紫外-可見分光光度法

ingsomethi紫外-可見分光光度法1 簡(jiǎn)述紫外-可見分光光度法是在190-800nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)定物質(zhì)的吸光度，用于鑒別、雜質(zhì)檢查和含量測(cè)定的方法。定量分析通常選擇物質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)出吸光度，然后用對(duì)照品或吸收系數(shù)求算出被測(cè)物質(zhì)的含量，多用于制劑的含量測(cè)定；對(duì)已知物質(zhì)定性可用吸收峰波長(zhǎng)或吸光度比值作為鑒別方法；若該物質(zhì)本身在紫外光區(qū)無(wú)吸收，而其雜質(zhì)在紫外光區(qū)有相當(dāng)強(qiáng)度的吸收，或雜質(zhì)的吸收峰處該物質(zhì)無(wú)吸收，則可用本法作雜質(zhì)檢查。物質(zhì)對(duì)紫外輻射的吸收是由于分子中原子的外層電子躍遷所產(chǎn)生，因此，紫外吸收主要決定于分子的電子結(jié)構(gòu)，故紫外光譜又稱電子光譜。有機(jī)化合物分子結(jié)構(gòu)中如含有共軛體系、芳香環(huán)等發(fā)色基團(tuán)，均可在紫外區(qū)（200~400nm）或可見光區(qū)（400~850nm）產(chǎn)生吸收。通常使用的紫外-可見分光光度計(jì)的工作波長(zhǎng)范圍為190~900nm。紫外吸收光譜為物質(zhì)對(duì)紫外區(qū)輻射的能量吸收?qǐng)D。朗伯-比爾（Lambert-Beer）定律為光的吸收定律，它是紫外-可見分光光度法定量分析的依據(jù)，其數(shù)學(xué)表達(dá)式為:A=log =ECLT1式中 A為吸光度;T為透光率;E為吸收系數(shù);C為溶液濃度;L為光路長(zhǎng)度。如溶液的濃度（C）為1%（g/ml），光路長(zhǎng)度（L）為lcm，相應(yīng)的吸光度即為吸1cm收系數(shù)以

E1%

表示。如溶液的濃度（C）為摩爾濃度（mol/L），光路長(zhǎng)度為lcmingsomethi時(shí)，則相應(yīng)有吸收系數(shù)為摩爾吸收系數(shù)，以ε表示。2 儀器紫外-可見分光光度計(jì)主要由光源、單色器、樣品室、檢測(cè)器、記錄儀、顯示系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)等部分組成。為了滿足紫外-可見光區(qū)全波長(zhǎng)范圍的測(cè)定，儀器備有二種光源，即氘燈和碘鎢燈，前者用于紫外區(qū)，后者用于可見光區(qū)。單色器通常由進(jìn)光狹縫、出光狹縫、平行光裝置、色散元件，聚焦透鏡或反射鏡等組成。色散元件有棱鏡和光柵二種，棱鏡多用天然石英或熔融硅石制成，對(duì)200~40Onm波長(zhǎng)光的色散能力很強(qiáng)，對(duì)600nm以上波長(zhǎng)的光色散能力較差，棱鏡色散所得的光譜為非勻排光譜。光柵系將反射或透射光經(jīng)衍射而達(dá)到色散作用，故常稱為衍射光柵，光柵光譜是按波長(zhǎng)作線性排列，故為勻排光譜，雙光束儀器多用光柵為色散元件。檢測(cè)器有光電管和光電倍增管二種。紫外-可見分光光度計(jì)依據(jù)其結(jié)構(gòu)和測(cè)量操作方式的不同可分為單光束和雙光束分光光

