蛋白質(zhì)相互作用

蛋白質(zhì)相互作用FRETELISA

蛋白質(zhì)芯片SPRITCFRET現(xiàn)象當(dāng)供體熒光分子的發(fā)射光譜與受體熒光分子的吸收光譜重疊，并且兩個分子接近到一定距離（1-10nm）時，就會發(fā)生一種非放射性的能量轉(zhuǎn)移，激發(fā)供體而產(chǎn)生的熒光能量正好被附近的受體吸收，使得供體發(fā)射的熒光強(qiáng)度衰減，受體熒光分子的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。FRET技術(shù)原理以適當(dāng)頻率的光能照射供體,會有效地產(chǎn)生振蕩偶極子,與近處的受體探針的偶極子產(chǎn)生共振。這種偶極子與偶極子之間的相互作用將供體熒光團(tuán)的能量非放射性地轉(zhuǎn)移到受體熒光團(tuán)。對于特定的供體-受體對,供體丟失的能量就是受體得到的能量。Forster顯示這個過程的效率依賴于供體和受體間距離六次冪的倒數(shù):E=1/{1+(R/R0)6}(R0是一半能量發(fā)生轉(zhuǎn)移的距離)，還依賴于染料的光譜特性及它們的相對方向。FRET應(yīng)用FRET技術(shù)已廣泛用于研究胞內(nèi)及跨膜蛋白的磷酸化過程、蛋白質(zhì)在胞內(nèi)的折疊、蛋白質(zhì)之間的相互作用等。將兩種蛋白質(zhì)分別使用CFP／YFP(或BFP／GFP)標(biāo)記，當(dāng)兩者在同一細(xì)胞中表達(dá)時，只要檢測到FRET發(fā)生，則證明兩蛋白質(zhì)問距離小于10nrn，存在相互作用。ELISA原理ELISA的類型1、雙抗體夾心法將已知抗體吸附于固相載體，酶標(biāo)記一抗。檢測液相中的可溶性抗原。ELISA的類型2、間接法將已知抗原吸附于固相載體，酶標(biāo)記二抗。檢測液相中未知抗體。ELISA的類型3、直接法將已知抗體或抗原吸附于固相載體，酶標(biāo)記抗原或抗體檢測液相中的可溶性抗體或抗原。ELISA的類型4、競爭法對照孔：酶標(biāo)抗體測定孔：酶標(biāo)抗體和待測抗體抗原中雜質(zhì)難以去除或抗原結(jié)合，特異性不穩(wěn)定eg:HBV的e抗原很容易轉(zhuǎn)化為核心抗原（29氨基酸差異）顯色強(qiáng)弱與待測抗體的含量成反比5、生物素和親和素標(biāo)記法ELISA的類型檢測抗體生物素化SA標(biāo)記酶ELISA的應(yīng)用ELISA的優(yōu)點及存在的問題高度特異性：保持抗原抗體反應(yīng)的特異性；高靈敏度：酶催化底物顯色的高效性，pg水平微量檢測；定性定量檢測：反應(yīng)液顏色深淺或光密度值；使用方便，有各種各樣的商業(yè)化試劑盒。樣品的干擾物質(zhì)多固相載體的質(zhì)量不統(tǒng)一：原料及制備工藝不一致，不同批號的固相載體有時本底值較高，有時吸附性能差，影響實驗結(jié)果對ELISA法的非特異性難以評價試劑無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)優(yōu)點存在的問題蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片可以用來大規(guī)模篩選蛋白之間的相互作用。將熒光標(biāo)記的探針蛋白與蛋白質(zhì)芯片孵育，洗脫非特異性結(jié)合的蛋白后，可以通過掃描芯片上的熒光點檢測到穩(wěn)定的相互作用蛋白點。1、檢測型蛋白質(zhì)芯片將不同類型的配體，包括抗體、抗原、核酸、肽、有機(jī)小分子、糖類分子或者一些具有高度親和力的特異性識別分子固定在修飾化的固相基質(zhì)表面上，靶標(biāo)蛋白存在于溶液中，用于芯片分析。