《微生物的生長》課件

微生物的生長14.1微生物生長的概念4.2微生物生長量的測定4.3微生物的群體生長規(guī)律4.4環(huán)境因素對微生物生長的影響4.5微生物生長繁殖的控制2生長growth：有機體的細(xì)胞組分與結(jié)構(gòu)在量方面的增加。表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)的量不斷增加，體積加大。繁殖reproduction：由于細(xì)胞分裂而引起的個體數(shù)目的增加。

單細(xì)胞微生物如細(xì)菌，生長往往伴隨著細(xì)胞數(shù)目的增加。

多細(xì)胞微生物（如某些霉菌）細(xì)胞數(shù)目的增加（菌絲細(xì)胞的不斷延長或分裂）如不伴隨著個體數(shù)目的增加，只能叫生長。只有通過形成無性孢子或有性孢子使得個體數(shù)目增加的過程才叫做繁殖。4.1微生物生長的概念個體生長個體繁殖群體生長群體生長=個體生長+個體繁殖3*微生物的純培養(yǎng)純培養(yǎng)(pureculture):把從一個細(xì)胞或一群相同的細(xì)胞經(jīng)過培養(yǎng)繁殖而得到的后代，稱為純培養(yǎng)。

顯微操作儀：顯微鏡下用顯微針、鉤、環(huán)等挑取單個細(xì)胞或孢子。

毛細(xì)管法；小液滴法。

稀釋涂布法稀釋倒平板法平板劃線法單細(xì)胞（孢子）分離法選擇培養(yǎng)分離法使微生物在固體培養(yǎng)基平板上形成單個菌落！最基本的方法：稀釋！42.稀釋倒平板法1.稀釋涂布法使用較多的常規(guī)方法，但有時涂布不均勻！操作較麻煩，對好氧菌、熱敏感菌效果不好！53.平板劃線法6采用顯微分離法在顯微鏡下從混雜群體中直接分離單個細(xì)胞或單個個體進行培養(yǎng)以獲得純培養(yǎng)。毛細(xì)管法：用毛細(xì)管提取微生物個體，適于較大微生物顯微操作儀：用顯微針、鉤、環(huán)等挑取單個細(xì)胞或孢子小液滴法：將經(jīng)過適當(dāng)稀釋后的樣品制成小液滴，在顯微鏡下選取只含一個細(xì)胞的液滴來進行純培養(yǎng)物的分離。4.單細(xì)胞（孢子）分離法該方法要在顯微鏡下進行難度與細(xì)胞或個體的大小成反比75.選擇培養(yǎng)分離法

使待分離微生物生長特征“突出”；

抑制大多數(shù)其它微生物的生長；微生物群落中數(shù)量占少數(shù)的微生物得到分離純化：

使待分離微生物生長更快。8顏色反應(yīng)：分離特定的菌株牛奶平板：分離蛋白酶產(chǎn)生菌

使待分離微生物生長特征“突出”9

高溫下培養(yǎng)：分離嗜熱細(xì)菌

培養(yǎng)基中不含N：分離固氮菌

培養(yǎng)基加抗生素：分離抗性菌

抑制大多數(shù)其它微生物的生長10富集培養(yǎng):利用不同微生物間生命活動特點的不同，制定特定的環(huán)境條件，僅使待分離微生物旺盛生長，在群落中的數(shù)量大大增加，從而更容易地從自然界中分離到所需的特定微生物。

使待分離微生物生長特征“突出”；

抑制大多數(shù)其它微生物的生長；

使待分離微生物生長更快。11二、微生物的培養(yǎng)方法從少量培養(yǎng)發(fā)展到大規(guī)模培養(yǎng).從淺層培養(yǎng)發(fā)展到厚層(固體)或深層(液體)培養(yǎng).從以固體培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展至液體培養(yǎng)為主.從靜止式液體至通氣攪拌式發(fā)酵.從批式至連續(xù)培養(yǎng).從游離細(xì)胞至固定化細(xì)胞培養(yǎng).從利用野生型菌株至工程菌株.從單菌至混合菌發(fā)酵.從微生物細(xì)胞至動植物細(xì)胞株

實驗室培養(yǎng)與工業(yè)培養(yǎng)好氧培養(yǎng)與厭氧培養(yǎng)

固體培養(yǎng)與液體培養(yǎng)

121.實驗室培養(yǎng)固體培養(yǎng)法：好氧菌：試管斜面、培養(yǎng)皿平板、克氏扁瓶、茄子瓶等。厭氧菌：高層瓊脂柱、厭氧培養(yǎng)皿、厭氧罐技術(shù)、Hungate滾管法和厭氧手套箱等。厭氧培養(yǎng)三大件：厭氧罐、

Hungate滾管法厭氧手套箱。嚴(yán)格厭氧技術(shù)13好氧菌實驗室固體培養(yǎng)試管斜面、培養(yǎng)皿平板、茄子瓶14厭氧菌實驗室固體培養(yǎng)①高層瓊脂柱：培養(yǎng)基中加入還原劑，裝入試管中滅菌后，只有表層有一些溶解氧，越是深層，其氧化還原電位勢越低，有利于厭氧菌的生長。如韋榮氏管（Veillontube）：長25cm，內(nèi)徑1cm，兩端可用橡皮塞封閉的玻璃管。②厭氧培養(yǎng)皿：

