將配好的試剤經(jīng)超濾或微孔濾膜（0.45Pm）過濾,以除去其中的聚合物和其它可能混入的雜質(zhì),（3）配制膠體金溶液的pH以中性（pH7.2）較好。（4）氯金酸的質(zhì)量要求上乘,雜質(zhì)少。最好是進(jìn)口的。3.1快速免疫金滲濾法種類及優(yōu)點(diǎn)即穿流式的固相膜免疫測定。主要由兩部分組成:膜滲濾裝置和標(biāo)記結(jié)合物。前者為一塑料小盒,其中填滿吸水性物質(zhì),面上緊貼放置一片吸附有抗體（以雙抗體夾心法測抗原為例）的硝酸纖維膜,標(biāo)記結(jié)合物為免疫金。用微孔濾膜作載體,先將抗原或抗體點(diǎn)于膜上,封閉后加待檢樣本,洗滌后用膠體金標(biāo)記的抗體檢測相應(yīng)的抗原或抗體。橾怍小總閣裝賞分解示意圖^7蓋微孔脫吸水材料雙抗體夾心法測抗原AW■BTv操作A；加樣,加金標(biāo)記物；操作B洗滌,觀察3.2免疫層析法是繼IGFA之后發(fā)展起來的另一種固相膜免疫測定,與IGFA利用局限性微孔濾膜的過濾性能不同,免疫層析法將特異性的抗原或抗體以條帶狀固定在膜上,膠體金標(biāo)記試劑吸附在結(jié)合墊上,當(dāng)待檢樣本加到試紙條一端的樣本墊上后,通過毛細(xì)作用向前移動(dòng),溶解結(jié)合墊上的膠體金標(biāo)記試劑后相互反應(yīng),再移動(dòng)至固定的抗原或抗體的區(qū)域時(shí),待檢物與金標(biāo)試劑的結(jié)合物又與之發(fā)生特異性結(jié)合而被截留,聚集在檢測帶上,可通過肉眼觀察到顯色結(jié)果。體金免疫層析試紙條的構(gòu)成樣品墊金標(biāo)墊膜吸收墊_____襯板Goldtestcontrol競爭法標(biāo)準(zhǔn)抗原Goldtestcontrol間接法控側(cè)我卡型檢測過程和結(jié)果卡里IS測方法1,將試劑和待檢標(biāo)本平衡至室溫,撕開鋁箔袋.取出檢測卡,平放于桌面上。2.用移液槍加樣60-80ul或用滴管加3滴血清或血漿,加入上述檢測卡的加樣區(qū)（Sh同時(shí)計(jì)時(shí)。35-30分鐘內(nèi)觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)栗,30分鐘以后觀察結(jié)果無效HCV條型3.2.2結(jié)果判定圍示條型檢灞過程和結(jié)果滴液測試陽性明性累里方活1.將試劑和待驗(yàn)祥本平衡至室溫,撕開鋁箔袋,小心取出檢測條?2收集血濟(jì)/血漿t(X)_150ul或3-4滴血滑在一小杯中,3-將檢測條吸收樣本一端插入小杯內(nèi)的樣本中(檢測條插入樣本中的深度不可超過標(biāo)志線),同時(shí)計(jì)時(shí),4+Jr加分鐘內(nèi)觀察頭驗(yàn)結(jié)果,30分鐘以后觀察結(jié)果無效。?陽性結(jié)果:出現(xiàn)質(zhì)控線和反應(yīng)線兩奈紫紅色線，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽性。?陰性結(jié)果:僅出現(xiàn)一條紫紅色質(zhì)控線，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性。?無效:不出現(xiàn)質(zhì)控線紅線或僅出現(xiàn)一條反應(yīng)線紅線，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為無效結(jié)果，應(yīng)重試。?競爭法的結(jié)果判定則相反產(chǎn)優(yōu)點(diǎn):?檢測方法簡單而快速,數(shù)分鐘即可得出結(jié)果;?不需儀器設(shè)備,操作人員不需特殊訓(xùn)練;?試劑穩(wěn)定,適用于單份測定,干燥包裝的試劑可在室溫保存一年以上;?無污染。.單一試剤,一步操作。小型實(shí)驗(yàn)室即有條件開發(fā)生產(chǎn)。成為目前"病人身邊檢驗(yàn)"(point-of-caretesting,POCT)中廣為應(yīng)用的方法。＞不足:金免疫測定中應(yīng)用的是單份試劑，難于進(jìn)行質(zhì)量控制。即使是同一批生產(chǎn)的試劑，也很難保證每個(gè)試劑的同一性。因此金免疫測定一般只能用于定性試驗(yàn)。其定量檢測和靈敏度的提髙還有賴于新原料和新材料的開發(fā)與應(yīng)用。5膠體金技術(shù)的應(yīng)用—~r—類別_領(lǐng)域檢測的物鹿人類醫(yī)學(xué)苦級(jí)醫(yī)院,血站，CDC,防疫站，診斷中心；家庭自檢:商檢系統(tǒng)：邊檢口岸：公安系統(tǒng).