二代測序原理及報告解讀

1、二代測序二代測序 報告詳細(xì)解讀報告詳細(xì)解讀 二代測序原理擴增擴增復(fù)制復(fù)制邊復(fù)制邊測序邊復(fù)制邊測序 二代測序原理擴擴增增復(fù)復(fù)制制邊復(fù)制邊測序邊復(fù)制邊測序DNA文庫的建立捕獲目標(biāo)片段二代測序 安捷倫捕安捷倫捕 獲試劑盒獲試劑盒illumima測序平臺測序平臺二代測序流程復(fù)雜，參數(shù)繁多需要檢測的基因序列所有堿基數(shù)量之和測序質(zhì)量測序質(zhì)量目標(biāo)區(qū)覆目標(biāo)區(qū)覆蓋度蓋度目標(biāo)區(qū)平目標(biāo)區(qū)平均深度均深度目標(biāo)區(qū)平均深度目標(biāo)區(qū)平均深度20X比例比例99.8%274.6799.7%現(xiàn)在報告中使用的參數(shù)現(xiàn)在報告中使用的參數(shù)檢測到與臨床相檢測到與臨床相關(guān)發(fā)生突變的基關(guān)發(fā)生突變的基因因轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)錄本編號編號Exon編號編號核苷酸核

2、苷酸變化變化氨基酸氨基酸變化變化染色體染色體位置位置測序測序深度深度Hom/Het正常人正常人群群攜帶率攜帶率CLCN2NM_001171088Exon21c.2266CGp.R756Gchr382(0.52)het-同一個基因可有同一個基因可有不同的別名，使不同的別名，使用用Gene數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)庫統(tǒng)一名稱統(tǒng)一名稱同一基因可有同一基因可有不同的轉(zhuǎn)錄本，不同的轉(zhuǎn)錄本，通過通過Gene數(shù)數(shù)據(jù)庫查突變類據(jù)庫查突變類型時必須使用型時必須使用或換算到同一或換算到同一轉(zhuǎn)錄本的突變轉(zhuǎn)錄本的突變點點 外顯外顯子子對對應(yīng)應(yīng)第第幾位點幾位點的堿基的堿基發(fā)生何發(fā)生何種突變種突變對對應(yīng)應(yīng)第第幾

3、位點幾位點氨基酸氨基酸發(fā)生何發(fā)生何種突變種突變該基因該基因所在染所在染色體位色體位置置該位點該位點正常型正常型測序測序深度深度/突變突變型測序型測序深度。深度。（突變型占比，（突變型占比，粗略可認(rèn)為是粗略可認(rèn)為是雜合度雜合度）屬于純屬于純和和(hom)還是雜還是雜合合(het)突變突變反映突反映突變型變型在在正常人正常人攜帶率攜帶率報告結(jié)果中的數(shù)據(jù)意義Panel報告分析的4個主要區(qū)域v檢測結(jié)果v結(jié)果詳細(xì)解讀v基因與疾病介紹v附表（檢測基因附表，選點附表）1.檢測結(jié)果2.結(jié)果具體分析 1）該基因突變致病疾病類型及遺傳方式）該基因突變致病疾病類型及遺傳方式2）該樣本的此處突變是否為致病性突變明確致

4、病和可疑致病可疑致病3）該樣本的突變型最終是否患病2.1 基因變異所致疾病及遺傳方式使用孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫查找基因所致疾病及遺傳方式 多種遺傳方式顯性與隱性遺傳共存在顯性與隱性遺傳共存在不完全顯性不完全顯性2.結(jié)果具體分析1）該基因突變致病疾病類型及遺傳方式2）該樣本的此處突變是否為致病性突變）該樣本的此處突變是否為致病性突變明確致病明確致病和和可疑致病可疑致病3）該樣本的突變型最終是否患病2.2 查找突變位點的致病性使用HGMD數(shù)據(jù)庫查找基因突變報道類型及報道疾病第一個位點明確致病，有過報道第一個位點明確致病，有過報道第一位點致病性不明，僅有過同一個堿基位置，但突變堿基類型不一致第一位點致病性

5、不明，僅有過同一個堿基位置，但突變堿基類型不一致致病不明突變位點的致病性預(yù)測參考ACMG基因突變解讀指南2.結(jié)果具體分析1）該基因突變致病疾病類型及遺傳方式）該基因突變致病疾病類型及遺傳方式2）該樣本的此處突變是否為致病性突變明確致病和可疑致病可疑致病3）該樣本的突變型最終是否患?。┰摌颖镜耐蛔冃妥罱K是否患病2.3 總結(jié)突變與患病的關(guān)系 從遺傳方式看有沒有患病的可能性 從突變類型看有沒有患病的可能性ACMG突變解析指南未報道致病位點，致病可能性的評估指南，節(jié)選其中可能致病性很強致病性很強列表如下：3.基因與疾病背景介紹 基因介紹來自于Gene數(shù)據(jù)庫 疾病介紹來自于OMIM、罕見病數(shù)據(jù)庫或其他外

