第八章環(huán)境毒理學(xué)常用研究方法

第八章環(huán)境毒理學(xué)常用研究方法第一節(jié)實驗準備1、1動物得準備①選擇實驗動物②編號與標記③固定與麻醉(1)選擇實驗動物黏膜刺激高血壓1)種屬得選擇原則在機體反應(yīng)上與人體近似易獲得、易飼養(yǎng)、易管理敏感、合適－實驗資料大鼠－致癌豚鼠－過敏反應(yīng)常用動物介紹①貓氣體、蒸氣對黏膜得刺激②豚鼠或兔皮膚③豚鼠過敏性反應(yīng)④貓、狗、兔嘔吐⑤兔與貓體溫⑦狗、兔、大鼠血壓⑧大鼠與小鼠致癌⑨小鼠慢性中毒對臟器得損害2)個體選擇①年齡:幼年>成年,急性實驗－成年②性別:無特殊要求就雌雄各半③生理狀態(tài):如懷孕、哺乳④健康狀態(tài):檢查、預(yù)檢(2)實驗動物得標記編號染色、烙印、號牌大動物:記錄外表與毛色(3)實驗動物得捕捉及固定做好防護戴厚手套用器具固定大家有疑問的，可以詢問和交流可以互相討論下，但要小聲點(4)實驗動物得隨機分組分2組:任意從隨機數(shù)字表得某一行某一數(shù)字開始抄錄14個數(shù)

再抄錄一個數(shù)字為78,因為歸入A組得小鼠有8只,故以8除,得余數(shù)6。于就是把第6個A(即編寫為第12號得小鼠)劃給B組

分3組:再取一個隨機數(shù)除以6,瞧余數(shù)(5)實驗動物得麻醉動外科手術(shù)避免劇烈掙扎麻醉藥物:乙醚(1)全身麻醉

a)吸入法:開放法、封閉法－揮發(fā)性

b)腹腔與靜脈給藥麻醉法－非揮發(fā)性(2)局部麻醉

a)貓:一般應(yīng)用0、5-1、0%鹽酸普魯卡因注射。粘膜表面麻醉宜用2%鹽酸可卡因

b)兔在眼球手術(shù)時,可于結(jié)膜囊滴入0、02%鹽酸可卡因溶液,數(shù)秒鐘即可出現(xiàn)麻醉

c)狗:用0、5-1%鹽酸普魯卡因注射。眼鼻、咽喉表面麻醉可用2%鹽酸可卡因麻醉注意事項(1)靜脈注射必須緩慢,同時觀察肌肉緊張性、角膜反射與對皮膚夾捏得反應(yīng)。當(dāng)這些活動明顯減弱或消失時,立即停止注射。配制得藥液濃度要適中。(2)麻醉時需注意保溫。麻醉期間,動物得體溫調(diào)節(jié)機能往往受到抑制,出現(xiàn)體溫下降。保溫得方法有:實驗桌內(nèi)裝燈,電褥,臺燈照射等。無論用哪種方法加溫都應(yīng)根據(jù)動物得肛門體溫而定。(3)慢性實驗時,在寒冷冬季,麻醉劑在注射前應(yīng)加熱至動物體溫水平。1、2毒物得準備(1)了解毒物得物理常數(shù)

密度、溶解度、蒸汽壓、熔點、沸點、油/水分配系數(shù)等(2)劑型:毒性高、刺激性大－稀釋固態(tài)－溶液、軟膏(3)溶劑:①本身毒性很小或無毒②不與受檢毒物產(chǎn)生增毒或減毒作用③不影響毒物吸收④無特殊得刺激性或氣味1、3生物材料得采集與制備(1)血液得采集需求少刺破組織取毛細血管得血需求多靜脈采血、動脈注意:光線、溫度、器皿消毒、抗凝劑割(剪)尾取血眼眶靜脈叢采血斷頭取血頸動脈取血腹主動脈股動(靜)脈取血(2)尿液得收集連續(xù)收集在代謝籠下配置糞尿分離漏斗一次性尿液收集逼尿法、導(dǎo)尿法、輸尿管插管法剖腹采集尿液、提鼠采集尿液

