雙歧桿菌在家畜疾病防治中的研究與應用

雙歧桿菌（Bifidobacterium）是由Tissier首次從母乳喂養(yǎng)的嬰兒糞便中分離，隸屬于放線菌門放線菌綱雙歧桿菌目雙歧桿菌科雙歧桿菌屬。雙歧桿菌是人和動物腸道的優(yōu)勢菌群，其豐度受年齡、健康狀況和飼喂方式等因素影響。在家畜幼齡時期，雙歧桿菌豐度較高，隨著年齡增加，豐度逐漸降低。雙歧桿菌可與病原微生物競爭腸道內的營養(yǎng)物質，或通過與其他微生物菌群互作來抑制病原菌的增殖和粘附，或通過誘導宿主免疫應答來維持腸道內環(huán)境的穩(wěn)定，從而改善腸道健康。雙歧桿菌是人和動物腸道疾病防治和食品科學領域研究的熱點，近年研究表明，雙歧桿菌在改善人和動物健康過程中發(fā)揮至關重要的作用。目前雙歧桿菌制劑已經廣泛應用于食品、美容保健、醫(yī)藥、飼料添加劑等領域，在動物疾病防治中也得到了廣泛應用。雙歧桿菌可改善家畜腸道健康、提高飼料轉化率、調節(jié)機體免疫功能等。本文就雙歧桿菌的種屬分類、在家畜疾病防治防治中的作用機理及研究和應用進行綜述，為雙歧桿菌的開發(fā)和利用提供依據。1雙歧桿菌的種屬分類1.1雙歧桿菌的生物學特性雙歧桿菌為革蘭陽性菌，無運動性、不產孢、不耐酸、厭氧。雙歧桿菌的生理特性包括過氧化氫酶陰性，對氧敏感，GC含量高，對生長條件要求苛刻，最適生長溫度為37～41℃，最適生長pH為6.5～7.0。其菌落形態(tài)多光滑，有凹凸且完整的邊緣，顏色為乳白色到白色；其細胞呈桿狀，末端分叉呈V形或Y形。在不利的生長條件下，其細胞形態(tài)表現出高度的多形性。研究表明，培養(yǎng)基中的N-乙酰葡萄糖、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸和Ca2+濃度等對雙歧桿菌的細胞形態(tài)產生影響。雙歧桿菌的碳水化合物分解代謝途徑不同于乳酸菌的同型發(fā)酵或異型發(fā)酵，而是通過特殊的雙歧支路代謝途徑，即果糖-6-磷酸途徑發(fā)酵，終產物為乙酸和乳酸，兩者摩爾比為3:2，還產生少量的甲酸和乙醇，不產生CO2、丙酸和丁酸。上述代謝途徑是由于雙歧桿菌缺乏醛縮酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶而含有果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶（F6PPK），該酶在雙歧桿菌支路代謝中發(fā)揮著重要作用，因此F6PPK基因也可以作為雙歧桿菌分類鑒別的工具。1.2雙歧桿菌分類根據《伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊》（2012）中，雙歧桿菌隸屬于細菌域放線菌門放線菌綱雙歧桿菌目雙歧桿菌科雙歧桿菌屬。雙歧桿菌屬有32個種、9個亞種，來源于人類腸道、口腔、食物、動物胃腸道、昆蟲腸道和污水等。最近，有相關文獻報道從靈長類動物的糞便樣本發(fā)現了新型雙歧桿菌。動物源性菌株主要從豬、牛、羔羊、雞、兔子等家畜禽的糞便中分離（見表1）。表1動物源性雙歧桿菌分類和來源雙歧桿菌傳統(tǒng)分類和鑒定主要是依據表型方法，包括細胞形態(tài)、菌落形態(tài)、有無芽孢、運動性、革蘭氏染色、營養(yǎng)需求、糖發(fā)酵、代謝產物等。該類方法不能將雙歧桿菌與其他產乳酸細菌或乳酸桿菌完全區(qū)分開來。此外，有的雙歧桿菌無法培養(yǎng)，其表型分析缺乏可靠和明確的結果。更重要的是，有些雙歧桿菌菌株基因序列高度一致，但表型發(fā)生了變異。隨著遺傳學和分子生物學的迅猛發(fā)展，基于核酸基因型的方法也被廣泛用于雙歧桿菌的檢測與鑒定。