6、文權(quán)威數(shù)據(jù)庫4.附表1. 檢測基因包基因列表2. 可疑陽性報告，附不明突變致病性預(yù)測指南附表3. 檢測到的其他突變位點（已去掉正常多態(tài)位點） ARAR遺傳病，為單雜合攜帶的，理論不發(fā)病遺傳病，為單雜合攜帶的，理論不發(fā)病 ，尤其致病性不明位點，尤其致病性不明位點 。除非未發(fā)除非未發(fā)現(xiàn)其他與患者癥狀相關(guān)的致病點，可考慮出報告結(jié)果?，F(xiàn)其他與患者癥狀相關(guān)的致病點，可考慮出報告結(jié)果。 與患者當(dāng)前的癥狀不相關(guān)的突變位點。與患者當(dāng)前的癥狀不相關(guān)的突變位點。除非為明確報道的致病突變，會附加額除非為明確報道的致病突變，會附加額外報出。提醒患者或家屬注意此類疾病在以后可能表現(xiàn)出來外報出。提醒患者或家屬注意此類疾病

7、在以后可能表現(xiàn)出來 可能與當(dāng)前癥狀有關(guān)的但又無報道致病性不明的突變位點?？赡芘c當(dāng)前癥狀有關(guān)的但又無報道致病性不明的突變位點。除非未發(fā)現(xiàn)其他典除非未發(fā)現(xiàn)其他典型致病點，可考慮出報告結(jié)果。型致病點，可考慮出報告結(jié)果。注明：僅有在報告結(jié)果中的位點是經(jīng)過一代驗證的，其他選點表中的突變點都是未驗證的。注明：僅有在報告結(jié)果中的位點是經(jīng)過一代驗證的，其他選點表中的突變點都是未驗證的。選點數(shù)據(jù)舉例一肝病一肝病panel 陰性結(jié)果報告，選點數(shù)據(jù)陰性結(jié)果報告，選點數(shù)據(jù)外顯子僅從檢測得到的堿基序列上看，僅從檢測得到的堿基序列上看，完全正常，并為純和序列。完全正常，并為純和序列。內(nèi)含子陰性結(jié)果原因分析陰性結(jié)果原因分析

8、1v該基因上存在雜合性缺失。 解決方案：解決方案： 1.有的公司二代測序同時進(jìn)行大片段突變的特殊計算，給出大片段突變的初步評估，但是仍建議做MLPA的驗證進(jìn)一步確診。 2.若懷疑二代測序?qū)τ谛〉娜笔?重復(fù)在計算上漏檢，若能進(jìn)一步高度懷疑某個致病基因，若有MLPA探針，使用用MLPA方法檢測該基因的大片段突變。 陰性結(jié)果原因分析陰性結(jié)果原因分析2v另一個突變位點在外顯子之外（非編碼區(qū)，內(nèi)含子）解決方案：解決方案： 1.設(shè)計引物時，設(shè)計范圍向外擴展一部分，能夠覆蓋住剪切位點，部分內(nèi)含子，以及調(diào)控區(qū)域。 2.對于panel里面覆蓋的基因，對于報道的常見的非編碼區(qū)的熱點突變，額外加用捕獲引物或用其他方

9、法補齊。陰性結(jié)果原因分析陰性結(jié)果原因分析3v另外一條染色體各種修飾作用異常（DNA甲基化，核小體修飾等） 解決方案：解決方案：對于表觀遺傳，原因很多，部分尚無較好方法檢測?？梢圆榧谆懦徊糠衷?。甲基化組蛋白修飾DNA雙鏈陰性結(jié)果原因分析陰性結(jié)果原因分析4v還要其他尚不明確的致病基因解決方案：解決方案： 家系全外顯子檢測，并配合動物模型，查找新致病基因。陰性結(jié)果原因分析陰性結(jié)果原因分析5v檢測方向或方法有誤 1.考慮疾病方向有誤：可能為染色體病，可能不是基因病 2.檢測目的基因范圍有誤，致病基因在檢測項目中未被覆蓋。比如患者實際為線粒體疾病，選做神經(jīng)肌肉病panel則存在部分線粒體疾病相關(guān)基因漏檢。 3.檢測方法有誤：比如脆性X綜合征，脊髓小腦共濟失調(diào)，需用片段分析方法檢測其核苷酸重復(fù)序列解決方案：解決方案：臨床醫(yī)師重新評估病情： 1. 是否需要做染色體檢測 2. 是否某些特殊疾病需要用特殊方法檢測 3. 是否患者疾病的致病基因不在已做的基因panel里面,是否需要進(jìn)一步做其他的基因檢測項目。陰性結(jié)果原因分析陰性結(jié)果原因分析6v二代測序覆蓋度100%最佳。但不可避免會有極小部分未被捕獲檢測到的區(qū)域解決方案：