尿液收集注意事項實驗期間膳食一致,特定時間完成收集防止尿液得污染標本迅速測定或冷凍保存避免器皿污染灌喂水或青菜滿足尿量需求(3)糞便得收集代謝籠、糞尿分離器外觀形態(tài)新鮮、完整,分析時取內(nèi)層糞便器皿干凈(4)呼出氣得收集研究毒物得吸收代謝與對肺功能得影響動物需固定(5)組織勻漿得制備酶:取樣－洗凈－研磨－離心－測定用于毒物得測定1、4預(yù)備試驗(1)選擇合適得實驗動物(2)設(shè)計染毒劑量及其分組(3)操作技術(shù)得檢驗與訓(xùn)練(4)發(fā)現(xiàn)新線索、新指標第二節(jié)常用染毒技術(shù)2、常用染毒途徑吸入染毒、經(jīng)皮膚染毒－最重要得灌胃氣管注入注射(腹腔、靜脈、肌內(nèi)、皮下)根據(jù)實驗?zāi)康眠M行選擇,同時考慮:(1)人群接觸環(huán)境毒物得實際情況生產(chǎn)車間－呼吸道(2)毒物得理化性質(zhì)固態(tài)、液態(tài)、氣態(tài)(3)受檢毒物得來源消耗量得大小2、1吸入染毒法－大氣污染物1)動式吸入染毒法優(yōu)點:①柜內(nèi)毒物濃度相對穩(wěn)定②受試環(huán)境具有持久得穩(wěn)定性缺點:①毒物消耗量大2)靜式吸入染毒法－急性在具有一定氣體容積得密閉容器中或在密封染毒柜內(nèi)進行優(yōu)點:設(shè)備簡單,操作方便缺點:要經(jīng)過一段時間才能達到實驗濃度要求3)面罩染毒法優(yōu)點:避免皮膚吸收注意檢查面罩得密封性4)吸入染塵法顆粒污染物<5μm2、2氣管注入法經(jīng)喉插入法氣管穿刺法暴露氣管穿刺法①適用于顆粒物染毒。②顆粒物可制備成生理鹽水混懸液,也可將顆粒物中得有害成分提取,再用提取物進行染毒。③此法需在動物麻醉下進行,難度較大,適宜急性試驗

2、3經(jīng)口染毒法不揮發(fā)性液體與固體毒物灌胃法－液體或制劑喂飼法－混在食物中經(jīng)口滴入－淀粉糊劑吞咽－膠囊2、4注射染毒法毒物對局部損害不能太大①腹腔注射②肌內(nèi)注射

不溶于水但溶于油或其她溶劑③靜脈注射④皮下注射⑤皮內(nèi)注射2、5經(jīng)皮染毒法家兔與豚鼠斑貼法兔耳法結(jié)膜囊染毒第三節(jié)毒理學(xué)實驗得設(shè)計方法3、1實驗設(shè)計明確實驗?zāi)康谩⒘私舛疚?、預(yù)備實驗實驗類型(急性、慢性)、實驗動物染毒方式、濃度分組、對照組(平行、自身)3、2動物分組隨機化第四節(jié)急性毒性實驗4、1急性毒性實驗得內(nèi)容①急性毒性測定－LD50/LC50②皮膚染毒實驗－經(jīng)皮膚進入③局部作用實驗－有無刺激腐蝕④中毒癥狀得觀察－作用程度、部位⑤功能及病理組織學(xué)檢查－部位、程度4、2哺乳動物得急性毒性實驗一、半致死劑量得測定(途徑？)(1)動物準備(小動物、預(yù)觀察)(2)劑量選擇(3)藥液配置及染毒－等容量法(4)癥狀觀察(5)病理學(xué)檢查及其她指標觀察(6)結(jié)果評價－LD50、毒性級別劑量得選擇①預(yù)實驗測定:最大無作用劑量、100％死亡劑量②按等比級數(shù)(<2、2,一般1、2~1、5)間距設(shè)計濃度系列,系列濃度中有一個得死亡率為40～60％為最佳二、急性閾劑量得測定關(guān)鍵:選定適當(dāng)?shù)糜^測指標機理—肝腎、有機磷農(nóng)藥—膽堿酯酶新化學(xué)物質(zhì)—整體狀態(tài)、非特異性指標實驗方法游泳試驗、刺激閾試驗三、局部作用試驗皮膚與黏膜癥狀(豚鼠、家兔)急性皮膚刺激/腐蝕試驗急性眼刺激/腐蝕試驗

