熊源性成分檢測實時熒光PCR法編制說明

1熊源性成分檢測實時熒光PCR法編制說明一、項目來源根據(jù)內(nèi)蒙古自治區(qū)市場監(jiān)督管理局《內(nèi)蒙古市場監(jiān)督管理局下達的2020年第2批內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標準制修訂項熒光PCR法”的計劃任務(wù)，二連海關(guān)牽頭成立由相關(guān)領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員和具有標準化專業(yè)知識的人員組成的標準起草組，組織實施該標準的制定。起草單位：二連海關(guān)技術(shù)中心，主要起草人：陳少博、王伊琴、楊帆、包勇敢、荊文魁、張志峰、常鴻。二、項目的意義和必要性熊是哺乳綱，食肉目，熊科各種類的通稱。廣泛分布于歐、亞及南北美洲。按照生物學分類熊科動物分5屬8種，分別為熊貓屬Ailuropoda(大熊貓Ailuropodamelanoleuca)，眼鏡熊屬Tremarctos(眼鏡熊Tremarctosornatus)，馬來熊屬Helarctos(馬來熊Helarctosmalayanus)，懶熊屬Melursus(懶熊Melursusursinus)以及熊屬Ursus(棕熊Ursusarctos、美洲黑熊Ursusamericanus、亞洲黑熊Ursusthibetanus和北極熊Ursusmaritimus)。2熊科中熊貓屬的大熊貓是全世界所熟悉的中國國寶，熊屬中的北極熊、亞洲黑熊和棕熊在動物觀賞、制藥方面也具有重要意義，熊膽粉為熊科動物黑熊、棕熊經(jīng)膽囊手術(shù)引流膽汁得到的干燥品。具有清熱解毒、抑菌抗炎、保肝護肝、利膽溶石、降脂降壓、鎮(zhèn)咳平喘、去翳明目、抗疲勞等多方面的藥理功能。熊膽作為中國傳統(tǒng)中醫(yī)藥的主要成分已有兩千多年的應(yīng)用歷史，在人類的肝膽疾病、心腦血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等諸多病癥的治療上，具有獨特的療效。熊科動物具有很高的經(jīng)濟價值和科學研究價值，它的皮毛、肉、脂、掌等在歷史上自古就為獵民用于物資交易的重要產(chǎn)品，由于熊科動物的高額經(jīng)濟回報，在利益的驅(qū)使下違法犯罪活動屢禁不止。打擊違法犯罪活動，保護野生動物資源，在規(guī)范管理和保護執(zhí)法的過程中，必然要對涉及到的熊科動物進行物種鑒定。根據(jù)動物保護名錄，除亞洲黑熊和棕熊外，其余熊屬物種相繼被納入國際自然保護聯(lián)盟組織。熊屬國家一級保護的哺乳動物，嚴禁獵殺食用。為加強對熊屬動物的保護，限制和打擊非法行為，對源自熊的可疑樣品建立一種迅速、便捷、高效的檢測方法，將具有重要的實際意義。這就要求我們在進出口動物及其制品中準確甄別動物源性，從源頭上打擊攜帶、偷運、販賣熊組織制品行為，建立快速、準確的熊源性成分的檢測方法標準勢在必行。因此，我們特申請此項制標任務(wù)。3我國動物源性成分的檢測體系已經(jīng)日臻完善，包括牛、羊、豬、雞等家畜家禽源性檢測標準（國標或行標）已經(jīng)實施，以及林麝、穿山甲等野生動物源性的檢測標準制定已經(jīng)立項。黃羊、草原狼、旱獺等動物源性成分檢測方法標準率先以內(nèi)蒙古的地標立項研制，而熊源性成分的檢測方法目前還是空白，無國家標準、行業(yè)標準和地方標準作為施檢依據(jù)。為保護瀕危野生動物資源，為海關(guān)緝私執(zhí)法提供強技術(shù)支撐，急需申請制定該標準。我們申請制訂“熊源性成分檢測實時熒光PCR方法”標準，將為走私販賣熊的皮毛或其肉、掌制品的鑒定提供了強有力的科學依據(jù)。三、標準的起草過程3.1前期工作項目申請人以及參加人員擁有豐富的科研經(jīng)歷，在動物疫病以及動物源性成分研究領(lǐng)域具備相應(yīng)的學科專業(yè)知識和實驗操作技能，能夠順利實施和完成本項目。項目主持人在動物源性成分檢測方面開展了大量的工作，積累了較多的經(jīng)驗，應(yīng)用普通PCR技術(shù)、實時熒光PCR技術(shù)開展檢測鑒定及定量方法；并在動物基因多態(tài)性方面取得重大突破，有著應(yīng)用分子生物學技術(shù)，檢測動物源性成分有技術(shù)優(yōu)勢。項目承擔單位動物檢疫實驗室是區(qū)域性中心實驗室，負4責本地區(qū)及二連口岸檢疫性動物疫病檢驗檢疫?，F(xiàn)有儀器設(shè)備共計100多臺套，價值1000多萬元人民幣。目前，實驗室所購置的儀器設(shè)備按照自動化、高效化、標準化、高精度化等方向的要求配置，力爭達到國內(nèi)先進水平。