Illumina測(cè)序介紹課件

Illumina測(cè)序技術(shù)概述課程結(jié)束時(shí)：清楚了解Illumina測(cè)序流程中的主要步驟能夠描述簇生成（ClusterGeneration）的過(guò)程

理解邊合成邊測(cè)序（SequencingbySynthesis）的原理課程目標(biāo)IlluminaSequencingWorkflow1LibraryPreparationcBotMiSeqNextSeqHiSeq2500-Rapid2ClusterGenerationHiSeqHiScanSQGAIIxMiSeqNextSeq3Sequencing4DataAnalysisICS/RTACASAVAMSRBaseSpaceIllumina測(cè)序流程文庫(kù)制備簇生成測(cè)序數(shù)據(jù)分析IlluminaSequencingWorkflow1LibraryPreparationcBotMiSeqNextSeqHiSeq2500-Rapid2ClusterGenerationHiSeqHiScanSQGAIIxMiSeqNextSeq3Sequencing4DataAnalysisICS/RTACASAVAMSRBaseSpaceIllumina測(cè)序流程文庫(kù)制備簇生成測(cè)序數(shù)據(jù)分析文庫(kù)制備的目的是在需要測(cè)序的DNA片段兩端加上能夠與測(cè)序儀配合的接頭序列（Multiplexed,SR,PE）雙端標(biāo)簽文庫(kù)文庫(kù)制備是決定測(cè)序?qū)嶒?yàn)成功與否的關(guān)鍵步驟①①①與流動(dòng)槽（FlowCell）結(jié)合的區(qū)域②②②