Brewer皿：利用凹形皿蓋制造狹窄空間，加上還原性培養(yǎng)基達(dá)到厭氧環(huán)境。

Spray或Bray皿：利用焦性沒食子酸+NaOH反應(yīng)造成無氧環(huán)境。15③厭氧罐：

常規(guī)的不很嚴(yán)格的厭氧技術(shù)；對厭氧罐反復(fù)抽真空、灌氮氣，剩余氧在鈀催化劑的催化下，與灌入混合氣體中的氫氣還原成水而除去，從而形成良好的無氧環(huán)境。

16④

Hungate滾管技術(shù)：嚴(yán)格厭氧技術(shù)；

利用除氧銅柱在350℃下與氧反應(yīng)來制備高純度氮，再用此高純度氮去驅(qū)除培養(yǎng)基配制、分裝過程中各種容器和小環(huán)境中的空氣，使培養(yǎng)基的配制、分裝、滅菌和貯存，以及接種、稀釋、培養(yǎng)、觀察、分離、移種和保藏等操作的全過程始終處于高度無氧的環(huán)境下，從而保證了嚴(yán)格厭氧菌的存活。17⑤厭氧手套箱：箱內(nèi)始終充滿成分為N2：CO2：H2＝85：5：10（V/V）的氣體，并有鈀催化劑保證箱內(nèi)處于高度無氧狀態(tài)。通過塑料手套進行操作，外界物體進出通過交換室。

181.實驗室培養(yǎng)液體培養(yǎng)法：好氧菌：確保培養(yǎng)液中含有較高的溶解氧濃度是關(guān)鍵。試管液體培養(yǎng)；三角瓶淺層液體培養(yǎng)：一般僅適用于兼性厭氧菌；搖瓶培養(yǎng)：又稱振蕩培養(yǎng)；臺式發(fā)酵罐：幾升至幾十升，使用方便厭氧菌：放入?yún)捬豕藁騾捬跏痔紫渲?；培養(yǎng)基中加入巰基乙酸、半胱氨酸等有機還原劑。19臺式發(fā)酵罐20NutrientadditionInoculationAgitationAirinletandoutletCoolingandheatingpHcontrolViewingport212.工業(yè)培養(yǎng)固態(tài)培養(yǎng)法：好氧菌：曲法培養(yǎng)。依制曲容器的形狀和規(guī)模分為：瓶曲、袋曲、盤曲、簾子曲、轉(zhuǎn)鼓曲、通風(fēng)曲等。——醬油釀造厭氧菌：堆積培養(yǎng)法?！拙粕a(chǎn)222.工業(yè)培養(yǎng)液體培養(yǎng)法：好氧菌：

淺盤培養(yǎng)：早期青霉素與檸檬酸發(fā)酵；

深層液體通氣培養(yǎng)：大型發(fā)酵罐+攪拌。

——糖化酶生產(chǎn)厭氧菌：

液體靜止培養(yǎng)法：液體培養(yǎng)基置于發(fā)酵罐中，不通氣，不攪拌，靜置保溫培養(yǎng)，簡化了工藝，節(jié)約了能源。

——啤酒生產(chǎn)23大型發(fā)酵罐244.1微生物生長的概念4.2微生物生長量的測定4.3微生物的群體生長規(guī)律4.4環(huán)境因素對微生物生長的影響4.5微生物生長繁殖的控制25三、微生物生長繁殖的測定方法（一）總細(xì)胞計數(shù)法（二）活菌計數(shù)法微生物生長繁殖測定：個體計數(shù)生物量測定

評價培養(yǎng)條件、營養(yǎng)物質(zhì)等對微生物生長的影響；

評價不同的抗菌物質(zhì)對微生物產(chǎn)生抑制或殺死作用的效果；客觀地反映微生物生長的規(guī)律。（三）重量測定（四）生理指標(biāo)測定2627測定方法細(xì)胞數(shù)生長量直接法（血球計數(shù)板）間接法直接法（干重法）間接法比濁法生理指標(biāo)平板菌落計數(shù)法液體稀釋法膜過濾法4.2微生物生長量的測定原理：將1mm2×0.1mm的薄層空間劃分為400小格，從中均勻分布地選取80或100小格，計數(shù)其中的細(xì)胞數(shù)目，換算成單位體積中的細(xì)胞數(shù)。1.血球計數(shù)板法28缺點：不能區(qū)分死菌與活菌；不適于對運動細(xì)菌的計數(shù)；需要相對高的細(xì)菌濃度；個體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察。適用范圍：個體較大細(xì)胞或顆粒，如血球、酵母菌等；不適用于細(xì)菌等個體較小的細(xì)胞。292、平板菌落計數(shù)法（活菌計數(shù)）技術(shù)要求樣品充分混勻操作熟練快速（15~20min完成操作）嚴(yán)格無菌操作每個平板上的菌落數(shù)目合適，便于準(zhǔn)確計數(shù)30在科研中一般用菌落形成單位（colonyformingunits，CFU）來表示，而不是直接表示為細(xì)胞數(shù)。31

