《項(xiàng)目六高效液相色譜法》課件

《食品儀器分析技術(shù)》

謝昕主編大連理工大學(xué)出版社

項(xiàng)目六高效液相色譜法及在食品分析中的應(yīng)用

【知識(shí)目標(biāo)】1、理解柱色譜法分離機(jī)理；2、認(rèn)知高效液相色譜儀的基本結(jié)構(gòu)和各部件的作用；3、熟悉高效液相色譜法的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，包括樣品預(yù)處理、分離模式選擇、流動(dòng)相選擇等；4、熟悉高效液相色譜法的定性定量方法；5、了解高效液相色譜法在食品分析中的原理及實(shí)驗(yàn)技術(shù)。項(xiàng)目六高效液相色譜法及在食品分析中的應(yīng)用【技能目標(biāo)】1、能正確使用高效液相色譜儀以及相關(guān)設(shè)備；2、熟悉高效液相色譜儀的日常維護(hù)與保養(yǎng)；3、能根據(jù)待測(cè)樣品和實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有條件進(jìn)行最佳實(shí)驗(yàn)條件的選擇，如樣品預(yù)處理、分離模式選擇、流動(dòng)相選擇、定性定量方法等；4、能正確進(jìn)行數(shù)據(jù)記錄和處理；5、能利用高效液相色譜法對(duì)食品項(xiàng)目進(jìn)行定性和定量測(cè)定。項(xiàng)目六高效液相色譜法及在食品分析中的應(yīng)用一、液固吸附色譜液固吸附色譜是以固體吸附劑（氧化鋁、硅膠、活性炭、碳酸鈣、氧化鎂等）作為固定相，根據(jù)物質(zhì)在固定相上的吸附作用不同來(lái)進(jìn)行分離。液固色譜常用于分離極性不同的化合物，也能分離那些具有相同極性基團(tuán)，但數(shù)量不同的樣品。此外，液固色譜還適于分離異構(gòu)體，這主要是因?yàn)楫悩?gòu)體有不同的空間排列方式，因此吸附劑對(duì)它們的吸附能力有所不同，從而得到了分離。項(xiàng)目六高效液相色譜法及在食品分析中的應(yīng)用二、液液分配色譜

液液分配色譜中，一個(gè)液相作為流動(dòng)相，另一個(gè)液相（即固定液）則分散在很細(xì)的惰性載體（也叫擔(dān)體）或硅膠上作為固定相，固定液與流動(dòng)相互不相溶。樣品的各組分按照它們各自的分配系數(shù)，很快地在兩相間達(dá)到分配平衡，從而導(dǎo)致各組分遷移速度不同，從而實(shí)現(xiàn)了分離。

分為：正相分配色譜法（固定相的極性大于流動(dòng)相的極性）和反相分配色譜法（固定相的極性小于流動(dòng)相的極性）。液液分配色譜法既能分離極性化合物，又能分離非極性化合物項(xiàng)目六高效液相色譜法及在食品分析中的應(yīng)用三、鍵合相色譜采用化學(xué)鍵合相的液相色譜法稱(chēng)為鍵合相色譜。由于鍵合固定相非常穩(wěn)定，在使用中不易流失，且鍵合到載體表面的官能團(tuán)可以是各種極性的，因此，它適用于各種樣品的分離分析。

正相鍵合相色譜法使用極性鍵合固定相（以極性有機(jī)基團(tuán)，如氨基、氰基等鍵合在硅膠表面制成），鍵合固定相的極性大于流動(dòng)相的極性，適用于分離油溶性或水溶性的極性與強(qiáng)極性化合物。反相鍵合相色譜法使用的是極性較小的鍵合固定相（以極性較小的有機(jī)基團(tuán)，如苯基、烷基等鍵合在硅膠表面成的），鍵合固定相的極性小于流動(dòng)相的極性，適用于分離非極性、極性或離子型化合物。C18反相鍵合相（簡(jiǎn)稱(chēng)ODS）項(xiàng)目六高效液相色譜法及在食品分析中的應(yīng)用學(xué)習(xí)情景一

高效液相色譜儀的認(rèn)知與操作項(xiàng)目六高效液相色譜法及在食品分析中的應(yīng)用一、高效液相色譜儀的基本結(jié)構(gòu)高效液相色譜儀由輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測(cè)系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)等組成。