Read1和Read2測(cè)序引物結(jié)合的區(qū)域③③

插入片段④④④

標(biāo)簽序列區(qū)域（Index）IlluminaSequencingWorkflow1LibraryPreparationcBotMiSeqNextSeqHiSeq2500-Rapid2ClusterGenerationHiSeqHiScanSQGAIIxMiSeqNextSeq3Sequencing4DataAnalysisICS/RTACASAVAMSRBaseSpaceIllumina測(cè)序流程文庫(kù)制備簇生成測(cè)序數(shù)據(jù)分析WhatisaFlowCell?Eachlaneisrandomlycoatedwithalawnofoligosthatarecomplementarytolibraryadapters每條通道中都隨機(jī)植入了能與文庫(kù)接頭互補(bǔ)結(jié)合的大量短DNA片段Clustergenerationoccursonaflowcell簇生成在流動(dòng)槽（flowcell）上完成流動(dòng)槽(FlowCell)是什么?Aflowcellisathickglassslidewithchannelsorlanes一種含有通道的厚玻璃片簇生成SingleDNALibrary單個(gè)DNA文庫(kù)分子AmplifiedClonalCluster擴(kuò)增后的DNA克隆簇cBotSequencerHybridizeFragment&ExtendAdaptersequence接頭序列3’extension3’延伸Surfaceofflowcellcoatedwithalawnofoligopairs流動(dòng)槽表面隨機(jī)植入了大量引物鏈SingleDNAlibrariesarehybridizedtoprimerlawn變性后單鏈DNA文庫(kù)與流動(dòng)槽上的引物雜交Boundlibrariesarethenextendedbypolymerases隨后在DNA合成酶的作用下，結(jié)合上的DNA文庫(kù)進(jìn)行延伸片段雜交與延伸Newlysynthesizedstrand新合成鏈Originaltemplate原始模板鏈DenatureDouble-StrandedDNADiscard洗去丟棄Double-strandedmoleculeisdenatured雙鏈DNA分子被變性O(shè)riginaltemplatewashedaway原始的模板鏈被洗去Newlysynthesizedstrandiscovalentlyattachedtoflowcellsurface新合成的DNA鏈以共價(jià)鍵連接的方式結(jié)合在流動(dòng)槽表面雙鏈DNA變性NOTE:SinglemoleculesbindtoflowcellinarandompatternNOTE:單個(gè)DNA分子以隨機(jī)的方式與流動(dòng)槽表面結(jié)合Single-StrandedDNA單鏈DNABridgeAmplificationSingle-strandedmoleculeflipsoverandformsabridgebyhybridizingtoadjacent,complementaryprimer共價(jià)鍵結(jié)合在流動(dòng)槽表面的單鏈DNA分子與其附近的互補(bǔ)引物雜交，整條DNA分子折疊后形成一種類似于橋的結(jié)構(gòu)。Hybridizedprimerisextendedbypolymerases在DNA合成酶作用下，雜交后的引物以單鏈DNA為模板進(jìn)行延伸橋式PCR擴(kuò)增3’extension3‘延伸反應(yīng)BridgeAmplificationDouble-strandedbridgeisformed延伸完成后形成雙鏈DNA橋式結(jié)構(gòu)橋式PCR擴(kuò)增DenatureDouble-StrandedBridgeDouble-strandedbridgeisdenatured橋式結(jié)構(gòu)的雙鏈DNA被變性Result:Twocopiesofcovalentlyboundsingle-strandedtemplates結(jié)果：形成兩條與流動(dòng)槽表面共價(jià)鍵結(jié)合的DNA模板雙鏈DNA橋式結(jié)構(gòu)變性BridgeAmplificationSingle-strandedmoleculesflipovertohybridizetoadjacentprimers單鏈DNA分子再一次折疊后與附近的引物雜交結(jié)合Hybridizedprimerisextendedbypolymerase雜交后的引物再次在DNA合成酶的作用下延伸橋式PCR擴(kuò)增BridgeAmplificationBridgeamplificationcycleisrepeateduntilmultiplebridgesareformed橋式擴(kuò)增不斷重復(fù)發(fā)生直到形成數(shù)量足夠的DNA橋（與PCR反應(yīng)類似，區(qū)別在于引物不是游離在溶液中，而是固定在流動(dòng)槽表面）橋式PCR擴(kuò)增LinearizationdsDNAbridgesaredenatured雙鏈DNA變性后，解開(kāi)橋式結(jié)構(gòu)，變成線性化的單鏈DNA線性化ReverseStrandCleavageReversestrandsarecleavedandwashedaway,leavingaclusterwithforwardstrandsonly與流動(dòng)槽表面結(jié)合的DNA反鏈被切除并洗去，只留下正鏈，形成包含均一單鏈的DNA簇反鏈切除BlockingFree3’endsareblockedtopreventunwantedDNApriming為了防止后續(xù)測(cè)序過(guò)程中不必要的DNA延伸，對(duì)流動(dòng)槽上結(jié)合的所有DNA分子的3’端進(jìn)行封閉DNA鏈封閉Read1PrimerHybridizationSequencingprimer測(cè)序引物Sequencingprimerishybridizedtoadaptersequence將Read1測(cè)序引物加入流動(dòng)槽，使其與待測(cè)DNA分子的接頭序列結(jié)合Read1引物雜交IlluminaSequencingWorkflow1LibraryPreparationcBotMiSeqNextSeqHiSeq2500-Rapid2ClusterGenerationHiSeqHiScanSQGAIIxMiSeqNextSeq3Sequencing4DataAnalysisICS/RTACASAVAMSRBaseSpaceIllumina測(cè)序流程文庫(kù)制備簇生成測(cè)序數(shù)據(jù)分析SequencingBySynthesis

Add4Fl-NTP’s+Polymerase加入4種不同熒光標(biāo)記的dNTP和DNA合成酶IncorporatedFI-NTPimaged對(duì)結(jié)合上的熒光dNTP進(jìn)行照相Terminator&fluorescentdyecleavedfromFI-NTP結(jié)合在DNA鏈上的熒光NTP中的熒光標(biāo)記和阻斷基團(tuán)被切除，可以繼續(xù)下一輪反應(yīng)X36-251邊合成邊測(cè)序（SBS）All4labelednucleotidesin1reaction同時(shí)存在4種不同標(biāo)記的核苷酸Higheraccuracy更高的準(zhǔn)確性Noproblemswithhomopolymerrepeats不存在均聚物重復(fù)片段測(cè)序困難問(wèn)題Incorporation結(jié)合Detection檢測(cè)Deblock去阻斷FluorRemoval