度計(jì)二類。單光束分光光度計(jì)有些仍為手工操作，即固定在某一波長(zhǎng)，分別測(cè)量比較空白、樣品或參比的透光率或吸收度，操作比較費(fèi)時(shí)，用于繪制吸收光譜圖時(shí)很不方便，但適用于單波長(zhǎng)的含量測(cè)定。雙光束分光光度計(jì)藉扇形鏡交替切換光路使分成樣品（S）和參比（R）兩光束，并先后到達(dá)檢測(cè)器，檢測(cè)器信號(hào)經(jīng)調(diào)制分離成兩光路對(duì)應(yīng)信號(hào)，信號(hào)的比值可直接用記錄儀記錄，雙光束分光光度計(jì)操作簡(jiǎn)單，測(cè)量快速，自動(dòng)化程度高，但作含量測(cè)定時(shí)，為求準(zhǔn)確起見，仍宜用固定波長(zhǎng)測(cè)量方式。紫外-可見分光光度計(jì)波長(zhǎng)準(zhǔn)確度允許誤差，紫外紫外-可見分光光度計(jì)的檢定波長(zhǎng)準(zhǔn)確度波長(zhǎng)準(zhǔn)確度的允差范圍區(qū)為±1.0nm，500nm處±2.0nm，700nm處±4.8nm。波長(zhǎng)準(zhǔn)確度檢定方法用低壓汞燈檢定

關(guān)閉儀器光源，將汞燈（用筆式汞燈最方便）直接對(duì)準(zhǔn)ingsomethi進(jìn)光狹

縫，如為雙光束儀器，用單光束能量測(cè)定方式，采用波長(zhǎng)掃描方式，掃描速度“慢”（如l5nm/min）、響應(yīng)“快”、最小狹縫寬度（如0.lnm）、量程0~100%，在200~800nm范圍內(nèi)單方向重復(fù)掃描3次，由儀器識(shí)別記錄各峰值（若儀器無(wú)“峰檢測(cè)”功能，必要時(shí)可對(duì)指定波長(zhǎng)進(jìn)行“單峰”掃描）。單光束儀器以751G型為例，可將選擇開關(guān)放在×0.1位置，透光率讀數(shù)放在100（或選擇開關(guān)放在×l，透光率放在10），關(guān)小狹縫，打開光閘門，緩緩轉(zhuǎn)動(dòng)波長(zhǎng)盤，尋找汞燈546.07nm峰出現(xiàn)的位置，若與波長(zhǎng)讀數(shù)不符，應(yīng)調(diào)節(jié)儀器左側(cè)準(zhǔn)直鏡的波長(zhǎng)調(diào)整螺絲，如波長(zhǎng)向短波長(zhǎng)方向移動(dòng)，應(yīng)順時(shí)針方向旋轉(zhuǎn)波長(zhǎng)調(diào)整螺絲，如向長(zhǎng)波方向移動(dòng)，則應(yīng)反時(shí)針方向旋轉(zhuǎn)波長(zhǎng)調(diào)整螺絲，調(diào)整好后，再按汞燈的下列譜線測(cè)試，記錄每條譜線與儀器波長(zhǎng)讀數(shù)的誤差。用于檢定紫外-可見分光光度計(jì)的汞燈譜線波長(zhǎng)：237.83、253.65、275.28、2g6.73、302.15、313.16、334.15、365.02、365.48、366.33、404.66（紫色）、435.83（藍(lán)色）、546.07（綠色）、576.96（黃色）及579.07nm。用儀器固有的氘燈檢定

本法主要用于日常工作中波長(zhǎng)準(zhǔn)確度的核對(duì)。取單光束能量測(cè)定方式，測(cè)量條件同上述低壓汞燈的方法，對(duì)486.02及656.10nm二單峰進(jìn)行單方向重復(fù)掃描3次。用氧化鈥玻璃檢定