這類芯片主要用于監(jiān)測靶標(biāo)蛋白的含量、表達(dá)水平、蛋白質(zhì)在細(xì)胞和組織中的分布及對診斷標(biāo)志物的分析，即蛋白質(zhì)表達(dá)譜(定量)的分析。2、功能型蛋白芯片它的識別分子主要是通過高通量的蛋白純化、人工合成多肽或化學(xué)分子制備而成，然后將其點在合適的固相基質(zhì)表面。這類芯片主要適用于蛋白質(zhì)的生化功能以及相互作用研究，如蛋白質(zhì)的結(jié)合特性、酶的催化活性、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄后修飾的研究、小分子藥物和藥物靶標(biāo)的篩選和鑒定等，即蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)及其他分子相互作用譜圖的研究網(wǎng)蛋白質(zhì)芯片的分類蛋白質(zhì)芯片制作的基本流程(1)蛋白質(zhì)芯片在制作過程中實驗條件發(fā)生微小的變化可能引起最后結(jié)果的不同，條件不易控制，實驗結(jié)果可重復(fù)性相對不足。(2)目前用于蛋白質(zhì)芯片制備的固相介質(zhì)(如化學(xué)膜、凝膠和玻片)都存在一些缺點，蛋白質(zhì)在固相基質(zhì)表面的固定往往會造成其解折疊，從而失去生物活性。(3)對結(jié)果的掃描、背景去除、數(shù)據(jù)處理等還不圓滿，會導(dǎo)致假陽性、假陰性的存在。蛋白質(zhì)芯片技術(shù)存在的問題SPR(等離子表面共振技術(shù))SPR原理將誘餌蛋白結(jié)合于葡聚糖表面并固定于納米級厚度的金屬膜上。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)混合物經(jīng)過時，如果有蛋白質(zhì)同“誘餌”蛋白發(fā)生相互作用，那么兩者的結(jié)合將使金屬膜表面的折射率上升，導(dǎo)致共振角度的改變。SPR技術(shù)特點1、無需標(biāo)記，避免了費時而昂貴的純化和標(biāo)記2、實時檢測3、樣品用量少(1ug)4、檢測靈敏度高（C<0.01ng/ml）5、無損傷檢測6、快捷方便需預(yù)先制備傳感器芯片ITCITC（等溫滴定微量熱技術(shù)）是一種監(jiān)測由結(jié)合成分的添加 而引起的任何化學(xué)反應(yīng)的熱力學(xué)技術(shù)，它已經(jīng)成為鑒定生物 分子間相互作用的重要方法。

當(dāng)物質(zhì)相互作用時，熱量要么產(chǎn)生，要么吸收。ITC直接測量生物分子結(jié)合事件中釋放或吸收的熱量，獲得生物分子相互作用的完整熱力學(xué)參數(shù)，包括結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點數(shù)、摩爾結(jié)合焓、摩爾結(jié)合熵、摩爾恒壓熱容，和動力學(xué)參數(shù)(如酶活力、酶促反應(yīng)米氏常數(shù)和酶轉(zhuǎn)換數(shù))。ITCITC獲取的結(jié)果示意圖上圖：峰底與峰尖之間的峰面積為每次注射時釋放或吸收的總熱量。下圖：以產(chǎn)生或吸收的總熱量為縱坐標(biāo)，以加入杯中的兩反應(yīng)物之摩爾比為橫坐標(biāo)作圖，可得整個反應(yīng)過程的結(jié)合等溫曲線。ITC具有的特點1、它不干擾蛋白質(zhì)和核酸的生理功能，具有非特異性的獨特優(yōu)勢，即對被研究蛋白質(zhì)和核酸體系的溶劑性質(zhì)、光譜性質(zhì)和電學(xué)性質(zhì)等沒有任何限制條件。2、樣品用量小,方法靈敏