切除熒光基團(tuán)NextCycle下一個(gè)循環(huán)ReversibleTerminatorChemistry可逆阻斷3‘阻斷基團(tuán)切除位點(diǎn)熒光基團(tuán)去阻斷后自由的3‘OH端100MicronsClustersDNA簇123789456TTTTTTT

G

T…T

G

C

T

A

C

G

A

T…Theidentityofeachbaseofaclusterisreadofffromsequentialimages根據(jù)每個(gè)點(diǎn)每輪反應(yīng)讀取的熒光信號(hào)序列，轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的DNA序列照相讀取序列FourChannelSBSChemistry:GA,HiSeq,MiSeq

四通道SBS測(cè)序中收集對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)通道的4張相片每個(gè)測(cè)序循環(huán)中，結(jié)合有不同堿基的DNA簇會(huì)在4張照片中的一張中出現(xiàn)每種DNA堿基具有獨(dú)特的熒光波長(zhǎng)（不同的顏色）雙通道SBS測(cè)序僅使用2張圖像測(cè)序簇中摻入核苷酸T時(shí)僅在綠色通道中出現(xiàn)測(cè)序簇中摻入核苷酸C

時(shí)僅在紅色通道中出現(xiàn)測(cè)序簇中摻入核苷酸A

時(shí)在綠色和紅色通道中都出現(xiàn)測(cè)序簇中摻入核苷酸G

時(shí)在綠色和紅色通道中都不出現(xiàn)將測(cè)序簇在兩種通道中的熒光強(qiáng)度坐標(biāo)以圖表畫(huà)出，即可相應(yīng)地讀出不同堿基TwoChannelSBS–NextSeq

雙通道SBSPairedEndSequencing雙末端測(cè)序ThisisreallythebestwaytodosequencingThisisreallythebestwaytodosequencingThisisreallythebestwaytodosequencingThisisreallythebestwaytodosequencingThisisreallythebestwaytodosequencingThisisreallythebestwaytodosequencingThisis

reallythebestwaytodo

sequencing(----100characters-------)Reference參考序列Single-reads單端序列信息…………Paired-reads雙端序列信息序列更容易進(jìn)行組裝??！SequencingwithPairedEnds雙末端測(cè)序Sequencedstrand測(cè)序生成鏈Blocked3’-ends被阻斷的3’端Sequencedstrandisstrippedoff測(cè)序反應(yīng)生成的片段被變性洗去3’-endsoftemplatestrandsandlawnprimersareunblocked與流動(dòng)槽結(jié)合的DNA序列上3’端阻斷被去除（同時(shí)也去除引物叢上的3’端阻斷）PairedEndSequencing雙末端測(cè)序Discard洗去丟棄Bridgeformation橋式結(jié)構(gòu)3’extension3’延伸反應(yīng)Single-strandedtemplateloopsovertoformabridgebyhybridizingwithalawnprimerDNA單鏈折疊后與其附近的引物叢雜交結(jié)合形成新的橋式結(jié)構(gòu)3’-endsoflawnprimerisextended在DNA合成酶作用下，結(jié)合上模板的引物叢3’端開(kāi)始延伸PairedEndSequencing雙末端測(cè)序DoublestrandedDNA雙鏈DNA(橋式結(jié)構(gòu))PairedEndSequencing雙末端測(cè)序Originalforwardstrand原始的正鏈PairedEndSequencingBridgesarelinearizedandtheoriginalforwardtemplateiscleaved雙鏈橋式結(jié)構(gòu)被變性，形成線性結(jié)構(gòu)的DNA簇；隨后正義鏈被切除，留下只含有反義鏈的DNA簇雙末端測(cè)序ReversestrandTemplate反義鏈模板Blocked3’-ends阻斷3’端Sequencingprimer測(cè)序引物PairedEndSequencingFree3’endsofthereversetemplateandlawnprimersareblockedtopreventunwantedDNApriming為了防止測(cè)序過(guò)程中不需要的DNA延伸，對(duì)流動(dòng)槽上結(jié)合的所有DNA分子的3’端進(jìn)行封閉SequencingprimerishybridizedtoadaptersequenceRead2測(cè)序引物與待測(cè)DNA分子的接頭序列雜交結(jié)合雙末端測(cè)序SequencingBySynthesis2nd