樣品充分混勻；每支移液管及涂布棒只能接觸一個稀釋度的菌液；同一稀釋度三個以上重復(fù),取平均值；每個平板上的菌落數(shù)目合適，便于準(zhǔn)確計數(shù)。32適用范圍：中溫、好氧和兼性厭氧、能在營養(yǎng)瓊脂上生長的微生物。33

梯度稀釋接種3組共9支裝有培養(yǎng)液的試管中（每管接入1ml），記錄每個稀釋度出現(xiàn)生長的試管數(shù)查M.P.N.表（最大可能數(shù)）3、液體稀釋法34大腸菌群最大可能數(shù)（MPN）檢索表陽性管數(shù)MPN100mL（g）10010-110-2000<30001300026000390010300116001290013120............3302400331460033211000333≥2400035適用于含菌量較少的空氣和水中的微生物數(shù)目。讓一定體積的水或空氣通過濾膜

取下濾膜進行培養(yǎng)求出樣品中所含菌數(shù)

計菌落數(shù)4、薄膜過濾計數(shù)法36適用于菌濃較高的樣品。一般干重為濕重的10%～20%一個細(xì)菌細(xì)胞一般重約10-12～10-13g菌液離心或過濾得濕菌體烘干(干燥溫度可采用105℃、100℃或80℃)稱重5、干重法37原理：在一定范圍內(nèi)，菌懸液中的細(xì)胞濃度與混濁度成正比，即與光密度成正比，菌數(shù)越多，光密度越大。因此，借助于分光光度計，在一定波長下測定菌懸液的光密度，就可反應(yīng)出菌液的濃度。6.比濁法38在一定波長下，測定菌懸液的光密度，以光密度(opticaldensity,即O.D.)表示菌量。實驗測量時應(yīng)控制在菌濃度與光密度成正比的線性范圍內(nèi)，否則不準(zhǔn)確：合適波長；適宜菌液濃度；39測含氮量：原理：蛋白質(zhì)是細(xì)胞的主要物質(zhì)，含量穩(wěn)定，而氮是蛋白質(zhì)的主要成分，通過測含氮量就可推知微生物的濃度。

細(xì)菌含氮量為干重的12.5%，酵母菌為7.5%，霉菌為6.0%。

根據(jù)一定體積培養(yǎng)液中的含氮量乘以6.25，可測得粗蛋白的含量。

“凱氏定氮法”

其他方法：含碳、磷、DNA、RNA、耗氧量、消耗底物量、產(chǎn)二氧化碳、產(chǎn)酸、產(chǎn)熱、粘度等，都可用于生長量的測定。7.生理指標(biāo)法404.1微生物生長的概念4.2微生物生長量的測定4.3微生物的群體生長規(guī)律4.4環(huán)境因素對微生物生長的影響4.5微生物生長繁殖的控制41一、單細(xì)胞微生物的生長曲線生長曲線(GrowthCurve)：

細(xì)菌接種到定量的液體培養(yǎng)基中，定時取樣測定細(xì)胞數(shù)量，以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，以細(xì)菌數(shù)目為縱坐標(biāo)作圖，得到的反映細(xì)菌在整個培養(yǎng)期間菌數(shù)變化規(guī)律的曲線。在微生物學(xué)中提到的“生長”，指群體生長。42細(xì)菌的生長曲線一般用菌數(shù)的對數(shù)為縱坐標(biāo)作圖43一條典型的生長曲線可以分為四個時期：

遲緩期、對數(shù)期、穩(wěn)定期、衰亡期441.遲緩期(Lagphase)將少量菌種接入新鮮培養(yǎng)基后，在開始一段時間內(nèi)菌數(shù)不立即增加或增加很少，生長速度接近于零，也稱延遲期、適應(yīng)期。45遲緩期的特點：

生長速度接近于零；細(xì)胞形態(tài)變大或增長，例如巨大芽孢桿菌，在遲緩期末，細(xì)胞的平均長度比剛接種時長6倍。一般來說處于遲緩期的細(xì)菌細(xì)胞體積最大；細(xì)胞內(nèi)RNA（尤其是rRNA）含量增高，合成代謝活躍，核糖體、酶類和ATP的合成加快，易產(chǎn)生誘導(dǎo)酶；對外界不良條件反應(yīng)敏感。分裂遲緩、代謝活躍遲緩期出現(xiàn)的原因：微生物接種到一個新的環(huán)境，短時間內(nèi)缺乏分解和催化有關(guān)底物的酶，或是缺乏充足的中間代謝產(chǎn)物等。為產(chǎn)生誘導(dǎo)酶或合成中間代謝產(chǎn)物，就需要一段適應(yīng)期。調(diào)整代謝46影響延滯期長短的因素：菌種、接種量、培養(yǎng)基在生產(chǎn)實踐中縮短遲緩期的常用手段：(1)通過遺傳學(xué)方法改變種的遺傳特性；(2)利用對數(shù)生長期的細(xì)胞作為種子；(3)接種前后的培養(yǎng)基組分不要相差太大；(4)適當(dāng)擴大接種量。472.對數(shù)期(Logphase)又稱指數(shù)生長期(Exponentialphase)，緊接著延滯期的一段細(xì)胞數(shù)以幾何級數(shù)增長的時期。48以最大的速率生長和分裂，細(xì)菌數(shù)量呈對數(shù)增加；細(xì)菌內(nèi)各成分按比例有規(guī)律地增加，表現(xiàn)為平衡生長，細(xì)菌個體形態(tài)、化學(xué)組成和生理特性等均較一致；