儀器設(shè)備包括BioRad凝膠成像系統(tǒng)、DNA凝膠電泳系統(tǒng)、倒置顯微鏡、熒光顯微鏡、低溫培養(yǎng)箱、高速離心機、超速離心機、生物安全柜、酶標儀、液氮罐、基因擴增儀、7500熒光定量PCR儀、全自動核酸提取系統(tǒng)、全自動基因測序儀等。目前已經(jīng)構(gòu)建了畜禽疫病分子生物學快速檢測平臺、動物源性成分檢測平臺。具備開展本項目的硬件設(shè)施條件。承擔單位組織保障措施：承擔單位二連海關(guān)發(fā)揮組織作用，通過有效的協(xié)調(diào)和管理，調(diào)動本單位和參加單位的有效資源，形成對項目強有力的支持。通過組織優(yōu)秀的研究隊伍，并通過中期總結(jié)會、專家研討會等形式督促項目研究工作的順利完成。3.2制訂起草計劃編寫了內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標準項目建議書，申請制標計劃。項目獲批后，制定工作思路和技術(shù)路線。同時制定了標準的計劃和安排。3.2.1根據(jù)試驗研究，起草“熊源性成分檢測實時熒3.2.2.方法驗證、征求意見，2021年3月-2021年125四.制定標準的原則和依據(jù)4部分：試驗方法標準》的規(guī)則編寫。還參照相關(guān)國家標準編寫指南的要求。五.標準內(nèi)容的研究5.1標準的科學性選擇線粒體ND2基因，經(jīng)過序列比對，選擇高度保守的片段做為目的片段。5.1.2標準方法的特異性試驗以同種方法提取等量的犬、綿羊、鼠、牛、鴨、豬、雞、山羊、馬DNA為模版，進行實時熒光PCR檢測，檢測其特異5.1.3標準方法的靈敏性試驗熊DNA做10倍的系列稀釋，分別進行熒光PCR試驗，取6個梯度的NDA濃度，以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)對數(shù)與Ct值做標準曲線。5.1.4標準方法的重復(fù)性試驗重復(fù)性試驗，每次試驗設(shè)3次重復(fù)，共進行3次試驗，計算6批內(nèi)和批間Ct值得變異系數(shù)。5.2標準的實用性：適用未知動物源性制品及走私動物制品中熊源性成分的檢測鑒定，采用的實時熒光PCR（Real-TimePCR）方法。從DNA水平進行動物源性的檢測方法包括普通PCR、實時熒光PCR（Real-TimePCR）、DNA探針雜交、限制性片段長度多態(tài)性擴增（PCR-RFLP）等方法。前兩種較為常用，而PCR-電泳方法在種源鑒定中應(yīng)用較多，與實時熒光PCR技術(shù)相比，其儀器試劑檢測成本較低，但PCR產(chǎn)物需要做凝膠電泳分析，自動化程度低易交叉污染造成假陽性結(jié)果，不能滿足批量、快速、定量檢測需要，因此，以特異性好、靈敏性高引物探針設(shè)計策略已逐步成為肉類及其產(chǎn)品種類鑒別的主要方法。5.3標準的可行性：該方法在人、機、料、法、環(huán)等各方面因素具備的條件下均易實現(xiàn)。具體說就是具有分子生物學基礎(chǔ)的技術(shù)人員的配備、熒光PCR儀、實驗材料是分子生物學實驗材料、方法是特異性好、靈敏度高、重復(fù)性好的熒光PCR方法、和具有分子生物學檢測的實驗室環(huán)境均可滿足實施該標準方法的檢測條件。5.4標準陽性對照的確定采用已知含有熊源性成分的樣品，或經(jīng)測序的陽性質(zhì)7六.方法驗證為驗證本方法的有效性和適用性，選擇3家相關(guān)科研或檢測機構(gòu)，對本方法進行驗證，驗證內(nèi)容為方法的特異性和敏感性。3家驗證單位進行熒光PCR法驗證結(jié)果均符合相關(guān)樣品實際情況。七.重大意見分歧的處理依據(jù)和結(jié)果無八.國內(nèi)外情況簡要說明動物源性的檢測體系已經(jīng)日臻完善，包括牛、羊、豬、雞等家畜家禽標準已經(jīng)實施，以及林麝、穿山甲等野生動物源性的檢測行業(yè)標準制定已經(jīng)立項。國內(nèi)外熊源性成分檢測方法的標準目前還是空白，尚無國家標準、行業(yè)標準或地方熊源性成分檢測方法的標準目前還是空白，無國家標準、行業(yè)標準和地方標準作為施檢依據(jù)。根據(jù)文獻報道尚未發(fā)現(xiàn)內(nèi)蒙古自治區(qū)內(nèi)有相關(guān)單位從事這項研究，因此，急需申請制定該標準。申請制訂“熊源性成分檢測實時熒光PCR法”標準，將為走私販賣熊肉或其制品的鑒定（熊源性成分鑒定）的提供了強有力的科學依據(jù)。九.結(jié)論8綜上所述，本標準在制定過程中所涉及到的各項技術(shù)指標均經(jīng)過方法學的驗證，并切實可行，完全達到了編制標準的要求。十.標準草稿征求意見情況匯總表序號提出單位/專家采納不采納（說明原因）1建議在6實驗方法的適當位置加入“樣品檢測時進行平行樣檢測”沈陽海關(guān)技術(shù)中心/耿慶華采納21.前言部分“GB/T1.1-2009”應(yīng)改為“GB/T1.1-2020”表述為