在細菌染色體中，16SrRNA，23SrRNA和5SrRNA基因較保守，其中16SrRNA基因普遍用于細菌的分類鑒定的依據，被認為是細菌分類鑒定的金標準。研究者普遍使用16SrRNA基因序列對雙歧桿菌進行系統(tǒng)發(fā)育分析，此外，基于雙歧桿菌16SrRNA基因序列設計的特異性PCR引物，還可用于雙歧桿菌的快速鑒別和定量。相關研究表明雙歧桿菌屬的各個種或亞種的16SrRNA基因具有高度相似性，在鑒別雙歧桿菌屬內的各個種或亞種中的分辨率較低為了克服這些技術的局限性，與單基因相比，依賴于多個保守分子標記，例如clpC、dnaB、dnaG、dnaJ1、purF和rpoC基因，還有tuf、recA、hsp60、groEL、groES和編碼蘇氨酸-tRNA連接酶（thrS）的多基因方法被證明在物種區(qū)分及系統(tǒng)發(fā)育分析方面更可靠。但這些基因僅能應用于有限的物種。近年來，全基因組測序技術正在逐漸取代傳統(tǒng)的微生物分型和表征方法，基于基因組水平可對雙歧桿菌物種進行精確的分類、分型及系統(tǒng)發(fā)育分析，還可揭示了雙歧桿菌代謝機制及其與相應宿主之間的聯(lián)系。2雙歧桿菌防治腸道疾病的作用機理雙歧桿菌耐受過胃腸道不利因素后，與腸上皮細胞粘附并定植于大腸；雙歧桿菌代謝產物、腸道微生物及宿主腸道相互作用，保護腸道上皮屏障，調控腸道微生態(tài)平衡，促進腸道健康。2.1雙歧桿菌在腸道內的分布區(qū)域雙歧桿菌在耐過胃腸道多種因素（如胃中的酸性pH值、胃酶、膽汁、胰酶）后，主要定植于哺乳動物的結腸。連續(xù)給大鼠灌胃長雙歧桿菌BBMN687d后，采集糞便并檢測其菌體情況，結果表明，長雙歧桿菌BBMN68在胃和小腸中存活率均較低，在結腸和直腸中存活率較高并可在結腸中進行增殖，這是由于結腸可以分泌碳酸氫鹽，使大腸液呈堿性（pH8.3～8.4），并且結腸中適宜溫度及緩慢的運動給雙歧桿菌提供了一個適宜的棲息場所，這與Taverniti等研究的結果一致。2.2雙歧桿菌與腸道上皮細胞的相互作用腸上皮細胞是腸道黏膜屏障的重要組成部分，通過產生物理屏障及化學屏障將共生微生物和宿主免疫系統(tǒng)隔開，從而維持兩者在腸道內的共生關系。另一方面，雙歧桿菌是哺乳動物腸道中的共生菌，大部分附著于大腸的腸上皮細胞。雙歧桿菌物種多樣，即使同種雙歧桿菌，粘附機制也存在顯著的差異。在短雙歧桿菌UCC2003中，IVb型緊密粘附菌毛（Tad）是一種重要且保守的宿主定植因子；轉醛縮酶是兩歧雙歧桿菌表面蛋白質，具有粘蛋白結合蛋白的作用，即促進菌株對HT29細胞的粘附；兩歧雙歧桿菌ATCC15696胞外唾液酸酶與粘蛋白碳水化合物上唾液酸低聚糖和血型A抗原的α2,6鍵相互作用，增強了兩歧雙歧桿菌與黏膜表面的粘附；最近一項研究表明，由長雙歧桿菌BBMN68菌毛產生的菌毛亞基蛋白（FimM）可作為一種新的表面粘附素，可介導BBMN68與粘蛋白、纖連蛋白和纖維蛋白原的粘附。雙歧桿菌在粘附并定植于宿主腸道后，可促進腸道健康。雙歧桿菌在豬腸上皮細胞系（PIE細胞）中的免疫調節(jié)活性研究表明，嬰兒雙歧桿菌MCC12和短雙歧桿菌MCC1274能夠增加PIE細胞中干擾素-β（IFN-β）的產生，以響應豬輪狀病毒感染。同時，在輪狀病毒感染之前用IFN-β治療新生小牛和小豬，可抑制病毒復制并降低疾病嚴重程度。此外，兩種雙歧桿菌都增加了趨化因子（CXCL10）和白細胞介素（IL-6）的表達。這表明，雙歧桿菌菌株通過模式識別受體信號來調節(jié)豬腸道上皮細胞的輪狀病毒免疫反應。在另一項研究中，短雙歧桿菌MCC-117能夠有效調節(jié)豬腸上皮（PIE）細胞系中產腸毒素大腸桿菌（ETEC)引發(fā)的炎癥反應。