酶系活躍，代謝旺盛，是研究微生物基本代謝的良好材料；在生產(chǎn)上常用作種子，使微生物發(fā)酵的遲緩期縮短，提高經(jīng)濟效益。指數(shù)期的特點：三個重要參數(shù)：繁殖代數(shù)（n）代時（G）生長速率常數(shù)（R）49

t–t0————=Gn細(xì)菌細(xì)胞分裂繁殖一代所需的時間為代時(Generationtime)，用G表示。生長速率常數(shù)（R）=1/G50納米細(xì)菌（nanobacteria），三天才分裂一次；九十年代初期從地下數(shù)公里發(fā)現(xiàn)的超微型細(xì)菌，用代謝產(chǎn)生的CO2作指標(biāo)，計算出這些超微菌的代謝速率僅為地上正常細(xì)菌的10-15，有人認(rèn)為它們需要100年才能分裂一次。51影響微生物代時長短的因素：菌種：不同的微生物及微生物的不同菌株代時不同；營養(yǎng)成分：在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中生長代時短；營養(yǎng)物濃度：一定范圍內(nèi)，生長速率與營養(yǎng)物濃度呈正比；溫度：在一定范圍，生長速率與培養(yǎng)溫度呈正相關(guān)。523.穩(wěn)定期(Stationaryphase)又稱恒定期或最高生長期，此時培養(yǎng)液中活細(xì)菌數(shù)最高并維持穩(wěn)定。53穩(wěn)定期的特點：

細(xì)胞的死亡數(shù)與新增數(shù)接近平衡，總菌數(shù)達(dá)到最大值，菌體含量最高；代謝活力鈍化，細(xì)胞含有較少的核糖體，mRNA的水平低下，RNA和蛋白質(zhì)合成緩慢，細(xì)胞生長變得不平衡。積累貯存物質(zhì)，如糖原、異染粒等；也是積累代謝產(chǎn)物的重要階段，某些抗生素的大量形成也在此時期；芽孢桿菌在此階段形成芽孢。穩(wěn)定期到來的原因：

營養(yǎng)物質(zhì)消耗；營養(yǎng)物的比例失調(diào)（如C/N比值不合適）；

pH、氧化還原電勢等環(huán)境變化；有害代謝產(chǎn)物積累（如酸、醇、毒素、H2O2等）。544.衰亡期(Deathphase)營養(yǎng)物質(zhì)耗盡，有毒代謝產(chǎn)物的大量積累，細(xì)菌死亡速率超過新生速率，整個群體呈現(xiàn)出負(fù)增長。55衰亡期的特點：

代謝活性降低；細(xì)菌衰老并出現(xiàn)自溶；產(chǎn)生或釋放出一些產(chǎn)物，如氨基酸、轉(zhuǎn)化酶、外肽酶或抗生素等。菌體細(xì)胞也呈現(xiàn)多種形態(tài)，有時產(chǎn)生畸形，細(xì)胞大小懸殊，有些革蘭氏染色反應(yīng)陽性菌此時會變成陰性反應(yīng)。衰亡期到來的原因：

外界環(huán)境對繼續(xù)生長越來越不利，引起細(xì)胞內(nèi)的分解代謝大大超過合成代謝，從而導(dǎo)致菌體衰老與死亡。561.微生物在對數(shù)生長期生長速率最快；2.營養(yǎng)物的消耗，代謝產(chǎn)物的積累，以及因此引起培養(yǎng)條件的變化，是限制培養(yǎng)液中微生物快速增殖的主要原因；3.用生活力旺盛的對數(shù)生長期細(xì)胞接種，可以縮短延遲期，加速進入對數(shù)期；4.補充營養(yǎng)物，調(diào)節(jié)因生長而改變了的pH、氧化還原電勢，排除培養(yǎng)環(huán)境中的有害代謝產(chǎn)物，可以延長對數(shù)生長期，提高菌體濃度與有用代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量；5.對數(shù)期以菌體生長為主，穩(wěn)定期以代謝產(chǎn)物合成與積累為主。生長曲線用于指導(dǎo)發(fā)酵工程中工藝條件的優(yōu)化57由于采用活菌計數(shù)比較麻煩，并要求嚴(yán)格進行操作，否則不易得到準(zhǔn)確的結(jié)果，重復(fù)性也差。因此在實際工作中多采用分光光度計測定OD值的方法繪制細(xì)菌的生長曲線。58