項(xiàng)目六高效液相色譜法及在食品分析中的應(yīng)用1、貯液瓶用來(lái)貯存液體流動(dòng)相，一般是以不銹鋼、玻璃、聚四氟乙烯或特種塑料聚醚醚酮（PEEK）襯里為材料，容積一般為0.5～2L。貯液瓶要求能承受一定壓力、耐腐蝕、易于脫氣操作。貯液瓶一般配2～4個(gè)，至少1個(gè)（單元泵，僅做等梯度洗脫）。分析過(guò)程使用的液體流動(dòng)相常為有機(jī)溶劑、緩沖溶液、水等，在放入貯液瓶之前必須經(jīng)過(guò)過(guò)濾和脫氣處理。

項(xiàng)目六高效液相色譜法及在食品分析中的應(yīng)用2、高壓輸液泵高壓輸液泵是高效液相色譜儀的關(guān)鍵部件，其作用是將流動(dòng)相以穩(wěn)定的流速或壓力輸送到色譜分離系統(tǒng)，使樣品在色譜柱中完成分離。目前儀器常配備恒流往復(fù)式輸液泵，對(duì)其要求是：壓力穩(wěn)定、流速恒定、流量可調(diào)、泵體材料耐腐蝕，死體積小，具有較高的輸出壓力。3、溶劑混合和梯度控制裝置溶劑混合和梯度控制裝置用來(lái)控制流動(dòng)相的組成，分為等梯度洗脫和梯度洗脫兩種方式。

項(xiàng)目六高效液相色譜法及在食品分析中的應(yīng)用

等梯度洗脫是在整個(gè)分離過(guò)程中，流動(dòng)相的組成不變，這種方式柱效率相對(duì)較低，分析時(shí)間長(zhǎng)。

梯度洗脫是指流動(dòng)相梯度，即在分離過(guò)程中改變流動(dòng)相的組成（溶液極性、離子強(qiáng)度、pH值等）或改變流動(dòng)相的濃度。在梯度洗脫時(shí)，按操作者給定的程序?qū)煞N或兩種以上的溶劑在泵前或泵后混合，此混合的比例是隨時(shí)間按一定的變化率（即梯度）自動(dòng)連續(xù)地變化。流動(dòng)相的組成及其洗脫強(qiáng)度按一定程序隨時(shí)間變化，使得復(fù)雜樣品在盡量短的時(shí)間內(nèi)所有待測(cè)的組分均有較好的分離度．譜峰間距較均勻，避免色譜峰前擠后松甚至強(qiáng)保留組分出不來(lái)的現(xiàn)象。梯度洗脫分為高壓梯度和低壓梯度兩種方式。

優(yōu)點(diǎn)：兩臺(tái)高壓輸液泵的流量皆可獨(dú)立控制，可獲得任何形式的梯度程序；精度高，易于實(shí)現(xiàn)控制的自動(dòng)化；高壓混合不易產(chǎn)生氣泡，對(duì)洗脫液的脫氣要求較低。缺點(diǎn)：因需多臺(tái)輸液泵，故成本較高。

高壓梯度，是用兩臺(tái)高壓輸液泵將兩種溶劑輸入混合室，進(jìn)行混合后再進(jìn)入色譜柱。低壓梯度，是在常壓下將兩種溶劑輸至混合器中混合，然后用高壓輸液泵將流動(dòng)相輸入至色譜柱中。

優(yōu)點(diǎn)：是僅需使用一個(gè)高壓輸液泵，成本低廉，使用方便；另外，因混合在泵加壓前完成，可避免高壓混合中洗脫液的體積變化引起流量不穩(wěn)定。缺點(diǎn)：低壓混合易產(chǎn)生氣泡，故對(duì)脫氣要求較高。若沒(méi)有配置在線脫氣機(jī)，在梯度洗脫時(shí)，應(yīng)盡量避免將幾乎100%的某一種溶劑與幾乎100%的另一種溶劑直接上機(jī)混合。（二）進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)校系統(tǒng)的作用是將侍分析樣品準(zhǔn)確送入色譜柱的裝置。要求密封性好，死體積小，重復(fù)性好，進(jìn)樣引起色譜分離系統(tǒng)的壓力和流量波動(dòng)要很小。圖6-3六通閥進(jìn)樣手動(dòng)進(jìn)樣器只有六通閥進(jìn)樣器，進(jìn)樣體積由定量環(huán)確定，定量環(huán)通常是10μL和20μL體積的。