結(jié)膜囊染毒四、急性聯(lián)合毒性得測定過篩試驗確定大概得作用類型1/2LD50

①死亡率>80%,增毒;30％～80％,相加;<30％,拮抗②實測死亡率(O)/預(yù)期死亡率(P)混合毒物L(fēng)D50得測定方法①分別測定各毒物得LD50②按等毒性比例混合測定混合毒物得LD50③評定作用類型K<0、4拮抗;0、4<K<2、5相加;K>2、5協(xié)同4、3水生動物毒性實驗一、魚類毒性實驗動物選擇—區(qū)域代表性實驗條件—水溫、溶氧、pH二、甲殼動物實驗水蚤幼蟲得準備

TLm得測定斑馬魚青鳉魚第五節(jié)毒物蓄積得研究方法蓄積毒性作用:物質(zhì)蓄積:環(huán)境污染物進入>排出功能蓄積:結(jié)構(gòu)與功能變化得積累慢性、亞慢性實驗必須先評價蓄積性5、1物質(zhì)蓄積得研究方法生物蓄積得極限值與其在單位時間內(nèi)得吸收量成正比生物半衰期越短,達到極限所需時間就短A=a×T1/2×1、445、2功能蓄積得研究方法K=

ED50(n)

ED50(1)

①固定劑量連續(xù)染毒法;>5LD50,蓄積作用不明顯②劑量定期遞增染毒法(等比遞增)③

20天蓄積實驗法－停藥7天內(nèi)死亡情況LD50K>5,輕度蓄積5、3蓄積率得測定方法蓄積率＝×100％預(yù)給劑量對照組LD50-預(yù)給組LD50蓄積量＝對照組LD50－預(yù)給組LD50第六節(jié)亞慢性與慢性毒性實驗必須先做蓄積實驗判斷可能性6、1亞慢性毒性實驗(1/30～1/20)①動物要求敏感、兩種(嚙齒類、非嚙齒類)健康、年幼②劑量(高、中、低)一般取LD50得1/80～1/50,每天定時染毒,劑量相等③觀察指標一般指標、生化指標、病理學(xué)檢查6、2慢性毒性實驗實驗時間一般要求1～2年或者終生染毒一般要求選用幾種動物,年齡要小設(shè)3～4個劑量組與一個對照組LD50得1/1000～1/20之間取3～4個劑量注意事項:指標提前觀察、同步進行、注意異常情況、延長飼養(yǎng)時間繼續(xù)觀察第七節(jié)致癌性實驗7、1長期動物實驗①實驗動物得選擇:抗病力強、容易飼養(yǎng)、腫瘤自發(fā)率低、壽命長、對受試物敏感。兩種或以上動物②動物數(shù)目:小型動物50只;大型減少③劑量分組與對照(陰性、陽性對照):高劑量(加速致癌)、低劑量(接近人類)④染毒途徑:口、皮膚、注射⑤實驗時間:動物生命期得1/3～1/2⑥指標觀測:外表、行為、X射線、病理學(xué)檢查⑦結(jié)果評判:

潛伏期:第一例病理學(xué)檢查:惡性、良性、癌前期變陽性結(jié)果得判斷:腫瘤數(shù)、潛伏期短7、