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文檔簡介
ICS 67.120.30B
50DB13
of
diagnosis
streptococcicosis
河北省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局
DB13/T
1778—2013前 言本標準按照GB/T
1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標準由河北省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局提出。本標準起草單位:河北省水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治監(jiān)測總站。薛政。IDB13/T
1778—2013魚類鏈球菌病診斷技術(shù)規(guī)范1
范圍本標準規(guī)定了魚類鏈球菌病的診斷方法。本標準適用于魚類鏈球菌病病原菌的鑒定及本病的流行病學(xué)調(diào)查、診斷、檢疫和監(jiān)測。2
規(guī)范性引用文件件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T
食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗
染色法、培養(yǎng)基和試劑GB/T
6682 分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法3
術(shù)語和定義3.1
下列術(shù)語和定義適用于本文件。病原菌鏈球菌(Streptococcus)呈球形或卵圓形,在液體培養(yǎng)基中以成對或鏈狀出現(xiàn);革蘭氏陽性、觸Streptococcus
iniae)、無乳鏈球菌(Streptococcus
agalactiae)、米氏鏈球菌(Streptococcus
millieri)、副乳房鏈球菌(Streptococcus
parauberis)和停乳鏈球菌(Streptococcus
dysgalactiae)。其中海豚鏈球菌和無乳鏈球菌是引起魚類鏈球菌病的主要病原菌。4
設(shè)備和材料設(shè)備和材料包括:a)
恒溫培養(yǎng)箱。b)
顯微鏡:10×~100×。c)
滅菌乳缽。d)
天平:精度
e)
恒溫水浴鍋。f)
帶有熱蓋功能的
PCR
儀。g)
電泳儀。h)
紫外分析儀或紫外觀察燈。i)
滅菌剪刀、鑷子。j)
高壓滅菌器。1DB13/T
1778—20135
培養(yǎng)基和試劑培養(yǎng)基和試劑包括:a)
水:應(yīng)符合
的要求。b)
Todd-Hewitt
肉湯(簡稱
c)
血瓊脂平板:按
GB/T
4789.28
中規(guī)定。d)
75%酒精。e)
革蘭氏染色液:按
中規(guī)定。f)
3%
H2O2
溶液(臨時配制)。g)
Taq
DNA
聚合酶。h)
酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)。i)
瓊脂糖。j)
溴化乙錠(EB)。k)
標準菌株:海豚鏈球菌和無乳鏈球菌標準菌株。l)
dNTP:含
dATP、dCTP、dGTP
和
dTTP
各
10mmol/L。m)
PCR
引物:
為
10μmol/L。其序列如下:E1:
5′-GGACCAATGCCACAAACTCG-3′E2:
5′-TGGAGTATGACGTCCACCTTC-3′n)
DNA
分子質(zhì)量標準(Marker)。o)
無水乙醇:使用前預(yù)冷至-20℃。6
診斷步驟6.1 活動情況觀察或間斷地狂游、翻滾、轉(zhuǎn)圈。6.2 外部檢查部有出血現(xiàn)象;體表有
l
處或多處隆起,尤以尾部為多見,隆起部位出血或潰瘍。6.3 解剖檢查患病魚腦部充血,有出血點;肝臟腫大、出血,或脂肪變性、褪色;脾臟腫大,呈暗紅色;膽囊、腎臟腫脹;胃腸或腹腔積水,腸壁充血發(fā)炎。6.4 病原菌的實驗室常規(guī)鑒定6.4.1 涂片檢查用
75%酒精棉球擦拭魚體,在無菌條件下取樣品魚的腦、腎、肝、脾等器官的小塊組織,在潔凈載玻片上涂片,風(fēng)干后,革蘭氏染色(按
中的規(guī)定)后鏡檢。如見紫色球菌則表明病料中可能含有鏈球菌。2用無菌生理鹽水稀釋至10
CUF/mL(約麥氏比濁度0.4),按
用無菌生理鹽水稀釋至10
CUF/mL(約麥氏比濁度0.4),按
的方法提取細菌DNA做為PCR反6.4.2 病原菌分離培養(yǎng)脂平板。
25g
滅菌的
THB
培養(yǎng)
24h
士
48h
士
后觀察。6.4.3菌落形態(tài)和顯微鏡觀察直徑大小為
6.4.4 病原菌生化鑒定
菌落接種于營養(yǎng)肉湯(見附錄A.2)于10℃培養(yǎng)48h,觀察是否生長??设b定為鏈球菌。6.5病原菌的聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)方法鑒定本方法與6.4的方法可任選其一。6.5.1取樣解剖待檢樣品魚,取腦、腎、肝和脾組織約
1.0g,于滅菌乳缽中充分研磨,
再加
TE
(見附錄
A.3)混勻,
然后將組織懸液轉(zhuǎn)入無菌離心管中。6.5.2 模板
DNA
取組織懸液
90μL
于
1.5mL
10μL(10
37
℃水浴
1
h。加入蛋白酶
K
5μL(20
mg/mL),
37
1h,加入
RNA
酶
10μL(10
37
℃水浴
30min,加入
苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)混合液抽提
3
次,然后加入預(yù)冷的無水乙醇,
r/min
離心
10min,棄上清,自然干燥,用
TE
PCR
反應(yīng)模板
溶液,4
℃保存。也可以使用能夠達到同種效果的商業(yè)化細菌DNA提取試劑盒。6.5.3 PCR
擴增PCR
反應(yīng)體系
5μL,MgCl2
(25mmol/L)4μL,dNTPs(各
10mmol/L)1μL,E1、E2
引物(10μmol/L)各
1μL,Taq
DNA