雙歧桿菌還可刺激回腸上皮中Toll樣受體2（TLR-2）和環(huán)氧化酶-2（COX-2）的表達并阻斷細胞因子誘導的細胞凋亡，通過該分子機制減少黏膜損傷并保持腸道完整性。2.3雙歧桿菌與腸道其他微生物的相互作用腸道菌群是一個包含多種微生物集合的自然環(huán)境。不同物種之間通過生長空間、結合受體位點、獲取胃腸道營養(yǎng)資源的競爭等來決定了腸道微生物群的穩(wěn)態(tài)。雙歧桿菌通過菌株特異性拮抗機制競爭性排除病原體。長雙歧桿菌長亞種和嬰兒亞種可以通過阻止盲腸中志賀毒素的產生或志賀毒素從腸腔轉移到血液中來防止大腸桿菌O157:H7的致命感染。嗜熱雙歧桿菌RBL67可導致沙門氏菌毒力基因表達失衡從而降低其對宿主的感染率，還可抑制沙門氏菌鞭毛基因的表達來降低其運動性從而抑制沙門氏菌的定植。飼喂雙歧桿菌可改變宿主腸道菌群的組成。給小鼠灌胃兩歧雙歧桿菌MIMBb23sg5d后，對小鼠腸道進行微生物組進行分析。結果表明，兩種阿克曼氏菌的豐度增加了。小型豬飼喂嗜熱雙歧桿菌RBL67和低聚果糖(FOS)發(fā)現，豬盲腸和結腸中雙歧桿菌數量顯著增加。一項研究評估了長雙歧桿菌BB536對具有15種人類腸道微生物群的無菌小鼠腸道環(huán)境的調節(jié)作用。研究發(fā)現補充長雙歧桿菌BB536菌株可改變腸道微生物群落結構，從而改變腸腔內生物素和丁酸鹽的代謝。2.4雙歧桿菌產生的生物活性物質與宿主相互作用雙歧桿菌可產生短鏈脂肪酸、吲哚、細胞外囊泡、細胞外蛋白、細菌素等代謝產物，這些物質可抑制病原體粘附，保護腸道上皮屏障，并增強緊密連接的表達。短鏈脂肪酸（SCFA）是腸道微生物發(fā)酵膳食纖維和抗性淀粉的最終產物，包括醋酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽等，是維持腸道穩(wěn)態(tài)的重要代謝物。首先，醋酸是腸道中最豐富的SCFA，由糖酵解產生的乙酰輔酶A產生；有研究表明，長雙歧桿菌長亞種JCM1217T、長雙歧桿菌嬰兒亞種157F、長雙歧桿菌長亞種NCC2705內的果糖及其ATP結合盒ABC型碳水化合物轉運蛋白在很大程度上促成了醋酸鹽的產生，醋酸鹽在宿主結腸上皮細胞中介導抗凋亡和抗炎反應，從而保護小鼠免受O157誘導的死亡。丙酸鹽作為肝臟糖異生的前體，影響細胞分化，對腸道炎癥和癌癥發(fā)展具有潛在的促進健康的作用。丁酸鹽是結腸上皮細胞的首選能量來源，有助于維持腸道屏障功能，并具有免疫調節(jié)和抗炎特性。利用菊粉型果聚糖(ITF)和阿拉伯木聚糖低聚糖(AXOS)等益生元來刺激結腸中雙歧桿菌的生長，同時也增加了結腸細菌中丁酸鹽的產生。吲哚是含有色氨酸酶的細菌產生的，而腸道中共生微生物群有助于在腸腔中產生大量吲哚，該類物質可促進結腸內皮細胞中緊密連接和粘附連接相關分子的表達從而增強結腸上皮屏障功能。長雙歧桿菌嬰兒亞種利用人乳寡糖可產生色氨酸代謝物吲哚-3-乳酸(ILA)，吲哚-3-乳酸(ILA)通過激活腸上皮細胞中的芳烴受體(AhR)和下游核因子紅細胞衍生2樣2(Nrf2)通路來降低腫瘤壞死因子-α(TNF-α)誘導促炎細胞因子白細胞介素-8（IL-8）的產生，從而降低腸上皮細胞的炎癥。細胞外囊泡是由細菌釋放的一種脂質雙層納米結構的細胞外顆粒，主要由蛋白質、核酸、脂質、脂多糖組成。一項研究中，兩歧雙歧桿菌LMG13195的細胞外囊泡可激活樹突狀細胞以促進調節(jié)性T細胞（Treg）細胞的分化并誘導比干擾素γ（IFNγ）、TNF-α和白細胞介素-17（IL-17）促炎細胞因子更高水平的白細胞介素-10（IL-10），結果表明雙歧桿菌LMG13195細胞外囊泡可作為過敏原特異性免疫治療的潛在佐劑。另一項研究證實了是由長雙歧桿菌KACC91563胞外囊泡分泌的胞外溶質結合蛋白通過肥大細胞特異性凋亡有效緩解食物過敏癥狀。