Read

Add4Fl-NTP’s+Polymerase加入4種不同熒光標(biāo)記的dNTP和DNA合成酶IncorporatedFI-NTPimaged對(duì)結(jié)合上的熒光dNTP進(jìn)行照相Terminator&fluorescentdyecleavedfromFI-NTP結(jié)合在DNA鏈上的熒光dNTP中的熒光標(biāo)記和阻斷基團(tuán)被切除，可以繼續(xù)下一輪反應(yīng)X36-251Read2邊合成邊測(cè)序SequencingPairedEndLibrarieswithSingleIndexRead單標(biāo)簽（SingleIndex）雙末端測(cè)序Read2SeqPrimer(HP7)Read1SeqPrimer(HP6)IndexSeqPrimer(HP8)123MultiplexSequencingUtilizes3SequencingReadsPairedEndTurnaround序列翻轉(zhuǎn)SingleIndexSequencingUtilizes3

SequencingReads單index雙末端測(cè)序使用3種測(cè)序引物，3次序列讀取SequencingwithPairedEnds雙末端測(cè)序（單標(biāo)簽）正向序列讀取索引序列讀取反向序列讀取SequencingPairedEndLibrarieswithDualIndexRead雙標(biāo)簽（DualIndex）雙末端測(cè)序1234DualIndexSequencingUtilizes4SequencingReads雙標(biāo)簽雙末端測(cè)序包含4次測(cè)序讀取，但是只用到3條不同測(cè)序引物（反向索引序列的讀取使用了流動(dòng)槽上錨定的P5序列）SequencingPairedEndLibrarieswithDualIndexRead雙末端測(cè)序（雙標(biāo)簽）適用于GAIIx,MiSeq,HiSeq1500/2000/2500正向序列讀取正向索引序列讀取反向索引序列讀取反向序列讀取僅進(jìn)行化學(xué)合成，不照相PairedEndTurnaround序列翻轉(zhuǎn)DualIndexSequencingUtilizes4SequencingReads雙索引雙末端測(cè)序包含4次測(cè)序讀取，用到4條不同測(cè)序引物SequencingPairedEndLibrarieswithDualIndexRead雙末端測(cè)序（雙標(biāo)簽）適用于NextSeq,HiSeq3000/40001234正向序列讀取正向索引序列讀取反向索引序列讀取反向序列讀取PairedEndTurnaround序列翻轉(zhuǎn)IlluminaSequencingWorkflow1LibraryPreparationcBotMiSeqNextSeqHiSeq2500-Rapid2ClusterGenerationHiSeqHiScanSQGAIIxMiSeqNextSeq3Sequencing4DataAnalysisICS/RTACASAVAMSRBaseSpaceIllumina測(cè)序流程文庫(kù)制備簇生成測(cè)序數(shù)據(jù)分析PrimaryAnalysis初級(jí)分析SecondaryAnalysis二級(jí)分析DataVisualization數(shù)據(jù)可視化DataAnalysisOverview數(shù)據(jù)分析總覽AlignmentsandVariantDetection序列比對(duì)和突變檢測(cè)Images/TIFFfiles圖片文件BaseCalling讀取堿基Intensities光強(qiáng)數(shù)據(jù)SoftwareOutputsPrimaryandSecondaryAnalysisOverviewAnalysisTypePrimaryAnalysis初級(jí)分析SecondaryAnalysis二級(jí)分析Sequencing測(cè)序ICS/RTAICS/RTAHiSeqAnalysisSoftware初級(jí)和二級(jí)數(shù)據(jù)分析總覽Summary1LibraryPreparationcBotMninSeqMiSeqNextSeqHiSeq2500-Rapid2ClusterGenerationHiSeqHiScanSQGAIIxMiniSeqMiSeqNextSeq3Sequencing4DataAnalysisICS/RTACASAVALRMMSRBaseSpace總結(jié)文庫(kù)制備簇生成