不同的微生物或同一種微生物對不同物質(zhì)的利用能力是不同的。有的物質(zhì)可直接被利用(例如葡萄糖或NH+4等)；有的需要經(jīng)過一定的適應(yīng)期后才能獲得利用能力（例如乳糖或NO3-等）。前者通常稱為速效碳源（或氮源），后者稱為遲效碳源（或氮源）。當(dāng)培養(yǎng)基中同時含有這兩類碳源（或氮源）時，微生物在生長過程中會形成二次生長現(xiàn)象。59二、微生物的連續(xù)培養(yǎng)將微生物置于體積恒定的培養(yǎng)基中培養(yǎng)生長，最后一次收獲。分批培養(yǎng)（batchculture）or封閉培養(yǎng)（closedculture）培養(yǎng)基一次加入，不予補充，不再更換。連續(xù)培養(yǎng)(Continousculture）：在一個恒定容積的流動系統(tǒng)中培養(yǎng)微生物，一方面以一定速率不斷加入新的培養(yǎng)基，另一方面又以相同速率移出培養(yǎng)物，以使培養(yǎng)系統(tǒng)中的細(xì)胞數(shù)量和營養(yǎng)狀態(tài)保持恒定的培養(yǎng)方法。60

微生物在單批培養(yǎng)方式下生長達(dá)到對數(shù)期后期時，一方面以一定的速度流進新鮮培養(yǎng)基并攪拌，另一方面以溢流方式流出培養(yǎng)液，使培養(yǎng)物達(dá)到動態(tài)平衡，其中的微生物就能長期保持對數(shù)期的平衡生長狀態(tài)和穩(wěn)定的生長速率。單批培養(yǎng)恒濁法恒化法單批培養(yǎng) 連續(xù)培養(yǎng) 時間連續(xù)流入新鮮培養(yǎng)液lg細(xì)胞數(shù)（個/ml）連續(xù)培養(yǎng)61連續(xù)培養(yǎng)分類：恒濁器、恒化器62測定所培養(yǎng)微生物的光密度值自動調(diào)節(jié)新鮮培養(yǎng)基流入和培養(yǎng)物流出培養(yǎng)室的流速

使培養(yǎng)物維持在某一恒定濁度菌體維持最高的生長速率當(dāng)培養(yǎng)室中的濁度超過預(yù)期數(shù)值時，流速加快，使?jié)岫冉档?；?dāng)培養(yǎng)室中的濁度低于預(yù)期數(shù)值時，流速減慢，使?jié)岫壬?。恒濁器的工作精度由光電控制系統(tǒng)的靈敏度來決定。1.恒濁器632.恒化器

使培養(yǎng)液流速保持不變，并使微生物始終在低于其最高生長速率下進行生長繁殖。恒化器中，必需將某種必需的營養(yǎng)物質(zhì)控制在較低的濃度，以作為限制性因子，而其他營養(yǎng)物均過量。限制性因子必須是機體生長所必需的營養(yǎng)物質(zhì)，如氨基酸和氨等氮源，或是葡萄糖、麥芽糖等碳源或者是無機鹽，因而可在一定濃度范圍內(nèi)能決定該機體生長速率。細(xì)菌的生長速率取決于限制性因子的濃度，并低于最高生長速率64裝置控制對象培養(yǎng)基培養(yǎng)基流速生長速率產(chǎn)物應(yīng)用范圍恒濁器菌體密度（內(nèi)控制）無限制生長因子不恒定最高大量菌體或與菌體形成相平行的產(chǎn)物生產(chǎn)為主恒化器培養(yǎng)基流速（外控制）有限制生長因子恒定低于最高不同生長速率的菌體實驗室為主恒濁器與恒化器的比較65同步培養(yǎng)：能使培養(yǎng)物中所有微生物細(xì)胞都處于相同的生長階段的培養(yǎng)方法。三、微生物的同步生長同步培養(yǎng)物用途：來研究在單個細(xì)胞上難以研究的生理與遺傳特性；作為工業(yè)發(fā)酵的種子。細(xì)胞同步生長細(xì)胞非同步生長同步生長：在培養(yǎng)物中所有的微生物細(xì)胞都處于同一生長階段。66獲得同步生長的方法：獲得同步生長的方法主要有兩類：環(huán)境條件誘導(dǎo)法：變換溫度、光線、培養(yǎng)基等，造成與正常細(xì)胞周期不同的周期變化。選擇法：選擇性過濾、梯度離心。物理方法，隨機選擇，不影響細(xì)胞代謝。67硝酸纖維素濾膜法是最經(jīng)典的獲得同步生長的方法

由于細(xì)胞的個體差異，同步生長只能維持2~3個世代，隨后又轉(zhuǎn)變?yōu)殡S機生長。684.1微生物生長的概念4.2微生物生長量的測定4.3微生物的群體生長規(guī)律4.4環(huán)境因素對微生物生長的影響4.5微生物生長繁殖的控制溫度、pH、氧6970溫度對微生物生長的影響是通過影響微生物細(xì)胞內(nèi)的生物化學(xué)反應(yīng)而實現(xiàn)。一、溫度71寬溫菌與窄溫菌由微生物長期生存的生態(tài)環(huán)境所決定的。寬溫菌：例如生活在土壤中的芽孢桿菌，其培養(yǎng)溫度為15~40度；大腸桿菌在體內(nèi)外均可生存，其生長溫度為10~47度。窄溫菌：例如專性寄生在人體泌尿生殖道中的淋病奈瑟氏球菌僅在36~40度生長。72最適生長溫度