圖6-4自動(dòng)進(jìn)樣器

自動(dòng)進(jìn)樣器是由計(jì)算機(jī)自動(dòng)控制定量閥，按預(yù)先編制的注射樣品操作程序進(jìn)行工作。取樣、進(jìn)樣、復(fù)位、樣品管路清洗和樣品盤(pán)（或吸樣針）的轉(zhuǎn)動(dòng)，全部按預(yù)定程序自動(dòng)進(jìn)行，一次可進(jìn)行幾十個(gè)或上百個(gè)樣品的分析。進(jìn)樣量可連續(xù)調(diào)節(jié)，進(jìn)樣重復(fù)性高，適合于大量樣品的分析，節(jié)省人力，可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作，但此裝置一次性投資較高。

（三）分離系統(tǒng)是HPLC實(shí)現(xiàn)高效快速分離的核心，由連接管、色譜柱、預(yù)柱（選配）、色譜柱恒溫裝置（選配）等組成。柱效高、選擇性好、分析速度快、性能穩(wěn)定是對(duì)色譜柱的一般要求。1、色譜柱色譜柱是內(nèi)部拋光的不銹鋼柱，一般長(zhǎng)10～15cm，內(nèi)徑2～5mm。色譜柱內(nèi)部填充各種微粒（粒徑3～10μm）填料，又稱(chēng)固定相，是色譜柱的主體。從化學(xué)組成上看，固定相主要有硅膠、氧化鋁、鍵合型硅膠等。

正相鍵合相是指鍵合的有機(jī)分子中含有極性基團(tuán)，最常見(jiàn)的有醚基（-ROR’）、氰基（-CN）、氨基（-NH:）和二醇基（-CHOH-CH2OH）。

反相固定相鍵合的有機(jī)分子是烷基（R）或苯基C6H5-，烷基R的鏈長(zhǎng)是C2～C18等。隨著R碳鏈的增長(zhǎng)，固定相的極性逐漸降低，疏水性逐漸增強(qiáng)。其中最常用的是C18，即十八烷基鍵合硅膠，又稱(chēng)ODS。

離子交換鍵合相分為兩類(lèi)，一類(lèi)是陽(yáng)離子交換固定相，含磺酸基（-SO3H）或羧基（-COOH）；一類(lèi)是陰離子交換固定相，含季銨基（-R4N+）或胺基（-R2N）。硅膠基質(zhì)的化學(xué)鍵合相是目前應(yīng)用最廣的固定相，約占整個(gè)HPLC所用固定相的3/4

。2、保護(hù)柱又稱(chēng)預(yù)柱，是在分析柱的入口端、裝有與分析柱相同固定相的短柱（5～30mm長(zhǎng)），可以經(jīng)常而且方便地更換，起到保護(hù)延長(zhǎng)分析往壽命的作用。保護(hù)柱對(duì)色譜系統(tǒng)的影響基本上可以忽略不計(jì)．所以，即使損失一點(diǎn)柱效也是可取的。

3、色譜柱恒溫裝置提高柱溫有利于降低溶劑黏度和提高樣品溶解度，改變分離度，也是保留值重復(fù)穩(wěn)定的必要條件，特別是對(duì)需要高精度測(cè)定保留體積的樣品分析而言尤為重要。常用的色譜柱恒溫裝置有水浴式、電加熱式和恒溫箱式三種。實(shí)際恒溫過(guò)程中要求最高溫度不超過(guò)100℃，否則流動(dòng)相汽化會(huì)使分析工作無(wú)法進(jìn)行。（四）檢測(cè)器檢測(cè)器用于連續(xù)監(jiān)測(cè)被色譜系統(tǒng)分離后的柱流出物的組成和含量變化的裝置。其作用是將柱流出物的組成和含量變化轉(zhuǎn)化為可供檢測(cè)的信號(hào)，完成定性和定量分析。