將氧化鈥玻璃放大樣品光路，參比光路為空氣，按測(cè)定吸收光譜圖方法測(cè)定。校正自動(dòng)記錄儀器時(shí)，應(yīng)考慮記錄儀的時(shí)間常數(shù)，測(cè)定樣品與校正時(shí)取同一掃描速度。氧化鈥玻璃在27g.4、287.5、333.7、360.g、418.7、460.0、484.5、536.2及637.5nm波長(zhǎng)處有尖銳的吸收峰，可供波長(zhǎng)檢定用。氧化鈥玻璃因制造的原因，每片氧化鈥的吸收峰波長(zhǎng)有差異，另外，在放置過程中也會(huì)發(fā)生波長(zhǎng)漂移，因此需定期由計(jì)量本法可供沒有單光束測(cè)定功能的雙光束紫外分光光部門校驗(yàn)。3.1.2.4 用高氯酸鈥溶液檢定度計(jì)波長(zhǎng)準(zhǔn)確度檢定用。高氯酸鈥溶液的配制方法:取10姑高氯酸為溶劑，加入氧化鈥（Ho203）配成4%ingsomethi溶液即得。高氯酸鈥溶液較強(qiáng)的吸收峰波長(zhǎng)為241.13、278.10、287.18、333.44、345.47、361.31、416.28、451.30、485.29、536.64、640.52nm。如果是雙光束掃描儀器，但不是數(shù)據(jù)貯存型的（指是直接將信號(hào)描記于記錄紙上），記錄的波長(zhǎng)可能因記錄筆滯后而非真實(shí)波長(zhǎng)，為了準(zhǔn)確測(cè)定，建議采用定點(diǎn)檢定而不用掃描方式。3.2 吸光度準(zhǔn)確度 精密稱取在120℃干燥至恒重的基準(zhǔn)重鉻酸鉀約60mg，置1000m1量瓶中，用0.005mol/L硫酸液溶解并稀釋至1000ml，用配對(duì)的lcm石英池，以0.005mol/L硫酸液為空白，在235，257，313，350nm分別測(cè)定吸光度，然后換算1cm成

E1%

，測(cè)得值應(yīng)符合下表中規(guī)定的允差范圍。分光光度法允差范圍波長(zhǎng)（nm）吸收強(qiáng)度吸收系數(shù)（

E1%

）1cm允差范圍235最小124.5123.0~126.0257313350最大最小最大144.048.62106.6142.8~146.247.0~50.3105.5~108.5分辨率、雜散光、基線平直度、穩(wěn)定度、絕緣電阻等項(xiàng)檢定，按國(guó)家技術(shù)監(jiān)督局“雙光束紫外-可見分光光度計(jì)檢定規(guī)程”JJG682-90，并應(yīng)符合有關(guān)項(xiàng)下的規(guī)度。應(yīng)根據(jù)日常使用中，對(duì)以上兩項(xiàng)，即波長(zhǎng)和吸光度準(zhǔn)確需要隨時(shí)檢查。樣品測(cè)定操作方法吸收系數(shù)測(cè)定（性狀項(xiàng)下）按各品種項(xiàng)下規(guī)定的方法配制供試品溶液，在規(guī)定的波長(zhǎng)（參見5.8項(xiàng)）測(cè)定其吸光度，并計(jì)算吸收系數(shù)，應(yīng)符合規(guī)定范圍。鑒別及檢查 按各品種項(xiàng)下的規(guī)定，測(cè)定供試品溶液的最大及最小吸收波長(zhǎng)，有的并須測(cè)定其在最大吸收波長(zhǎng)與最小吸收波長(zhǎng)處的吸光度比值，均應(yīng)符合規(guī)定。含量測(cè)定對(duì)照品比較法