為G最短或R最高之微生物培養(yǎng)溫度；同種微生物在不同的生理生化過程中有著不同的最適溫度,

即:最適不等于累積生物量最高;

最適不等于累積發(fā)酵產(chǎn)物最高;

最適不等于累積某代謝物最高73嗜冷微生物耐冷微生物中溫微生物嗜熱微生物超嗜熱微生物北極地區(qū)或海洋深處引起冰箱食物腐敗的主要微生物類群廣泛分布在地球的各種環(huán)境中存在于堆肥或發(fā)酵堆料中古菌，生長在火山噴氣口74

影響細(xì)胞膜表面電荷的性質(zhì)、膜的穩(wěn)定性、膜的通透性，進而影響對物質(zhì)的吸收能力。影響培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的離子化程度，從而影響營養(yǎng)物質(zhì)吸收，或有毒物質(zhì)的毒性。改變酶活、酶促反應(yīng)的速率及代謝途徑：如：酵母菌在pH4.5-5產(chǎn)乙醇，在pH6.5以上產(chǎn)甘油、酸。二、pH值1.環(huán)境pH值對微生物生長的影響75pH<2~>8都有微生物生長，絕大多數(shù)生活在pH5.0~9.0之間。微生物生長的pH值三基點：生長的最低、最適和最高pH值。根據(jù)微生物生長的最適pH值不同，將微生物分為：

嗜堿微生物：硝化細(xì)菌、尿素分解菌、多數(shù)放線菌

耐堿微生物：許多鏈霉菌

中性微生物：絕大多數(shù)細(xì)菌，一部分真菌

嗜酸微生物：硫桿菌屬

耐酸微生物：乳酸桿菌、醋酸桿菌2.不同微生物對pH要求不同微生物最低pH最適pH最高pH細(xì)菌3～58～10酵母菌2～37～8霉菌1～37～86.5～7.54.5～5.54.5～5.5763.生長最適pH值與發(fā)酵最適pH值

同種微生物不同的生長階段和不同生理生化過程中，對環(huán)境pH值要求不同。

例如：丙酮丁醇梭菌在pH值=5.5~7.0時，以菌體生長為主在pH值=4.3~5.3時，進行丙酮丁醇發(fā)酵同種微生物在不同環(huán)境pH值下，可能積累不同代謝產(chǎn)物。

例如：黑曲霉pH值=2~3時，產(chǎn)物以檸檬酸為主，只產(chǎn)少量草酸。pH值在7左右時，產(chǎn)物以草酸為主，只產(chǎn)少量檸檬酸。微生物生長最適pH合成抗生素最適pH灰色鏈霉菌 6.3~6.96.7~7.3紅霉素鏈霉菌6.6~7.06.8~7.3產(chǎn)黃青霉6.5~7.26.2~6.8金霉素鏈霉菌6.1~6.65.9~6.3龜裂鏈霉菌6.0~6.65.8~6.1灰黃青霉菌6.4~7.06.2~6.5774.微生物細(xì)胞內(nèi)的pH值

雖然微生物生活的環(huán)境pH值范圍較寬，但是細(xì)胞內(nèi)的pH值一般都接近中性。

細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定中性pH值的特性，能夠保持細(xì)胞內(nèi)各種生物活性分子的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和細(xì)胞內(nèi)酶所需要的最適pH值。胞內(nèi)酶的最適pH值一般為中性，胞外酶的最適pH值接近環(huán)境pH值。5.微生物的生命活動對環(huán)境pH值的影響微生物在生長過程中也會使外界環(huán)境的pH值發(fā)生改變：由于有機物分解：

分解糖類、脂肪等，產(chǎn)生酸性物質(zhì)，使培養(yǎng)液pH值下降；分解蛋白質(zhì)、尿素等，產(chǎn)生堿性物質(zhì)，使培養(yǎng)液pH值上升。

由于無機鹽選擇性吸收：

銨鹽吸收（(NH4)2SO4H2SO4），pH值下降；

硝酸鹽吸收(NaNO3NaOH)，pH值上升。NH4+被吸收NO3+被吸收786.培養(yǎng)過程中調(diào)節(jié)pH的措施

調(diào)節(jié)方法：

中和法:加酸堿調(diào)節(jié)；

營養(yǎng)物比例:適當(dāng)碳源或氮源；

呼吸法:提高或降低通氣量。具體措施：

過酸時：加入堿或適量氮源，提高通氣量。過堿時：加入酸或適量碳源，降低通氣量。79根據(jù)微生物對氧的需要和耐受力的不同，分為幾種類群:

專性好氧菌、兼性厭氧菌、微好氧菌、耐氧厭氧菌、

(專性)厭氧菌

三、氧氣801.專性好氧菌（strictaerobe）必須在有分子氧的條件下才能生長，有完整的呼吸鏈，以分子氧作為最終氫受體;細(xì)胞含有超氧物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶。3.微好氧菌（microaerophilicbacteria）只能較低的氧分壓下才能正常生長，通過呼吸鏈并以氧為最終氫受體而產(chǎn)能。在有氧或無氧條件下均能生長，但有氧情況下生長得更好，在有氧時靠呼吸產(chǎn)能，無氧時發(fā)酵或無氧呼吸產(chǎn)能；細(xì)胞含有SOD和過氧化氫酶。2.兼性好氧菌（facultativeaerobe）814.耐氧菌（aerotolerantanaerobe）可在分子氧存在下進行厭氧生活的厭氧菌。生活不需要氧，分子氧也對它無毒害。不具有呼吸鏈，依靠專性發(fā)酵獲得能量；細(xì)胞內(nèi)存在SOD和過氧化物酶，但缺乏過氧化氫酶。5.厭氧菌（anaerobe）分子氧對它有毒害，短期接觸空氣，也會抑制其生長甚至致死；只有在其深層的無氧或低氧化還原電勢的環(huán)境下才能生長；生命活動所需能量通過發(fā)酵、無氧呼吸、循環(huán)光合磷酸化或甲烷發(fā)酵提供；細(xì)胞內(nèi)缺乏SOD和細(xì)胞色素氧化酶，大多數(shù)還缺乏過氧化氫酶。82在培養(yǎng)不同類型的微生物時，要采用不同的措施：

好氧微生物：需震蕩或通氣，保證充足的氧氣。

專性厭氧微生物：需排除環(huán)境中的氧氣，同時在培養(yǎng)基中添加還原劑，降低培養(yǎng)基中的氧化還原電位勢。

兼性厭氧或耐氧微生物：可深層靜止培養(yǎng)。834.1微生物生長的概念4.2微生物生長量的測定4.3微生物的群體生長規(guī)律4.4環(huán)境因素對微生物生長的影響4.5微生物生長繁殖的控制*84一、幾個基本概念851.滅菌（Sterilization）

定義：采用強烈的理化因素，使物體內(nèi)外部的一切微生物永遠(yuǎn)喪失其生長繁殖能力的措施。類型：殺菌（活力喪失、菌體尚存）、溶菌（細(xì)胞溶解、菌體消失）。方法：高溫、超聲波、輻射、藥劑等。2.消毒（disinfection）

定義：采用溫和理化因子及劑量，僅殺死物體表面或內(nèi)部有害微生物，而對被消毒對象基本無害的措施。方法：藥劑消毒用于皮膚、水果與飲用水等； 巴氏消毒用于啤酒、牛奶、果汁與醬油等863.防腐（antisepsis）

定義：利用理化因素完全抑制微生物的生長繁殖，防止食品、生物制品等對象發(fā)霉變質(zhì)。措施：低溫、缺氧、干燥、高滲（高鹽、高糖）、高酸、高醇、加入防腐劑等：

醬油中常以苯甲酸、化妝品中添加山梨酸、墨汁中加入尼泊金等4.化療（chemotherapy）定義：利用具有高度選擇毒力的化學(xué)物質(zhì)，抑制宿主體內(nèi)病原微生物的生長繁殖，借以達(dá)到治療傳染病的一種措施?；焺河糜诨熌康幕瘜W(xué)物之總稱，包括如抗生素、磺胺藥、生物藥物素和中草藥中的有效成分等。87微生物控制法物理方法化學(xué)方法高溫低溫輻射高滲干燥過濾超聲波消毒劑和防腐劑化學(xué)治療劑應(yīng)用化學(xué)藥劑抑制或殺滅微生物。應(yīng)用物理因素殺滅或抑制微生物。二、物理滅菌因素之代表——高溫殺菌原理：使蛋白質(zhì)和核酸等變性、破壞；使膜類脂質(zhì)成分破壞等。891.干熱滅菌（dryheatsterilization）（2）烘箱熱空氣法（hot-airoven）：

將物品放入烘箱內(nèi)，升溫至150℃～170℃，維持1～2小時。適用于玻璃、陶瓷和金屬物品的滅菌，不適合液體樣品、棉花、紙張、纖維和橡膠類物質(zhì)的滅菌。

缺點：由于空氣傳熱穿透力差，菌體在脫水狀態(tài)下不易殺死，所以溫度高、時間長。

（1）焚燒法（incineration）：

將被滅菌物品在火焰中燃燒，使所有的生物質(zhì)碳化。簡單、徹底，但對被滅菌物品的破壞極大。適用于無經(jīng)濟價值的物品滅菌，及不怕燒的實驗器具，如接種環(huán)、鑷子、試管或三角瓶口的滅菌等。902.濕熱滅菌（moistheatsterilization）（1）水煮沸法（boilingwater）（2）高壓滅蒸汽鍋法（autoclaving）（3）間歇滅菌法（fractionalsterilization）（4）巴斯德消毒法（pasteurization）物品放入水中，加熱至100℃，煮沸15min～30min，可殺死所有營養(yǎng)細(xì)胞和部分芽孢。物品在80-100℃蒸煮15-60min，冷卻后室溫（28-37℃）過夜，重復(fù)2~3遍。