通用型檢測(cè)器可連續(xù)測(cè)量色譜柱流出物（包括流動(dòng)相和樣品組分）的全部特性變化，通常采用差分測(cè)量法。包括示差折光檢測(cè)器、電導(dǎo)檢測(cè)器和蒸發(fā)光散射檢測(cè)器等。適用范圍廣，但由于對(duì)流動(dòng)相有響應(yīng)，因此易受溫度變化、流動(dòng)相流速和組成變化的影響，噪聲和漂移都較大，靈敏度較低，一般不能用于梯度洗脫（蒸發(fā)激光散射檢測(cè)器是通用型檢測(cè)器，可用于梯度洗脫）。

專(zhuān)用型檢測(cè)器用以測(cè)量被分離樣品組分某種特性的變化，對(duì)樣品中組分的某種物理或化學(xué)性質(zhì)敏感，而這一性質(zhì)是流動(dòng)相所不具備的，或至少在操作條件下不顯示。包括紫外檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器、安培檢測(cè)器等。靈敏度高，受操作條件變化和外界環(huán)境影響小，并且可用于梯度洗脫操作。但應(yīng)用范圍受到一定的限制。1、紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)器（UV-Vis）簡(jiǎn)稱(chēng)檢測(cè)器，是液相色譜法廣泛使用的檢測(cè)器，它的作用原理是基于被分析試樣組分對(duì)特定波長(zhǎng)紫外光的選擇性吸收，組分濃度與吸光度的關(guān)系遵守朗伯-比爾定律。

特點(diǎn)：1、靈敏度高，最小檢測(cè)濃度可達(dá)10-9g/mL，因而即使是那些對(duì)紫外光吸收較弱的物質(zhì)，也可用這種檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。

2、對(duì)溫度和流速不敏感，可用于梯度洗脫，其結(jié)構(gòu)較簡(jiǎn)單。

3、不適用于對(duì)紫外光完全不吸收的試樣，溶劑的選用受限制（紫外光不透過(guò)的溶劑如苯等不能用）。為了擴(kuò)大應(yīng)用范圍和提高選擇性，可應(yīng)用可變波長(zhǎng)檢測(cè)器。這實(shí)際上就是裝有流通池的紫外分光光度計(jì)或紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)。

4、能獲得分離組分的紫外吸收光譜。即當(dāng)試樣組分通過(guò)流通池時(shí)，短時(shí)中斷液流進(jìn)行快速掃描（停流掃描）,以得到紫外吸收光譜，為定性分析提供信息，據(jù)此選擇最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。2、光電二極管陣列檢測(cè)器（DAD）

圖6-5光電二極管陣列檢側(cè)器光路示意圖

1--光源；2--流通池；3—入射狹縫；4--反射鏡；5--光柵；6--二極管陣列

圖6-6DAD測(cè)定菲的色譜光譜圖

3、熒光檢測(cè)器（FD）是一種很靈敏和選擇性好的檢測(cè)器。具有對(duì)稱(chēng)共軛結(jié)構(gòu)的有機(jī)芳環(huán)分子受紫外光激發(fā)后，能輻射出比紫外光波長(zhǎng)較長(zhǎng)的熒光。熒光檢測(cè)器的靈敏度比紫外檢測(cè)器要高100倍，但它的線性范圍較窄，不宜作為一般的檢測(cè)器來(lái)使用。熒光檢側(cè)器也可用于梯度洗脫。測(cè)定中不能使用可熄滅、抑制或吸收熒光的溶劑作流動(dòng)相。對(duì)不能直接產(chǎn)生熒光的物質(zhì)，要使用色譜柱后衍生技術(shù)，操作比較復(fù)雜。