傳染摘（乙肝五頂.HIV,SARS等）標(biāo)志物（afp,肌鈣蛋白、a便血紅蛋白等）女性妊娠hCG（早孕）毒品（嗎啡，*粉，搖頭丸，冰毒）農(nóng)牧亞畜牧嚳醫(yī)站，商檢系班,邊撿口岸，農(nóng)牧類院系和研究所傳染病（禽流感，鏈球苗等＞病毐（煙草花葉病毒，大細(xì)小病毒等）環(huán)境環(huán)保監(jiān)測部門，研究機(jī)構(gòu)有害物質(zhì)超際食品安全食品安全檢測中心，苦監(jiān)管部門農(nóng)獸藥殘留（磺胺類、瘦肉精等），大腸桿菌?黃曲霉素噴膜儀僅器參數(shù)儀器尺寸為:430mmx41OmmX360mm平臺(tái)大小:450mmX70mm平臺(tái)移動(dòng)速度:0-330mm/secX，Y、Z軸移動(dòng)誤差:<50um定位_度:±Wumin1axis;±25umin2axis噴點(diǎn)方式BJQ3000:非接觸噴點(diǎn)AJQ3000:非接觸噴點(diǎn)劃枝貿(mào)燴BJQ3000:0.50mm/line（噴點(diǎn)0i20mm/drop）AJQ3000:0.5-5mm租小噴置BJQ3000:10nl/dropAJQ3000:1ul/cm劃桟精密度BJQ3000:±1%AJQ3000:±2%,切鎌儀K參數(shù):進(jìn)料寬度:^100mm進(jìn)料長度:不限，可連續(xù)進(jìn)料切割切割寬度:mm,寬度連續(xù)可調(diào)切割寬度設(shè)定位數(shù):0.01mm切割精度:±0.1mm切割速度:230次/分鐘，速度連續(xù)可調(diào)切條計(jì)數(shù):單次工作和總工作分別計(jì)數(shù)刀片:日本進(jìn)口，耐磨離碳鋼材料抗靜電裝S:建議選配電源:220VAC_量:20KG尺寸:430(L)x330(W)x260(H)mm三酶聯(lián)免疫檢測（ELISA）技術(shù)簡介1.ELISA的原理ELISA是一種免疫測定.基礎(chǔ):抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。加入酶反應(yīng)的底物后,底物被酶催化成為有色產(chǎn)物,產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān),由此進(jìn)行定性或定量分析。1.1抗原抗體反應(yīng)r1.1可逆性A抗原與抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物的過程是一種動(dòng)態(tài)平衡，其反應(yīng)式為:Ag+Ab—Ag?Ab抗體的親和力(affinity)，可以用平衡常數(shù)K表示:K=[Ag?Ab]/[Ag][Ab],Ag?Ab的解離程度與K值有關(guān)。髙親和力抗體的抗原結(jié)合點(diǎn)與抗原的決定簇在空間構(gòu)型上非常適合,兩者結(jié)合牢固,不易解離。解離后的抗原或抗體均能保持原有的結(jié)構(gòu)和活性?？乖贵w的結(jié)合發(fā)生在抗原的決定簇與抗體的結(jié)合位點(diǎn)之間?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型互補(bǔ)關(guān)系,具有髙度的特異性。\7測定某一特定的物質(zhì),而不需先分離待檢物。抗原抗體能識(shí)別特定外來物的一個(gè)獨(dú)特特征,該外來目標(biāo)被稱為抗原。蛋白上Y形的其中兩個(gè)分鎖狀結(jié)構(gòu),該結(jié)構(gòu)僅針對(duì)一種特定的抗原表位。這就像一把鑰匙只能開一把鎖一樣,使得一種抗體抗體僅能和其中一種抗原相結(jié)合。h抗原結(jié)合區(qū)（Fab）2,抗原結(jié)晶區(qū)（Fc）3.藍(lán)色的重鏈有一個(gè)可變區(qū)（VH）^隨其后的一個(gè)恒定區(qū)（CHI）f

—個(gè)樞紐區(qū),以及另兩個(gè)恒定區(qū)（CH2andCH3）②組成4.綠色的輕鏈包含一個(gè)可變區(qū)（VL）以及一個(gè)恒定區(qū)（CL）00HHOOCCOOH④5.抗原結(jié)合點(diǎn)6.樞紐區(qū)抗體是具有4條多肽鏈的對(duì)稱結(jié)構(gòu),其中2條較長、相對(duì)分子量較大的相同的重鏈（H鏈〉；2條較短、相對(duì)分子量較小的相同的輕鏈（L鏈）,鏈間由二硫鍵和非共價(jià)鍵聯(lián)結(jié)形成一個(gè)由4條多肽鏈構(gòu)成的單體分子。1.1.3:適比Theprecipitinreactionfreeantibodyfre?arrtigenr*>immunecomplexprecipitaiet化學(xué)比色法的敏感度為mg/ml水平；酶反應(yīng)測定法的敏感度約為5-10pg/ml；免疫測定中凝膠擴(kuò)散法和濁度法的敏感度與酶反應(yīng)法相仿;標(biāo)記的免疫敏感度可提髙數(shù)千倍,達(dá)ng/ml水平例如,HBsAg,其敏感度可達(dá)0,lng/ml。ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有三個(gè)必要的試劑:(1)固相的抗原或抗體,即"免疫吸附劑〃(immunosorbent)；(2)酶標(biāo)記的抗原或抗體,稱為"結(jié)合物〃(conjugate)；(3)酶反應(yīng)的底物?？稍O(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測方法。味恪杭吟用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋,可直接用于測定,因此其敏感度相對(duì)髙于間接法。乙肝標(biāo)志物中抗HBsAg的檢測常采用本法,本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備,應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同,尋找合適的標(biāo)記方法。反應(yīng)原理和模式與雙抗原夾心法類似。用特異性抗體進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物,以檢測相應(yīng)的抗原.與間接法測抗體的不同之處為以酶標(biāo)抗體代替酶標(biāo)抗抗體。此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原,例如HBsAg、HBeAg、AFP等。只要獲得針對(duì)受檢抗原的異性抗體,就可用于包被固相載體和制固相執(zhí)原柃檢擾體ft梓二抗間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體（二抗）以檢測與固相抗原結(jié)合的受檢抗體,故稱為間接法。間接法的優(yōu)點(diǎn)是只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體建立檢測相應(yīng)抗體的方法。當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去,或不易得到足夠的純化抗原時(shí),可用此法檢測特異性抗體。HMM唼與抗原S含物i-:lTTTT*的際IV?唱咢擇小分子抗原或半抗原缺乏可作夾心法的兩個(gè)以上的位點(diǎn),因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測定,可以采用竟?fàn)幏Ｊ?。其原理是?biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競爭與固相抗體結(jié)合。標(biāo)本中抗原量含量愈多,結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少,最后的顯色也愈淺。小分子激素、藥物等ELISA測定多用此法,t_固相化抗人IgM終止液IIgM的檢測常用于傳染病的診斷。用抗人IgM抗體包被固相,以捕獲血清標(biāo)本中的IgM（其中包括針對(duì)抗原的特異性IgM抗體和非特異性的IgM）。此法常用于病毒性感染的早期診斷。3ELISA的試刑制備?3.1包被的方式?將抗原或抗體固定在過程稱為包被(coating).蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結(jié)合的,靠的是蛋白質(zhì)E分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與固相裁體表面的疏水基團(tuán)間的作用。這種物理吸附是非特異性的,受蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、濃度等的影響。大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團(tuán),故更易吸附到固相載體表面3.2包被的條件?pH9.6碳酸鹽緩沖液?PH7.2的磷酸鹽緩沖液?PH7-8的Tris-HCL緩沖液。?加入包被液后,在4-8*0冰箱中放置過夜,37C中保溫2小時(shí)。包被濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化,每批材料需通過實(shí)驗(yàn)與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為lOng/tnl-20ug/mlo3.3封閉?封閉(blocking)是繼包被之后用髙濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程。封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥ELISA后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附?