此外，長雙歧桿菌NCC2705胞外囊泡還分泌粘蛋白結合蛋白，該蛋白可以粘附到宿主黏膜表面從而促進長雙歧桿菌在胃腸道中的定植。細菌素是由核糖體合成的抗菌肽，可抑制腸道病原體，促進腸道健康。雙歧桿菌細菌素具有潛在的重要意義和價值，但由于雙歧桿菌培養(yǎng)時間、培養(yǎng)方式的影響，只有少數雙歧桿菌細菌素進行深入研究。研究表明雙歧桿菌素B由兩歧雙歧桿菌NCFB1454產生，對李斯特菌、腸球菌、葡萄球菌、梭菌和芽孢桿菌具有抗菌活性；嬰兒雙歧桿菌BCRC14602產生的雙歧素I，其抗菌譜廣，對革蘭氏陽性細菌如鏈球菌、葡萄球菌和梭狀芽孢桿菌，以及革蘭氏陰性菌如沙門氏菌、志賀氏菌和大腸桿菌等具有抑制作用。2.5雙歧桿菌調控腸道內穩(wěn)態(tài)的可能機制雙歧桿菌可調節(jié)腸道菌群平衡，KatoS等研究發(fā)現，兩歧雙歧桿菌G9-1能夠抑制大腸桿菌的過度增殖并恢復空腸絨毛長度，改善菌群生態(tài)失調，進而緩解腹瀉癥狀。另一研究也表明BBG9-1可顯著抑制5-氟尿嘧啶誘導的小鼠腸道內厚壁菌門豐度的降低和擬桿菌門豐度的相應增加。這表明，BBG9-1通過減少生態(tài)失調來抑制繼發(fā)性炎癥，從而預防5-氟尿嘧啶誘導的腸道黏膜炎。最近一項研究發(fā)現，長雙歧桿菌胞外分泌蛋白即長雙歧桿菌溶菌酶樣蛋白是一種抗菌肽，具有抗菌活性；通過16SrRNA基因高通量測序結果顯示，經長雙歧桿菌溶菌酶樣蛋白處理后，厚壁菌門相對豐度增加而變形菌門的相對豐度降低。結果表明，長雙歧桿菌溶菌酶樣蛋白參與了腸道微生物群的調節(jié)。3雙歧桿菌在家畜疾病防治中的研究和應用腹瀉的發(fā)生可由病原微生物感染引起，同時，應激、日糧、衛(wèi)生條件等因素也會改變胃腸道菌群結構，導致病原菌成為優(yōu)勢菌群，有益菌減少。在動物腹瀉相關疾病的預防中，常在飼料添加劑中添加雙歧桿菌等益生菌，提高動物飼料轉化率、改善機體免疫、調節(jié)腸道微生態(tài)平衡。3.1防治畜禽腹瀉腹瀉是由于細菌、病毒、寄生蟲等多種因素引起腸道感染的一種臨床癥狀，可導致幼齡哺乳動物嚴重脫水、電解質紊亂并繼發(fā)一系列的并發(fā)癥后死亡，給畜牧業(yè)生產造成巨大的經濟損失。CizeikieneD等研究發(fā)現B.pseudolongumDSM20099和B.animalisDSM20105菌株在發(fā)酵過程中產生乳酸、乙酸、抗菌肽等化合物，可降低細胞質的pH值從而抑制病原微生物的生長。同時，許多研究也表明,雙歧桿菌可緩解產腸毒素大腸桿菌ETEC、鼠傷寒沙門菌引起的腹瀉。KangJY等研究證明長雙歧桿菌可增加干擾素IFN-α、IFN-β的水平和干擾素誘導型抗病毒效應物的基因表達從而在體外和體內有效抑制輪狀病毒復制。另一項研究表明長雙歧桿菌BORI細胞提取物中的低分子量和非蛋白質成分在抗輪狀病毒作用中發(fā)揮重要作用。3.2促進畜禽的生長發(fā)育在動物腹瀉相關疾病的預防中，許多研究表明，新生犢牛和仔豬口服假長雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌或B.globosum可以使體重增加、提高飼料轉化率并降低腹瀉發(fā)生的頻率及死亡率。Abdel-MoneimAE和El-MoneimAEEA的研究都評估了卵內注射雙歧桿菌對肉雞性能、回腸組織形態(tài)測定的影響，結果都表明所有治療組的體重增加和飼料轉化率都有顯著改善及回腸組織形態(tài)中絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度比值顯著升高。大量文獻也證明了雙歧桿菌可以提高機體免疫力