4、示差折光測(cè)器（DRI）又稱(chēng)拆光指數(shù)檢測(cè)器。是通過(guò)連續(xù)監(jiān)測(cè)參比池與測(cè)量池中溶液的折射率之差來(lái)測(cè)定試樣濃度的檢測(cè)器。是一種通用型的濃度檢測(cè)器。示差折光檢測(cè)器對(duì)溫度的變化很敏感，使用時(shí)溫度變化要求保持在±0.001℃范圍內(nèi)。此檢測(cè)器對(duì)流動(dòng)相流量變化也敏感，要求流動(dòng)相組成完全恒定，稍有變化都會(huì)對(duì)測(cè)定產(chǎn)生明顯影響，因此不宜做梯度洗脫。示差折光檢測(cè)器靈敏度較低，不宜用于痕量分析。5、電化學(xué)檢測(cè)器（ECD）包括電導(dǎo)檢測(cè)器和安培檢測(cè)器。電導(dǎo)檢測(cè)器主要用于離子色譜法。電導(dǎo)檢測(cè)器對(duì)溫度和流速敏感，不能用于梯度洗脫。安培檢測(cè)器用于測(cè)定能氧化、還原的物質(zhì)，靈敏度高。6、蒸發(fā)激光散射檢測(cè)器（ELSD

）是近年新出現(xiàn)的高靈敏度、通用型檢測(cè)器。ELSD是一種質(zhì)量型檢測(cè)器，它可以用來(lái)檢測(cè)任何不揮發(fā)性化合物。

對(duì)流動(dòng)相的組成不敏感，可以用于梯度洗脫。

檢測(cè)靈敏度要高于低波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器和示差折光檢測(cè)器，檢測(cè)限可低至10-10g。消除了溶劑的干擾和因溫度變化而引起的基線漂移，即使用梯度洗脫也不會(huì)產(chǎn)生基線漂移。它還具有死體積小、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。檢測(cè)器性能指標(biāo)性能檢測(cè)器可變波長(zhǎng)紫外吸收折光指數(shù)（示差折光）熒光電導(dǎo)蒸發(fā)激光散射側(cè)量參數(shù)吸光度（AU）折光指數(shù)（RIU）熒光強(qiáng)度（AU）電導(dǎo)率（μs/cm）質(zhì)量（ng）池體積/μL1～103～103～201～3--類(lèi)型選擇型通用型選擇型選擇型通用型線性范圍10510410310410最小檢出濃度／g/mL10-1010-710-1110-3--最小檢出量約1ng約1μg約1pg約1mg0.1~10ng嗓聲（測(cè)量參數(shù)）10-410-710-310-310-3用于梯度洗脫可以不可以可以不可以可以對(duì)流量敏感性不敏感敏感不敏感敏感不敏感對(duì)溫度敏感性低10低2%/℃不敏感（五）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)

高效液相色譜的分析結(jié)果現(xiàn)在廣泛使用色譜數(shù)據(jù)處理機(jī)和色譜工作站來(lái)記錄和處理色譜分析的數(shù)據(jù)。計(jì)算機(jī)的廣泛使用液相色譜操作更加快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、精密和自動(dòng)化，現(xiàn)在已可在互聯(lián)網(wǎng)上遠(yuǎn)程處理數(shù)據(jù)。

計(jì)算機(jī)的用途包括三個(gè)方面：

①采集、處理和分析數(shù)據(jù)；

②控制儀器；

③色譜系統(tǒng)優(yōu)化和專(zhuān)家系統(tǒng)。二、高效液相色譜儀的基本操作（一）準(zhǔn)備1、準(zhǔn)備所需的流動(dòng)相，選用合適的微孔濾膜，抽濾，然后超聲脫氣10～20min。2、根據(jù)待檢樣品的需要更換合適的色譜柱（注意方向）和定量環(huán)。3、配制樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液（也可在平衡系統(tǒng)時(shí)配制），用合適的0.45μm濾膜過(guò)濾。4、檢查儀器各部件的電源線、數(shù)據(jù)線和輸液管道是否連接正常。（二）操作流程1、開(kāi)機(jī)2、排氣3、參數(shù)設(shè)定4、平衡系統(tǒng)5、進(jìn)樣6、數(shù)據(jù)處理7、關(guān)機(jī)三、高效液相色譜儀日常維護(hù)與保養(yǎng)（一）貯液瓶及溶劑處理

1、溶劑使用前都應(yīng)用0.45μm以下的微孔濾膜過(guò)濾后才可使用。

2、在高壓輸液泵的進(jìn)口和它的出口與進(jìn)樣閥之間，應(yīng)設(shè)置過(guò)濾器，過(guò)濾器使用3～6個(gè)月后或出現(xiàn)阻塞現(xiàn)象時(shí)要及時(shí)更換新的，以保證儀器正常運(yùn)行和溶劑的質(zhì)量。