常用封閉劑:0.05%-0.5%的BSA;10%的小牛血清或1%明膠;脫脂奶粉,比較價(jià)廉,可以高濃度使用(5%)?3.4ELISA中有三個(gè)必要的試劑:免疫吸附劑、結(jié)合物和酶的底物。?(1)己包被抗原或抗體的固相載體(免疫吸附劑)；?(2)酶標(biāo)記的抗原或抗體(結(jié)合物)；?(3)酶的底物:?(4)陰性對(duì)照品和陽性對(duì)照品，參考標(biāo)準(zhǔn)品:?(5)結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液；?(6)洗滌液；?(7)酶反應(yīng)終止液4基本操作注意事項(xiàng)4.1加樣:在ELISA中一般有3次加樣步聚,即加標(biāo)本,加酶結(jié)合物,加底物。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在ELISA板孔的底部,避免加在孔壁上部,并注意不可濺出,不可產(chǎn)生氣泡。抗原抗體完成反應(yīng)的保溫過程稱為溫育(incubation)。ELISA屬固相免疫測定,抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。為什么ELISA反應(yīng)總是需要一定時(shí)間的溫育?溫育常采用的溫度有43'C.37"C.室溫和4*C(冰箱溫度)等。37*C是實(shí)驗(yàn)室中常用的保溫溫度,也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。保溫方式:ELISA儀器附有特制的電熱塊，水浴。若用保溫箱:ELISA板放在濕盒內(nèi)，在盒底墊濕的紗布，最后將ELISA板放在濕紗布上。反應(yīng)板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。室溫溫育的反應(yīng)，操作時(shí)的室溫應(yīng)嚴(yán)格限制在規(guī)定的范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)室溫溫度是指20-25'C，但具體操作時(shí)可根據(jù)說明書的要求控制溫育。應(yīng)注意溫育的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。為保證這一點(diǎn)，一個(gè)人操作時(shí)，一次不宜多于兩塊板同時(shí)測定。洗滌在ELISA過程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟，但卻也決定著實(shí)驗(yàn)的成敗。ELSIA洗滌:達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。清除殘留在板孔中游離的物質(zhì),以及非特異性地吸附的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的,而在洗滌時(shí)又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來?？梢哉f在ELISA操作中,洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)。洗滌的方式除某些ELISA儀器配有特殊的自動(dòng)洗滌儀外,手工操作有流水沖洗式和浸泡式兩種:(1)流水沖洗式流水沖洗法最初用于小珠載體的洗滌,洗滌液為蒸餾水,自來水。洗滌效果更為徹底,且也簡便、快速。己有實(shí)驗(yàn)表明,流水沖洗式同樣適用于微量滴定板的洗滌。讓水流沖擊板孔表面,洗滌效果更佳。(2)浸泡式微量滴定板多采用。洗滌液為非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的,非離子型洗滌劑既含疏水基團(tuán),也含親水基團(tuán),使蛋白質(zhì)回復(fù)到水溶液狀態(tài),從而脫離固相載體。顯色是酶催化無色的底物生成有色產(chǎn)物的溫育反應(yīng)。反應(yīng)的溫度和時(shí)間仍是影響顯色的因素。在一定時(shí)間內(nèi),陰性孔可保持無色,而陽性孔則隨時(shí)間的延長而呈色加強(qiáng)。適當(dāng)提髙溫度有助于加速顯色進(jìn)行。TMB受光照的影響不大,可在室溫中置于操作臺(tái)上,邊反應(yīng)觀察結(jié)果。但為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性,宜在規(guī)定的適當(dāng)時(shí)間閱讀結(jié)果。TMB經(jīng)HRP作用后,約40分鐘顯色達(dá)頂峰,隨即逐漸減弱,至2小時(shí)后即可完全消退至無色。4*5比色拭干板底附著的液體:然后&板正確放入酶標(biāo)比色儀中。以蒸餾