細胞融合的方法過程和影響因素

細胞融合的方法過程和影響因素細胞融合(cellfusion):又稱somatichybridizationorcellhybridization,指在自然條件下或人工方法使兩個或兩個以上得細胞通過無性方式融合形成一個雜合細胞得過程。

她能重新組合兩個親本細胞得優(yōu)良遺傳信息,就是研究細胞間遺傳信息傳遞、基因在染色體定位、改良動物遺傳特性及創(chuàng)造新得符合人類需要得新得細胞系極為有效得手段。自發(fā)融合:受精過程,成肌細胞融合,巨噬細胞融合,體外培養(yǎng)系統(tǒng)中得細胞融合誘發(fā)融合一、細胞融合得概念1962年Okata發(fā)現(xiàn)仙臺病毒可誘發(fā)艾氏腹水瘤細胞融合成多核細胞體,開創(chuàng)動物細胞融合得暫新領域。

SingerandNicolson’sModelofmembranestructure:Thefluid-mosaicmodelisthe“centraldogma”ofmembranebiology、Thecorelipidbilayerexistsinafluidstate,capableofdynamicmovement、Membraneproteinsformamosaicofparticlespenetratingthelipidtovaryingdegrees、TheFluidMosaicModel,proposedin1972bySingerandNicolson,hadtwokeyfeatures,bothimpliedinitsname、ThechemicalpositionofmembranesA、MembraneLipids:TheFluidPartoftheModelPhospholipids:Phosphoglyceride磷酸甘油酯andsphingolipidsGlycolipids

Sterols(isonlyfoundinanimals)Membranelipidsareamphipathic、Therearethreemajorclassesoflipids:AnOverviewofmembranefunctions

1、Definetheboundariesofthecellanditsorganelles、2、Serveaslociforspecificfunctions、3、provideforandregulatetransportprocesses、4、containthereceptorsneededtodetectexternalsignals、5、providemechanismsforcell-to-cellcontact,municationandadhesion細胞融合機理

細胞融合得關鍵:脂雙層得接觸靠近,細胞橋形成,胞質滲透－細胞核融合。膽固醇磷脂糖脂寡糖疏水a(chǎn)螺旋鰲合蛋白極性孔蛋白分子Hydrophobic疏水得Hydrophilic親水得二、誘發(fā)細胞融合得方法病毒化學－PEG電融合1、病毒促進細胞融合

病毒類融合劑就是研究得最早得促融劑,一些致癌、致病病毒如皰疹病毒、天花病毒、副流感型病毒、副黏液病毒等,都能誘導細胞融合,但由于毒性大,應用上收到很大限制。仙臺病毒(HVJ)就是一類被膜病毒,誘導細胞融合得不就是仙臺病毒內(nèi)部得RNA,而就是她得外膜。這一現(xiàn)象對您有何啟示？HVJ促融機制:當病毒位于兩個細胞間時,病毒表面spike上神經(jīng)氨酸酶降解細胞膜上得糖蛋白,使細胞膜局部聚集在病毒周圍,在高pH和Ca2+條件下局部細胞膜發(fā)生融合。2、化學融合劑促進細胞融合

1975年Kao和Chayluk報道PEG(polyethyleneglycol,PEG)可促進細胞融合,Pontecorvo報道PEG促融效率高于仙臺病毒100-300倍。PEG就是一種多聚化合物,商品名卡波蠟Carbowax,分子量200－20000,靠醚鍵得聯(lián)結使其分子末端帶弱負電荷,目前已衍生達50多種。12大家應該也有點累了，稍作休息大家有疑問的，可以詢問和交流聚乙二醇(PEG)介導得細胞融合原理:PEG帶有大量得負電荷,和細胞膜表面得負電荷在Ca2＋得連接下,形成靜電鍵,促使異源得細胞膜間得粘著和結合,在高pH,高Ca2＋溶液得作用下,將Ca2＋和與質膜結合得PEG分子洗脫,導致電荷平衡失調(diào)并重新分配,使兩種細胞膜上得正負電荷連接起來,進而形成具有共同質膜得融合體。注意事項1PEG融合得關鍵就是作用時間2PEG規(guī)格和純度與融合效率有關3融合與細胞密度有關4融合液中加入少量CaCl2,即維持一定電導率,對細胞也有保護作用3、電融合技術(Electroporation)

3注意事項1)對介質要求高,一般用高純度得蒸餾水并選用適當?shù)梅请娊橘|溶液,如甘露醇等配制等滲性介質。2)注意控制高頻交流電壓和直流脈沖電壓得強度和時間,以防止細胞連接成串或發(fā)生可逆性降解。融合參數(shù):主要包括交流電壓、交變電場得振幅頻率、交變電場得處理時間;直流高頻電壓、脈沖寬度、脈沖次數(shù)等。優(yōu)點:融合率高,達70％－80％,甚至100％融合率＝(融合組多核細胞得核數(shù)－對照組多核細胞得核數(shù)/對照組得全部細胞數(shù))×100％可在顯微鏡下定向誘導細胞融合可直接挑選雜種細胞