3、用普通溶劑瓶作流動(dòng)相貯液器時(shí)應(yīng)根據(jù)使用情況不定期廢棄瓶子，專(zhuān)用貯液器也應(yīng)定期用酸、水和溶劑清洗（最后一次清洗應(yīng)選用HPLC級(jí)的水或有機(jī)溶劑）(二)高壓輸液泵1、每次使用之前應(yīng)放空排除氣泡，并使新流動(dòng)相從放空閥流出2OmL左右。2、更換流動(dòng)相時(shí)一定要注意流動(dòng)相之間的互溶性問(wèn)題．如更換非互溶性流動(dòng)相則應(yīng)在更換前使用能與新舊流動(dòng)相均互溶的中介溶劑清洗輸液泵。

3、如用緩沖液作流動(dòng)相或一段時(shí)間不使用泵，工作結(jié)束后應(yīng)從泵中用超純水或去離子水洗去系統(tǒng)中的鹽，然后用純甲醇或乙睛沖洗。

4、不要使用存放多日的蒸餾水及磷酸鹽緩沖液；如果應(yīng)用許可，可在溶劑中加入0.0001～0.00lmol/L的疊氮化鈉。

8、泵長(zhǎng)時(shí)間不使用，必須用去離子水清洗泵頭及單向閥，以防閥球被閥座“貓住”，泵頭吸不進(jìn)流動(dòng)相（具體操作可參閱高壓輸液泵使用說(shuō)明書(shū)，最好由維修人員現(xiàn)場(chǎng)指導(dǎo)）。9、柱塞和柱塞密封圈長(zhǎng)期使用會(huì)發(fā)生磨損，應(yīng)定期更換密封圈，同時(shí)檢查柱塞桿表面有無(wú)損耗。

10、實(shí)驗(yàn)室應(yīng)常備密封圈、各式接頭、保險(xiǎn)絲等易耗部件和拆裝工具。5、清洗溶劑過(guò)濾頭的具體方法是：取下過(guò)濾頭→用硝酸溶液（1+4）超聲清洗15min→用蒸餾水超聲清洗10min→用吸耳球吹出過(guò)濾頭中的液休→用蒸餾水超聲清洗10min→用吸耳球吹凈過(guò)濾頭中的水分。清洗后按原位裝上。

6、在線過(guò)濾器的壓帽中的密封環(huán)和不銹鋼燒結(jié)過(guò)濾片清洗。

7、使用緩沖液時(shí)，由于脫水或蒸發(fā)，鹽會(huì)在柱塞桿后部形成晶體，泵運(yùn)行時(shí)這些晶體會(huì)損壞密封圈和柱塞桿，所以應(yīng)該經(jīng)常清洗柱塞桿后部的密封圈。

（三）進(jìn)樣器1、對(duì)六通閥進(jìn)樣器，保持清潔可延長(zhǎng)閥的使用壽命。2、進(jìn)樣前應(yīng)使樣品混合均勻，以保證結(jié)果的精確度。3、樣品瓶應(yīng)清洗干凈，無(wú)可溶解的污染物。4、自動(dòng)進(jìn)樣器的針頭應(yīng)有鈍化斜面，側(cè)面開(kāi)孔；針頭一旦彎曲應(yīng)該換上新針頭，不能弄直了繼續(xù)使用；吸液時(shí)針頭應(yīng)沒(méi)入樣品溶液中，但不能碰到樣品瓶底。

5、為了防止緩沖鹽和其他殘留物留在進(jìn)樣系統(tǒng)中，每次工作結(jié)束后應(yīng)沖洗整個(gè)系統(tǒng)。（四）色譜柱1、流動(dòng)相的方向應(yīng)與柱的填充方向一致。2、在進(jìn)樣閥后加流路過(guò)濾器(0.45μm不銹鋼燒結(jié)片），擋住來(lái)源于樣品和進(jìn)樣閥墊圈的微粒。3、在流路過(guò)濾器和分析柱之間加上“保護(hù)柱”，收集阻塞柱進(jìn)口的來(lái)自樣品的會(huì)降低柱效能的化學(xué)“垃圾”。