原理：在高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)，提高壓強使水的沸點升高，以提高水蒸氣溫度，殺菌效果也隨之提高。

0.1013MPa，水蒸汽的溫度121℃。

121℃，15~20min；115℃，35min。

用較低的溫度來殺死其中的病源微生物，不損失食品的營養(yǎng)風(fēng)味。

低溫維持法（63℃30min），高溫瞬時法（72℃15s），超高溫瞬時法（134℃1～2s）。91滅菌鍋92通過高溫，而不是壓力來殺死微生物。93連續(xù)加壓滅菌（continuousautoclaving）：“連消法”

原理：高溫瞬時，135~140℃處理5~15秒滅菌進入發(fā)酵罐的培養(yǎng)基；

優(yōu)點：高溫瞬時滅菌，既殺滅所有微生物，又最大限度減少營養(yǎng)成分的破壞，堤高原料的利用率等。同時，簡化操作和勞動強度，提高設(shè)備利用率等。94濕熱比干熱滅菌更好：

更易破壞細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)大分子的穩(wěn)定性，主要破壞氫鍵結(jié)構(gòu)。飽和水蒸汽穿透力強；蒸汽冷凝會放出潛熱。濕熱對一般營養(yǎng)體和孢子的殺滅條件：

多數(shù)細(xì)菌和真菌的營養(yǎng)細(xì)胞：60℃左右，5-10分鐘；酵母菌和真菌的孢子：80℃以上處理；細(xì)菌的芽孢：121℃，15分鐘以上；95三、化學(xué)因素控制微生物——消毒劑、防腐劑和化學(xué)治療劑最低抑制濃度（minimuminhibitoryconcentration，MIC）評定某化學(xué)藥物藥效強弱的指標(biāo)，指在一定條件下，某化學(xué)藥劑抑制特定微生物的最低濃度。半致死量（50%lethaldose，LD50）最低致死量（minimumlethaldose

，MLD）評定某藥物毒性強弱的指標(biāo)，指在一定條件下，某化學(xué)藥劑能殺死50%試驗動物時的劑量．評定某藥物毒性強弱的另一指標(biāo)，指在一定條件下，某化學(xué)藥劑能引起試驗100%動物死亡率的最低劑量．96最低抑制濃度（MIC）測定971.消毒劑（Disinfectant

）和防腐劑（Antisepsis

）消毒劑：可抑制或殺滅微生物，對一切活細(xì)胞都有毒性，不能用作活細(xì)胞或機體內(nèi)治療用的化學(xué)藥劑。

用于非生物材料的滅菌或消毒防腐劑：可以抑制微生物生長，但是對人體或動物體的毒性比較低的化學(xué)試劑?？勺鳛橥庥每刮⑸锼幬?。98各種抗微生物化學(xué)制劑殺菌能力的比較標(biāo)準(zhǔn)在臨床上最早使用的消毒劑——石炭酸99石炭酸系數(shù)（Phenolcoefficient，P.C.）：表示表面消毒劑的相對殺菌強度；指在一定時間內(nèi)，被試藥劑能殺死全部供試菌的最高稀釋度與達(dá)到同效的石炭酸的最高稀釋度之比；供試菌為傷寒沙門氏菌，處理時間為10分鐘。由于各種微生物化學(xué)制劑的殺菌機制各不相同，故石炭酸系數(shù)僅有一定的參考價值。待測制劑最高稀釋度達(dá)到同效的石炭酸的最高稀釋度石炭酸系數(shù)：

=100消毒劑和防腐劑：醇類：75%乙醇醛類：40%福爾馬林酚類：石炭酸、來蘇兒（甲醛+肥皂）表明活性劑：肥皂染料：結(jié)晶紫氧化劑：碘酒、漂白粉重金屬：升汞、波爾多液（CuSO4+石灰）酸堿類：生石灰101102103104消毒劑和防腐劑——非選擇性的抗微生物劑化學(xué)治療劑：能夠特異性地作用于某些微生物并具有選擇性毒性的化學(xué)藥劑，對人體幾乎沒有什么毒性或毒性很小。特異性的抗微生物劑抗代謝物（Antimetabolite）抗生素（Antibiotics）105抗代謝物(Antimetabolite)：

有些化合物在結(jié)構(gòu)上與生物體所必需的代謝物很相似，以至可以和特定的酶結(jié)合，從而阻礙了酶的功能，干擾了代謝的正常進行。葉酸對抗物（磺胺）、

嘌呤對抗物（6-巰基嘌呤）、

苯丙氨酸對抗物（對氟苯丙氨酸）、

尿嘧啶對抗物（5-氟尿嘧啶）、胸腺嘧啶對抗物（5-溴胸腺嘧啶）、

1061934年，德國I.G.Farben染料廠的G.Domagk一種紅色染料（prontosil），白鼠靜脈注射，可治療因鏈球菌引起的感染，