聚合酶(5U/μL)0.5μL,模板
DNA
溶液
雙蒸水
35.5μL。PCR
反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性
5
min;94℃變性
1
min,58℃退火
45
s,72℃延伸
1min,共
35
循環(huán);72℃延伸
min,最后
每次反應(yīng)應(yīng)設(shè)立陽性對照、陰性對照和空白對照。將海豚鏈球菌或無乳鏈球菌標準菌株分別接種于THB增菌液中,28℃培養(yǎng)18h~24h,搖勻后取1mL,6 8應(yīng)的陽性模板。以DNA提取液代替陰性對照模板。以水替代空白對照模板。3DB13/T
1778—2013PCR
PCR
6.5.4擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳用電泳緩沖液(見附錄
A.4)配制
1.5%的瓊脂糖〔含
0.5μg/mL
EB
溶液〕平板。將平板放入水平電泳槽,使電泳緩沖液剛好沒過膠面。將
6μL
2μL
上樣緩沖液(見附錄
6
品孔,同時加入
DNA
標準分子量(Marker)。5V/cm
電泳約
6.5.5 結(jié)果觀察與判定用紫外分析儀或紫外觀察燈觀察瓊脂糖凝膠;陽性對照樣會在與
639bp
片段的位置出現(xiàn)條帶,陰性對照和空白對照應(yīng)無條帶;如在
639bp
位置出現(xiàn)條帶,則判定為鏈球菌陽性;如在
639bp
位置無條帶,或條帶不在此位置,則判定為鏈球菌陰性。7
綜合判定4DB13/T
1778—2013AA附錄 A(規(guī)范性附錄)試劑配制標準中所用試劑,除特別注明外,均采用分析純試劑。A.1 Todd-Hewitt肉湯(簡稱THB)牛肉膏 5.0g胰蛋白胨20.0g葡葡糖 2.0g碳酸鈉 2.5g氯化鈉 2.0g磷酸氫二鈉(Na24) 0.4g蒸餾水 1000ml將以上各成份混合煮沸,完全溶化,冷卻至室溫后,調(diào)
pH,于
115℃滅菌
10min,最終
pH
為
7.8。A.2 營養(yǎng)肉湯蛋白陳 10g牛肉膏 3g氯化鈉 5g蒸餾水 按上述成分混合,溶解后校正
至7.4,分裝,每瓶,121℃高壓滅菌。A.3 1×TE
1M
Tris-HCl(PH=8.0) 5ml0.5M
EDTA(PH=8.0) 1ml量取以上溶液于
L
后,高溫高壓滅菌;室溫保存。A.4 5×TBE電泳緩沖液Tris 54g硼酸(HBO3
) 27.5gEDTA 2.922g水1000mL用
5mol/L
pH
8.3,用時稀釋
5DB13/T
1778—2013A.5 EB(ethidium
bromide,核酸染色劑)用水配制成
的濃縮液,用時每
10mL
1μL。A.6 上樣緩沖液每水溶液中含溴酚藍0.25g,蔗糖。6DB13/T
1778—2013BB附 錄 B(資料性附錄)鏈球菌(EF-Tu)tuf
基因序列B.1 無乳鏈球菌延伸因子(EF-Tu)tuf基因序列1
tgagcacatc
cttctttcac
gtcaagttgg
61
tcatgaacaa
agttgacctt
gttgatgatg
aagaattgct
tgaattggtt121
ttcgtgacct
tctttcagaa
tacgacttcc
caggtgatga
ccttccagtt181
cagctcttaa
agcacttgaa
ggcgacgaaa
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catcatcatg241
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ccagaaccag
aacgtgatac
tgacaaacct301
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gtggtacagt
tgcttcagga361
gtggtactgt
tcgtgtcaac
gacgaagttg
aaatcgttgg
tattaaagaa421
aagcagttgt
tactggtgtt
gaaatgttcc
gtaaacaact
tgacgaaggt481
acaacgttgg
tgttcttctt
cgtggtgttc
aacgtgatga
aatcgaacgt541
ttgctaaacc
aggttcaatc
aacccacaca
ctaaatttaa
aggtgaagtt601
ctaaagaaga
aggtggacgt
catactccat
tcttcaacaa
ctaccgtcca661
tccgtacaac
tgacgtaaca
ggttcaatcg
aacttccagc
aggaacagaa721
ctggtgataa
cgttactatc
gaagttgaat
t//B.2 海豚鏈球菌延伸因子(EF-Tu)tuf基因序列1
tgagcacatc
cttctttcac
gtcaagttgg
tgttaaacac61
tcatgaacaa
aattgacctt
gttgatgatg
aagaattgct
tgaattagtt121
tccgtgatct
tctttcagaa
tacgatttcc
caggtgatga
ccttccagtt181
cagctcttaa
agctcttgaa
ggcgatgaaa
aatacgaaga
catcgttatg241
ctactgttga
ttcatacatt
ccagaaccag
aacgtgatac
tgacaaacca301
cagttgagga
tgtattctca
atcactggac
gtggtactgt
tgcttcagga361
gtggtactgt
tcgtgtcaac
gacgaaatcg
aaatcgttgg
tattaaagaa7DB13/T
1778—2013421
aagctatcgt
tactggtgtt
gaaatgttcc
gtaaacaact
tgacgaaggt481
acaacgtagg
tatccttctt
cgtggtgttc
aacgtgacga
aatcgaacgt541
ttgctaaa
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