4、流動(dòng)相流速不可一次改變過(guò)大，應(yīng)避免色譜柱受突然變化的高壓沖擊，使柱床受到?jīng)_擊，引起紊亂，產(chǎn)生空隙。

5、色譜柱應(yīng)在要求的pH范圍和柱溫范圍下使用。

6、樣品進(jìn)樣量不應(yīng)過(guò)載。

7、應(yīng)使用不損壞色譜柱的流動(dòng)相。

8、每次工作結(jié)束后，應(yīng)用強(qiáng)溶劑（乙睛或甲醇）沖洗色譜柱。柱子不用或貯藏時(shí)，應(yīng)將其封閉貯存在惰性溶劑中（見(jiàn)表6-2）表6-2色譜柱固定相的封存和禁用溶劑固定相硅膠、氧化鋁、正相鍵合相色譜柱反相色譜柱離子交換柱封存溶劑2，2，4-三甲基戊烷甲醇水禁用溶劑二氯代烷烴，酸、堿性溶劑----9、柱子應(yīng)定期進(jìn)行清洗，以防止有太多的雜質(zhì)在柱上堆積（反相柱的常規(guī)洗滌辦法是：分別取甲醉、三氯甲烷、甲醇／水各20倍柱體積沖洗柱子）,

10、色譜柱使用一段時(shí)間后，柱效會(huì)下降，此時(shí)可對(duì)柱子進(jìn)行再生處理（如反相色譜柱再生時(shí)用25mL純甲醇及25mL甲醇-氯仿1:1混合液依次沖洗柱子）。

（五）檢測(cè)器

檢測(cè)器每次使用時(shí)應(yīng)及時(shí)排出流通池中的氣泡。分析前，在柱平衡將完成時(shí)（通常大于30min），再打開(kāi)檢測(cè)器；分析完成后，馬上關(guān)閉檢測(cè)器，以延長(zhǎng)檢測(cè)器的使用壽命。學(xué)習(xí)情景二高效液相色譜法的實(shí)驗(yàn)技術(shù)

一、典型實(shí)例----中過(guò)氧化苯甲酰的測(cè)定（參見(jiàn)教材199頁(yè)）二、樣品預(yù)處理

①定量提取出欲側(cè)定的目標(biāo)組分；

②除去微粒；

③減少干擾雜質(zhì)，改善分離效果；

④濃縮微量的組分；

⑤提高檢測(cè)的靈敏度及選擇性；

⑥有利于色譜柱及儀器的保護(hù)。

三、檢測(cè)器的選擇

不同的測(cè)試目的對(duì)檢測(cè)的要求不同。

檢測(cè)單一組分，理想的測(cè)器應(yīng)僅對(duì)所測(cè)成分響應(yīng)，而其他任何成分均不出峰；

定性分析或是制備色譜，則最好用通用型檢測(cè)器，以便能檢測(cè)到混合物中的各種成分。

定量分析，檢測(cè)器靈敏度越高，最低檢出量越小越好；如果目的是用作制備分離，則檢側(cè)器的靈敏度沒(méi)必要很高。

被測(cè)化合物沒(méi)有足夠的UV生色團(tuán)，考慮使用示差折光檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器、電化學(xué)檢測(cè)器等。

實(shí)在找不到合適的檢測(cè)器，才可以考慮將樣品衍生化為有UV吸收或有熒光的產(chǎn)物，然后再用UV或熒光檢測(cè)。四、分離模式和柱系統(tǒng)選擇圖6-9選擇高效液相色譜分離模式導(dǎo)圖圖6-10油溶性樣品柱系統(tǒng)選擇圖圖6-11水溶性樣品柱系統(tǒng)選擇圖

五、流動(dòng)相選擇（一）流動(dòng)相的基本要求1、黏度較小

2、對(duì)樣品有一定的溶解能力3、與檢測(cè)器相匹配4、與色譜系統(tǒng)的適應(yīng)性5、有足夠的純度

6、有利于樣品的回收7、應(yīng)盡量避免使用具有顯著毒性的溶劑（二）流動(dòng)相的pH值

分析弱酸樣品時(shí)，通常在流動(dòng)相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和1%醋酸溶液；

