PCR反應(yīng)各種問題解答

第第頁PCR反應(yīng)各種問題解答聚合酶鏈反應(yīng)（PolymeraseChainReaction,PCR）是80時代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復(fù)性好、易自動化等突出優(yōu)點。PCR反應(yīng)過程常顯現(xiàn)各種問題，下面對問題做認(rèn)真匯總解答：1.無擴增條帶（1）酶失活或在反應(yīng)體系中未加入酶。TaqDNA聚合酶因保管或運輸欠妥而失活，往往通過更換新酶或用另一來源的酶以獲得滿意的結(jié)果。（2）模板含有雜質(zhì)。特別是對甲醛固定及石蠟包埋的組織常含甲酸，造成DNA脫嘌呤而影響PCR的結(jié)果。（3）變性溫度是否準(zhǔn)確：PCR儀指示溫度與實際溫度是否相符，過高酶在前幾個循環(huán)就快速失活；過低則模板變性不全。（4）反應(yīng)系統(tǒng)中污染了蛋白酶及核酸酶，應(yīng)在未加Taq酶以前，將反應(yīng)體系95℃加熱5—10分鐘。（5）引物變質(zhì)失效。人工合成的引物是否正確。是否純化，或因儲存條件欠妥而失活。（6）引物錯誤。利用BLAST檢查引物特異性或重新設(shè)計引物。（7）DNA凝膠電泳時加入陽性對照，確保不是DNA凝膠和PCR程序的問題。2.PCR產(chǎn)物量過少（1）退火溫度不合適。以2度為梯度設(shè)計梯度PCR反應(yīng)優(yōu)化退火溫度。（2）DNA模板量太少。加添DNA模板量。（3）PCR循環(huán)數(shù)不足。加添反應(yīng)循環(huán)數(shù)。（4）引物量不足。加添體系中引物含量。（5）延長時間太短。以1kb/分鐘的原則設(shè)置延長時間。（6）變性時間過長。變性時間過長會導(dǎo)致DNA聚合酶失活。（7）DNA模板中存在抑制劑。確保DNA模板干凈3.擴增產(chǎn)物在凝膠中涂布或成片狀條帶彌散（1）酶量過高。減少酶量；酶的質(zhì)量差，調(diào)換另一來源的酶。（2）dNTP濃度過高。減少dNTP的濃度。（3）MgCl2濃度過高?？蛇m當(dāng)降低其用量。（4）模板量過多。質(zhì)粒DNA的用量應(yīng)50ng，而基因組DNA則應(yīng)200ng。（5）引物濃度不足優(yōu)化。對引物進行梯度稀釋重復(fù)PCR反應(yīng)。（6）循環(huán)次數(shù)過多；加添模板量減少循環(huán)次數(shù)至30，縮短退火時間及延長時間，或改用二種溫度的PCR循環(huán)。（7）退火溫度過低。（8）電泳體系有問題：①凝膠中緩沖液和電泳緩沖液濃度相差太大；②凝膠沒有凝固好；③瓊脂糖質(zhì)量差。（9）若為PCR試劑盒則可能：①由于運輸儲存欠妥引起試劑盒失效；②試劑盒自身質(zhì)量有問題，如引物選擇、循環(huán)參數(shù)等選擇欠妥。（10）降解的陳舊模板擴增也易產(chǎn)生涂布。4.擴增產(chǎn)物顯現(xiàn)多條帶（雜帶）（1）引物用量偏大，引物的特異性不高。應(yīng)調(diào)換引物或降低引物的使用量。（2）循環(huán)的次數(shù)過多。適當(dāng)加添模板的量，減少循環(huán)次數(shù)。（3）酶的用量偏高或酶的質(zhì)量不好，應(yīng)降低酶量或調(diào)換另一來源的酶。（4）退火溫度偏低，退火及延長時間偏長。應(yīng)提高退火溫度，減少變性與延長時間，也可采用二種溫度的PCR擴增。以2度為梯度設(shè)計梯度PCR反應(yīng)優(yōu)化退火溫度。（5）樣品處理欠妥。（6）Mg2+濃度偏高，因適當(dāng)調(diào)整Mg2+使用濃度。（7）若為PCR試劑盒，也可能時試劑盒自身質(zhì)量有問題。（8）復(fù)制提前停止。使用非熱啟動的聚合酶時常有發(fā)生。冰上準(zhǔn)備反應(yīng)體系或采用熱啟動聚合酶。（9）反應(yīng)緩沖液未全溶化或未充分混勻。確保反應(yīng)緩沖液溶化全并徹di混勻。（10）引物特異性差。利用BLAST檢查引物特異性或重新設(shè)計引物。（11）引物量過多。減少反應(yīng)體系中引物的用量。（12）模板量過多。質(zhì)粒DNA的用量應(yīng)50ng，而基因組DNA則應(yīng)200ng。（13）外源DNA污染。確保操作的干凈。5.陰性對照顯現(xiàn)條帶試劑，槍頭，工作臺污染。使用全新的試劑和槍頭，對工作臺進行清潔。6.條帶大小與理論