原理:兩種親本細胞融合得混合物中可能有多種類型細胞,篩選得目得就是獲得優(yōu)良得雜種細胞。

1)親本

2)同核體homokaryon:同源細胞融合體,她們得基因型和表現(xiàn)型完全一樣。

3)異核體heterokaryon:異源細胞得融合體,她們含有雙親細胞核和細胞質物質。

4)多核體:含有雙親不同比例核物質得融合體

5)異胞質體:具有不同胞質來源得雜合細胞。

6)核質體:有細胞核而帶有少量細胞質得亞原生質體第二節(jié)融合細胞得篩選動物細胞融合得篩選方式:1)利用抗藥性篩選系統(tǒng):利用生物細胞對藥物敏感性差異篩選雜種細胞。親本A:對氨芐青霉素敏感,對卡那霉素不敏感親本B:對卡那霉素敏感,對氨芐青霉素不敏感雜種細胞可以在含有兩種抗生素得培養(yǎng)基上生長2)營養(yǎng)互補篩選系統(tǒng):細胞在缺乏一種或幾種營養(yǎng)成分時,不能生長繁殖,即營養(yǎng)缺陷型細胞。利用兩種親本細胞營養(yǎng)互補作用原理可以篩選雜種細胞。親本A:色氨酸缺陷型親本B:蘇氨酸缺陷型雜種細胞可以在不含色氨酸和蘇氨酸得培養(yǎng)基上培養(yǎng),而親本細胞均會死亡。3)溫度敏感突變型雜種細胞得篩選:一般得培養(yǎng)細胞能在37度范圍內(nèi)生長,但溫度敏感突變型得細胞能在高溫或低溫下生長。由此篩選雜種細胞。親本一:具有卡那霉素抗性但只能在37度左右生長。親本二:高溫敏感突變型,但不能抗卡那霉素。雜種細胞能在高溫和含卡那霉素得培養(yǎng)基上生長。4具有所需性狀雜種細胞得篩選HAT選擇系統(tǒng)－－基于酶缺陷型細胞和藥物抗性所建立得雜種篩選HAT就是含一定濃度次黃嘌呤(Hypoxanthine,H)、氨基喋呤(Aminopterin,A)及胸腺嘧啶核苷(Thymidine,T)得一種選擇性培養(yǎng)基,其中三種成分與細胞DNA合成有關。DNA合成途徑有兩種:需兩種酶:胸腺嘧啶核苷激酶TK酶:(催化胸腺嘧啶核苷產(chǎn)生脫氧胸苷酸)次黃嘌呤磷酸核苷轉移酶HGPRT酶:(催化次黃嘌呤產(chǎn)生肌苷)主要途徑由氨基酸和其她小分子化合物合成核苷酸,進而合成DNA,葉酸就是必不可少得媒介,參與嘌呤和嘧啶甲基合成,氨基蝶呤抑制FH2活性,阻斷FH2到FH4合成。雜交瘤技術中,常選用次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶缺陷(HPRT-)骨髓瘤細胞或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型(TK-)骨髓瘤細胞為親本之一。HPRT-細胞得嘌呤只能由全合成途徑產(chǎn)生;TK-細胞得嘧啶只能由全合成途徑合成。含氨基喋呤A培養(yǎng)基抑制了細胞內(nèi)嘌呤和嘧啶得全合成途徑?；贖AT培養(yǎng)基得篩選系統(tǒng)H(Hypoxanthine次黃嘌呤)應急途徑中所提供之外源核苷酸前體A(Aminopterin,氨基喋呤)阻斷核苷酸得從頭合成T(Thymidine,胸腺嘧啶)應急途徑中所提供之外源核苷酸前體HGPRT酶缺陷型細胞株(長期培養(yǎng)系)不能在HAT培養(yǎng)液中生長正常細胞體外生存能力有限,最終也將死亡融合細胞最后,只有融合細胞在HAT培養(yǎng)液中存活第三節(jié)融合細胞克隆化利用單個細胞培養(yǎng)技術選育出遺傳穩(wěn)定得分泌特異抗體得細胞系。在培養(yǎng)過程中,一般要加能釋放某些生長因子促進雜交瘤生長得飼養(yǎng)細胞,如小鼠得腹腔巨噬細胞、脾細胞或胸腺細胞等。方法有有限稀釋法、軟瓊脂培養(yǎng)法、顯微操作法、應用熒光激活分選儀等。通過適當?shù)孟♂屵_到分離單個細胞進行培養(yǎng)得目得1)取出陽性孔內(nèi)得細胞進行計數(shù)2)用培液將其稀釋到例如每毫升內(nèi)10個細胞。3)如果在96孔板內(nèi)每孔加0、1ml,每孔內(nèi)將為一個細胞4)加入一定數(shù)量得飼養(yǎng)細胞,經(jīng)過8~12天后,可觀察到有集落生長得孔。5)根據(jù)檢測得陽性結果再次進行克隆化。有限稀釋法在加入飼養(yǎng)細胞得無菌平皿內(nèi)鋪上一層0、5％得瓊脂,待凝固后再鋪上一層混有雜交瘤細胞得0、25％得軟瓊脂。待細胞長成集落后,用毛細管吸出移種于含飼養(yǎng)細胞得96孔板內(nèi)。軟瓊脂培養(yǎng)法第四節(jié)雜種細胞在細胞生物學研究中得應用1)基因定位

不同種屬得細胞融合時,常會出現(xiàn)一個親本細胞得染色體被優(yōu)先排除,而另一個親本得染色體被選擇性留下,即染色體分離得現(xiàn)象。由此,可根據(jù)表型和與表型特征相對應得基因在特定染色體上。例如:HGPRT－人細胞與TK－得小鼠細胞融合后,可用HAT培養(yǎng)基分離得到一種僅含一條人E組染色體得雜種細胞,具有TK活性,由此得到人得TK基因就是在E組染色體上得。2)體細胞雜種得致瘤性分析通過正常二倍體細胞和致瘤性或病毒轉化細