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34DB34/T4198—2022梨黑斑病菌的LAMP檢測(cè)方法DetectionofAlternariaspeciesinvolvedinpearblackspotusingLAMP2022-06-29發(fā)布2022-07-29實(shí)施安徽省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布IgaisenK.Nagan、A.alternata(Fr.)Keissler、A.tenuissimaA.yaliinficiensR.G.Roberts和A.ventricosaR.G.Roberts。5.4光照培養(yǎng)箱:20℃~30℃2WA培養(yǎng)基(瓊脂粉20g,加水1000mL),PDA培養(yǎng)基(去皮馬鈴薯200g,蔗糖(或葡萄糖)20g,瓊脂粉20g,加水補(bǔ)足至1000mL)。2%CTAB提取液(100mmol/LTris-HC1(pH8.0)CTAB,40mmol/L巰基乙醇(用時(shí)加入)),無(wú)水乙醇,10%SDS,酚/氯仿/異戊醇(25:24:1),氯仿,Na?EDTA-2H?00.75g,冰乙酸1.142mL,加水至1000mL,pH8.5),瓊脂糖。7.2供試DNA提取水浴1h,期間每隔10min上下顛倒幾次。常溫條件下12000rpm離心10min;取上清,加入等體積酚/氯仿/異戊醇(25:24:1),顛倒混勻,常溫條件下12000rpm離心5min;將上清轉(zhuǎn)移至新的EP管中,加入等體積氯仿,輕輕顛倒混勻,常溫條件下12中,加入1倍于上清體積的異丙醇,-20℃條件沉淀15min;常溫條件下12000rpm離心5min,傾F3:5’-GGCTCCTTTGAATGGTAACB3:5-TGTCTTCAACCAAGCATCAFIP:5’-CGCTGCAAGTAATCTATAAATCGGATTCAATAGGCAAATGGGGA-3’;BIP:5’-AATGGATCAAGAACGTTCAACGAATTGGTTGTGGGGTACTC-3’。3黃綠色,表明含有梨黑斑病菌;如果擴(kuò)增產(chǎn)物為橙紅色,表明不含有梨黑斑病菌(參見附錄4F2eFieATAATACciccoATIATAGATTACTrocAacCAAGCTIGATTCGGTATTATAAATB2
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