馬腸道乳酸菌的篩選及益生功能鑒定技術(shù)規(guī)程

1馬腸道乳酸菌的篩選及益生功能鑒定技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了馬腸道乳酸菌菌株篩選及益生功能鑒定的規(guī)范性引用文件以及相關(guān)定義、材料及技術(shù)操作規(guī)程。本文件適用于馬腸道乳酸菌的篩選及益生功能鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T4789.28食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求GB/T4789.35食品國家安全標(biāo)準(zhǔn)食品微生物檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB20287農(nóng)業(yè)微生物菌劑GB/T34224生物產(chǎn)品中功能性微生物檢測SN/T1538.1培養(yǎng)機(jī)制備指南第1部分：實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基制備質(zhì)量保證通則動物病原微生物菌種保藏管理辦法（2008年11月4日農(nóng)業(yè)部令第16號公文，農(nóng)業(yè)部令2016年第3號修訂）3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1乳酸菌Lacticacidbacteria，LAB能夠利用且可發(fā)酵碳水化合物并產(chǎn)生大量乳酸的一類能被革蘭氏染色成紫色（陽性）的細(xì)菌的統(tǒng)稱，在馬匹養(yǎng)殖中可作為飼料添加劑和養(yǎng)殖場除臭劑。3.2同源性比對Homologycomparison為確定各個序列之間的同源性，而其進(jìn)行序列比對，檢測序列之間的相似性，從而發(fā)現(xiàn)生物序列中的功能、結(jié)構(gòu)和進(jìn)化信息的相同或差異的一種分析方法。24材料4.1乳酸菌的來源從馬腸道內(nèi)容物和馬腸道黏膜中分離的乳酸菌。5操作規(guī)程5.1菌株指示菌：傷寒沙門氏菌（SalmonellatyphimuriumCMCC（B）50071）、大腸埃希氏菌（EscherichiacoliATCC25922）、金黃色葡萄球菌（StaphylococcusaureusCMCC（B）26003），購自于中國普通微生物菌種保藏管理中心。試驗(yàn)菌：從馬腸道內(nèi)容物和馬腸道黏膜中分離的乳酸菌。5.2儀器設(shè)備Biolog自動微生物鑒定系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)、科研正置顯微鏡、電熱恒溫水槽、多功能酶標(biāo)儀、恒溫培養(yǎng)箱、PCR儀、pH計(jì)、純水機(jī)、厭氧培養(yǎng)箱、高速離心機(jī)、電子天平。5.3試劑MRS肉湯、NH、MRS瓊脂培養(yǎng)基、MH肉湯、葡萄糖、生理鹽水、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、DL2000DNAMarker、膽鹽、鹽酸、瓊脂粉、溴甲酚紫、甘油、革蘭氏染色液試劑盒、石蕊牛奶培養(yǎng)基、哥倫比亞CNA血瓊脂平板、乳酸菌成套生化鑒定管、人工腸胃液、成套抗生素紙片。5.4耗材96孔板、0.22μm濾膜、牛津杯、2mL離心管。5.5溶液配置見附錄A。5.6乳酸菌的分離、純化及保藏5.6.1乳酸菌的分離馬腸道內(nèi)容物稱取1g于裝有9mLPBS溶液的試管中，混勻制備成內(nèi)容物分離原液（濃度定為10-1）。同時(shí)，用生理鹽水清洗馬腸道，使用攪碎機(jī)將馬腸道破碎，破碎后倒入裝有PBS緩沖液及玻璃珠的三角瓶中振蕩后，吸取1mL混樣于裝有9mLPBS溶液的試管中，制備成黏膜分離原液（濃度定為10-1）。隨后，分別吸取1mL各分離原液，依次按照10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-66個梯度進(jìn)行稀釋。分別用移液槍吸取三個梯度（內(nèi)容物為10-5~10-7，黏膜為10-3~10-5）200μL樣本稀釋液用無菌涂層棒均勻涂抹到含有溴甲酚紫的MRS固體培養(yǎng)基中后，在37℃恒溫厭氧培養(yǎng)工作站中倒置培養(yǎng)24~36h。35.6.2純化與保藏用接種環(huán)挑取菌落周圍顯示黃色的單菌落在MRS平板上反復(fù)劃線純化，37℃厭氧條件下培養(yǎng)24h。將純化的單菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)繁后，加入80%的滅菌純甘油，震蕩混勻，-80℃冰箱保藏。5.7乳酸菌石蕊牛奶顯色使用96孔板，吸取20μL乳酸菌菌（1x10-8CFU/mL）懸液于200μL石蕊牛奶培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后，挑選能夠使石蕊牛奶培養(yǎng)基呈粉色凝乳狀態(tài)的菌株。5.8乳酸菌產(chǎn)酸指標(biāo)調(diào)試菌液的麥?zhǔn)蠞岫葹?.5，且體積比以1:10將菌懸液加入空白MRS液體培養(yǎng)基中，厭氧37℃培養(yǎng)，使用pH計(jì)測定pH值，菌株生長時(shí)間為0、2、4、6、8、12、16、24和36h。5.9生長曲線、耐酸及耐膽鹽選取備用菌株純化培養(yǎng)，37℃厭氧培養(yǎng)38h，吸取20μL菌懸液于在MRS液體培養(yǎng)基中，在0、2、4、6、8、12、16、24、38h使用酶標(biāo)儀測其OD600值，并記錄數(shù)據(jù)。吸取20μL菌懸液于裝有200μLpH=2.0、pH=3.0、pH=4.0的MRS液體培養(yǎng)基的96孔板中，培養(yǎng)0h、2h、4h、6h、8h、12h、16h、24h、32h、48h，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，且使用酶標(biāo)儀OD600值進(jìn)行分析。