按各品種項(xiàng)下規(guī)定的方法，分別配制供試品溶液和對(duì)照品溶液，對(duì)照品溶液中所含被測(cè)成分的量應(yīng)為供試品溶液中被測(cè)成分標(biāo)示量的（100±10）%以內(nèi)，用同一溶劑，在規(guī)定的波長(zhǎng)處測(cè)定供試品溶液和對(duì)照品溶液的ingsomethi吸光度。吸收系數(shù)法 按各品種項(xiàng)下配制供試品溶液，在規(guī)定的波長(zhǎng)及該波長(zhǎng)±2nm處測(cè)定其吸光度，按各該品種在規(guī)定條件下給出的吸收系數(shù)計(jì)算含量。采用吸收系數(shù)法應(yīng)對(duì)儀器進(jìn)行校正后測(cè)定，如為測(cè)定新品種的吸收系數(shù)，需按后列“吸收系數(shù)測(cè)定法”的規(guī)定進(jìn)行。計(jì)算分光光度法 按中國(guó)藥典規(guī)定，計(jì)算分光光度法一般不宜用于含量測(cè)定，對(duì)于少數(shù)采用計(jì)算分光光度法的品種，應(yīng)嚴(yán)格按各品種項(xiàng)下規(guī)定的方法進(jìn)行。用本法時(shí)應(yīng)注意：有一些吸光度是在待測(cè)成分吸收曲線的上升或下降陡坡處測(cè)定，影響精度的因素較多，故應(yīng)仔細(xì)操作，盡量使供試品和對(duì)照品的測(cè)定條件一致。若該品種不用對(duì)照品，如維生素A測(cè)定法（見中國(guó)藥典附錄），則應(yīng)在測(cè)定前對(duì)儀器作仔細(xì)的校正和檢定。注意事項(xiàng)試驗(yàn)中所用的量瓶和移液管均應(yīng)經(jīng)檢定校正、洗凈后使用。使用的石英吸收池必須潔凈。當(dāng)吸收池中裝入同一溶劑，在規(guī)定波長(zhǎng)測(cè)定各吸收池的透光率，如透光率相差在0.3%以下者可配對(duì)使用，否則必須加以校正。取吸收池時(shí)，手指拿毛玻璃面的兩側(cè)。裝樣品溶液的體積以池體積的4/5為度，使用揮發(fā)性溶液時(shí)應(yīng)加蓋，透光面要用擦鏡紙由上而下擦拭干凈，檢視應(yīng)無(wú)殘留溶劑，為防止溶劑揮發(fā)后溶質(zhì)殘留在池子的透光面，可先用蘸有空白溶劑的擦鏡紙擦拭，然后再用干擦鏡紙拭凈。吸收池放入樣品室時(shí)應(yīng)注意每次放入方向相同。使用后用溶劑及水沖洗干凈，晾干防塵保存，吸收池如污染不易洗凈時(shí)可用硫酸發(fā)煙硝酸（3:1v/v）混合液稍加浸泡后，洗凈備用。如用鉻酸鉀清潔液清洗時(shí)，吸收池不宜在清潔液中長(zhǎng)時(shí)間浸泡，否則清潔液中的鉻酸鉀結(jié)晶會(huì)損壞吸收池的光學(xué)表面，并應(yīng)充分用水沖洗，以防鉻酸鉀吸附于吸收池表面。測(cè)定前應(yīng)先檢查所用的溶劑在測(cè)定供試品所用的波長(zhǎng)附近是否符合要求，可用lcm石英吸收池盛溶劑以空氣為空白（即參比光路中不放置任何物質(zhì)）測(cè)定其吸光度，應(yīng)符合下表規(guī)定，并不得在溶劑的截止使用波長(zhǎng)以下測(cè)定。波長(zhǎng)范圍以空氣為空白測(cè)定溶劑在不同波長(zhǎng)處的吸光度的規(guī)定220~240 241~250 251~300300以上ingsomethi<0.05（nm）吸光度 <0.4 <0.2 <0.1每次測(cè)定時(shí)應(yīng)采用同一廠牌批號(hào)，混合均勻的同批溶劑。稱量應(yīng)按藥典規(guī)定要求。配制測(cè)定溶液時(shí)稀釋轉(zhuǎn)移次數(shù)應(yīng)盡可能少，轉(zhuǎn)移稀釋時(shí)所取容積一般應(yīng)不少于5ml。含量測(cè)定時(shí)供試品應(yīng)稱取2份，如為對(duì)照品比較法，對(duì)照品一般也應(yīng)稱取2份。吸收系數(shù)檢查也應(yīng)稱取供試品2份，平行操作，每份結(jié)果對(duì)平均值的偏差應(yīng)在±0.5%以內(nèi)。作鑒別或檢查可取樣品1份。供試品溶液的濃度，除各品種項(xiàng)下已有注明者外，供試品溶液的吸光度以在0.3~0.7之間為宜，吸光度讀數(shù)在此范圍誤差較小，并應(yīng)結(jié)合所用儀器吸光度線性范圍，配制合適的讀數(shù)濃度。選用儀器的狹縫譜帶寬度應(yīng)小于供試品吸收帶半高寬的10%，否則測(cè)得的吸光度值會(huì)偏低，或以減小狹縫寬度時(shí)供試品溶液的吸光度不再增加為準(zhǔn)，對(duì)于中國(guó)藥典紫外測(cè)定的大部分品種，可以使用2nm縫寬，但當(dāng)吸收帶的半高寬小于2Onm時(shí)，則應(yīng)使用較窄的狹縫，例如青霉素鉀及鈉的吸光度檢查需用lnm縫寬或更窄，否則其264nm的吸光度會(huì)偏低。測(cè)定時(shí)除另有規(guī)定者外，應(yīng)在規(guī)定的吸收峰±2nm處，再測(cè)幾點(diǎn)的吸光度，以核對(duì)供試品的吸收峰位置是否正確，并以吸光度最大的波長(zhǎng)作為測(cè)定波長(zhǎng)，除另有規(guī)定外吸光度最大波長(zhǎng)應(yīng)在該品種項(xiàng)下規(guī)定的波長(zhǎng)±2nm以內(nèi)，否則應(yīng)考慮試樣的同一性、純度以及儀器波長(zhǎng)的準(zhǔn)確度。用于制劑含量測(cè)定時(shí)，應(yīng)注意供試液與對(duì)照液的pH值是否一致，如pH值對(duì)吸收有影響，則應(yīng)調(diào)溶液的pH值一致后再測(cè)定吸光度。結(jié)果計(jì)算對(duì)照品比較法 可根據(jù)供試品溶液及對(duì)照品溶液的吸光度與對(duì)照品溶液的濃度以正比法算出供試品溶液的濃度，再計(jì)算含量。C樣品=A樣品×C對(duì)照/A對(duì)照式中 A為吸光度值;C為測(cè)試液濃度（以mg/ml計(jì)）。1cm6.2 吸收系數(shù)法 中國(guó)藥典規(guī)定的吸收系數(shù)，系指