分析弱堿樣品時(shí)，通常在流動(dòng)相中加入少量弱堿，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和30mmol/L三乙胺溶液。

（三）流動(dòng)相成分選擇

正相色譜中，溶劑的強(qiáng)度隨極性的增強(qiáng)而增加，通常采用烷烴加適量極性調(diào)整劑。

反相色譜的流動(dòng)相通常以水作基礎(chǔ)溶劑，再加入一定量的能與水互溶的極性調(diào)整劑，如甲醇、乙腈等。甲醇-水系統(tǒng)能滿足多數(shù)樣品的分離要求，且粘度小、價(jià)格低，是反相色譜最常用的流動(dòng)相。（四）流動(dòng)相的濾過(guò)

溶劑使用前經(jīng)0.45μm濾膜濾過(guò)，以除去雜質(zhì)。用濾膜過(guò)濾時(shí)，特別要注意分清有機(jī)相濾膜和水相濾膜。對(duì)于混合流動(dòng)相，可在混合前分別濾過(guò)，如需混合后濾過(guò)，首選有機(jī)相濾膜。（五）流動(dòng)相的脫氣

流動(dòng)相必須先脫氣，否則容易產(chǎn)生氣泡，影響泵的正常工作。超聲脫氣比較好，20分鐘的脫氣時(shí)間基本上就夠了。（六）流動(dòng)相的制備

用高純度的試劑配制流動(dòng)相，水應(yīng)為新鮮制備的高純水。凡規(guī)定pH值的流動(dòng)相應(yīng)使用精密pH計(jì)進(jìn)行調(diào)節(jié)。應(yīng)配制足量的流動(dòng)相備用。（七）流動(dòng)相的貯存

流動(dòng)相一般貯存于玻璃、聚四氟乙烯或不銹鋼容器內(nèi)，不能貯存在塑料容器中。貯存容器一定要蓋嚴(yán)，防止溶劑揮發(fā)引起組成變化，也防止氧和二氧化碳溶入流動(dòng)相。磷酸鹽、乙酸鹽緩沖液很易長(zhǎng)霉，應(yīng)盡量新鮮配制使用。（九）流動(dòng)相選擇步驟

第一步，由強(qiáng)到弱。

一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或緩沖溶液)進(jìn)行試驗(yàn)，這樣可以很快地得到分離結(jié)果，然后根據(jù)出峰情況調(diào)整有機(jī)溶劑(乙腈或甲醇)的比例。

第二步，三倍規(guī)則。每減少10%的有機(jī)溶劑(甲醇或乙腈)的量，保留因子約增加3倍，此為三倍規(guī)則。調(diào)整的過(guò)程中，注意觀察各個(gè)峰的分離情況。

第三步，粗調(diào)轉(zhuǎn)微調(diào)。當(dāng)分離達(dá)到一定程度，應(yīng)將有機(jī)溶劑10%的改變量調(diào)整為5%，并據(jù)此規(guī)則逐漸降低調(diào)整率，直至各組分的分離情況不再改變。

六、定性和定量方法（一）定性方法1、用已知標(biāo)準(zhǔn)樣品定性

被測(cè)化合物的保留值仍與標(biāo)樣的保留值一致，就能進(jìn)一步證實(shí)被測(cè)化合物與標(biāo)樣為同一化合物。2、檢測(cè)器的相對(duì)響應(yīng)

可將兩種檢測(cè)器（例如紫外吸收與熒光檢測(cè)器或紫外吸收與示差折光檢測(cè)器）串聯(lián)或分別使用，同一種化合物在兩個(gè)檢測(cè)器上的響應(yīng)比，在相同的條件下應(yīng)當(dāng)是相同的。

對(duì)于紫外檢測(cè)器，樣品與標(biāo)樣兩個(gè)不同波長(zhǎng)的響應(yīng)比相同，即可確認(rèn)它們?yōu)橥晃镔|(zhì)。3、利用紫外檢測(cè)器全波長(zhǎng)掃描功能定性

全波長(zhǎng)掃描紫外檢測(cè)器可以根據(jù)被檢測(cè)化合物的紫外光譜圖