使用96孔板，吸取20μL菌懸液分別裝于0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L的MRS培養(yǎng)基中，測定時(shí)間為0h、2h、4h、6h、8h、12h、16h、24h、32h、48h，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，且使用酶標(biāo)儀OD600值進(jìn)行分析。5.11.2模擬人工胃液測試將待試菌液吸取1mL置于9mL無菌人工胃液中，并將經(jīng)人工胃液處理的菌液接種于9mL無菌人工胃液中，37℃、150r/min條件下培養(yǎng)2h。二次接種到菌落平板計(jì)數(shù)液中，37℃、100r/min培養(yǎng)10h。利用菌落平板計(jì)數(shù)法分別法分別于0.5、1、2、3h進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率：存活率=測定時(shí)間菌落數(shù)/0時(shí)菌落數(shù)×100%取lmL待試菌液接入9mL無菌的人工模擬腸液中，經(jīng)人工腸液處理后的菌液，接種于9mL無菌的人工模腸液后，37℃、150r/min條件下培養(yǎng)2h。二次接種到菌落平板計(jì)數(shù)液中，37℃、100r/min培養(yǎng)10h。利用菌落平板計(jì)數(shù)法，分別法分別于0、1、2、3h進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率：存活率=測定時(shí)間菌落數(shù)/0時(shí)菌落數(shù)×100%。5.11.1耐熱試驗(yàn)將菌株接種于MRS培養(yǎng)基后，振蕩混勻，均勻分裝為六組，每組3mL，分別置于37、42、50、55、60、65℃水浴鍋中加熱10min，再用PBS倍比稀釋，涂板，厭氧培養(yǎng)24h，培養(yǎng)結(jié)束后平板計(jì)數(shù)。5.10乳酸菌鑒定45.10.1形態(tài)學(xué)鑒定使用革蘭氏染色方法在顯微鏡下觀察菌株形態(tài)并進(jìn)行描述分析。按GB4789.35的規(guī)定操作。5.10.2生化鑒定使用乳酸菌成套生化鑒定管，結(jié)合《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》（第九版）判定乳酸菌種屬。5.10.3BiologGENIII微孔板鑒定將菌株活化后在BUG瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h。以空白接種液為對照，將菌泥接種到接種液中（濁度為90%~98%）后，通過8通道電動移液器吸取菌懸液于GENIII微孔板中，放于Biolog自動微生物鑒定系統(tǒng)中進(jìn)行36h培養(yǎng)鑒定。5.10.4分子生物學(xué)鑒定菌株活化培養(yǎng)后收集菌體并使用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取其DNA。提取出的DNA用于16SrDNA序列的擴(kuò)增。上游通用引物：27F5‘AGAGTTTGATCCTGGCTCA’3；下游通用引物：1492R5‘GGTTACCTTGTTACGACTT’3。Premix（12.5μL）。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；95℃變性30sec，56℃退火1min，72℃延伸1min30sec，共30個循環(huán)；72℃10min，4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過電泳后，于凝膠成像系統(tǒng)下觀察到1500bp左右的條帶大小，PCR產(chǎn)物送商業(yè)公司測序。使用NCBI（NationalCenterforBiotechnologyInformation）數(shù)據(jù)庫BLAST比對，進(jìn)行同源性比對，挑選同源性較高的細(xì)菌16SrDNA序列，使用MEGA6.0軟件（采用Bootstrap法，重復(fù)次數(shù)為1000）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。5.11乳酸菌益生性指標(biāo)5.11.3抑菌性能測定吸取傷寒沙門氏菌（SalmonellatyphimuriumCMCC（B）50071）、大腸埃希氏菌（EscherichiacoliATCC25922）、金黃色葡萄球菌（StaphylococcusaureusCMCC（B）26003）、馬鏈球菌獸疫亞種（S.equisubsp.zooepidimicusATCC39920）、乙型溶血性鏈球菌（BetahemolyticstreptococcusCMCC（B）32210）各200μL涂布于MH固體培養(yǎng)基中，待菌液凝固。后將37℃厭氧培養(yǎng)24h的乳酸菌，經(jīng)14000rpm/min離心5min，吸取上清液200μL于3個牛津杯孔中，第四個牛津杯孔加200μL空白MRS液體培養(yǎng)基，觀察并測量抗菌圈直徑大小。5.11.4溶血性檢測吸取200μL乳酸菌菌懸液均勻涂布于哥倫比亞血平皿中，37℃厭氧培養(yǎng)24h，觀察是否有溶血現(xiàn)象。55.11.5抗生素敏感性吸取200μL乳酸菌菌液均勻涂布于MRS固體培養(yǎng)基上，采用紙片擴(kuò)散法，將頭孢呋辛、頭孢他定、新霉素、萬古霉素、四環(huán)素、頭孢曲松、青霉素、苯唑西林、丁胺卡那、羧芐西林、氨芐西林、多糖霉素、哌拉西林、紅霉素、麥迪霉素、頭孢氨芐、諾沙星氟、環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明、頭孢唑林、頭孢氨芐、頭孢哌酮、卡那霉素、諾氟沙星、多西環(huán)素、米諾環(huán)素、慶大霉素、克林霉素、呋喃唑酮、氨氯霉素共30種抗生素藥片放置于固體培養(yǎng)基上，37℃厭氧培養(yǎng)24h，觀察并測量抗菌圈直徑大小。6（規(guī)范性）培養(yǎng)基配制方法表A.1培養(yǎng)基