E1%

，即在指定波長(zhǎng)時(shí)，光路ingsomethi長(zhǎng)度為lcm，試樣濃度換算為1%（g/ml）時(shí)的吸光度值，故應(yīng)先求被測(cè)樣品的E1%

值，再與規(guī)定的

E

1%

值比較，可計(jì)算出供試樣品的含量。1cm 1cm（樣品）=1cmE1%AC

L式中A為供試品溶液測(cè)得的吸光度值;C為供試品溶液的百分濃度，即100ml中所含溶質(zhì)的克數(shù)（g/ml）;L為吸收池的光路長(zhǎng)度（cm）。供試品的含量%=×100E1%E1%1cm(標(biāo)準(zhǔn))1cm(樣品)1cm式中 E

1%

（樣品）為根據(jù)前式計(jì)算出的供試品吸收系數(shù);1cmE

1%

（標(biāo)準(zhǔn)）為藥典或藥品標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的吸收系數(shù)。吸收系數(shù)測(cè)定法本法主要用于新品種的吸收系數(shù)測(cè)定。測(cè)定方法 取精制樣品精密稱取一定量，使樣品溶液配成吸光度讀數(shù)在0.6~0.8之間，置l℃m吸收池中，在規(guī)定波長(zhǎng)處按5.8項(xiàng)的規(guī)定測(cè)出吸光度讀數(shù)，然后再用同批溶劑將溶液稀釋1倍，使吸光度在0.3~0.4之間，再按上述方法測(cè)定。樣品應(yīng)同時(shí)測(cè)定2份，同一臺(tái)儀器測(cè)定的2份結(jié)果，對(duì)平均值的偏差應(yīng)不超過±0.3%，否則應(yīng)重新測(cè)定。測(cè)定時(shí)，先按儀器正常靈敏度測(cè)試，然后再減小狹縫測(cè)定，直到減小狹縫吸光值不增加為止，取吸光度不改變的數(shù)據(jù)。再用4臺(tái)不同型號(hào)的儀器復(fù)測(cè)。吸收系數(shù)可根據(jù)朗伯-比爾定律求算，以下例說明:已知某化合物的分子