納米孔單分子測(cè)序技術(shù)及其應(yīng)用簡介

納米孔單分子測(cè)序技術(shù)及其應(yīng)用簡介（中國器審2024年08月15日）單分子測(cè)序（Single-moleculeSequencing，SMS）是在第一代Sanger測(cè)序、第二代NGS高通量測(cè)序技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的第三代測(cè)序技術(shù)。因其測(cè)序時(shí)DNA分子無需PCR擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)了對(duì)每一條DNA分子的單獨(dú)測(cè)序而得名。HelicoBioscices公司基于合成測(cè)序理論于2008年推出了世界上第一款單分子測(cè)序平臺(tái)HeliScope，但其測(cè)序的平均讀長相對(duì)較短，系統(tǒng)整體測(cè)序錯(cuò)誤率較高[1]。之后出現(xiàn)了單分子的長讀長測(cè)序技術(shù)，目前已經(jīng)實(shí)現(xiàn)商業(yè)化的長讀長測(cè)序技術(shù)主要有PacificBiosciences（PacBio）公司的單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)（Single-moleculeReal-time，SMRT）和OxfordNanopore公司（OxfordNanoporeTechnologies，ONT）的納米孔測(cè)序技術(shù)[2]。SMS和SMRT技術(shù)主要是將４種不同的堿基轉(zhuǎn)化為熒光信號(hào)，然后通過轉(zhuǎn)化放大后的信號(hào)對(duì)堿基進(jìn)行區(qū)分。而納米孔測(cè)序技術(shù)則是將４種堿基轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，然后對(duì)電信號(hào)進(jìn)行收集、整理、轉(zhuǎn)化與數(shù)據(jù)輸出，與單分子熒光測(cè)序技術(shù)在信號(hào)處理上存在較大差異，故而納米孔測(cè)序技術(shù)也被稱為第四代測(cè)序技術(shù)。本文將主要介紹納米孔單分子測(cè)序技術(shù)的原理、特點(diǎn)及其在體外診斷領(lǐng)域的應(yīng)用。一、納米孔測(cè)序的原理納米孔單分子測(cè)序技術(shù)是基于電信號(hào)測(cè)序的技術(shù)，相對(duì)于其他測(cè)序技術(shù)，納米孔測(cè)序技術(shù)的樣本處理極其簡單，無需DNA聚合酶或者連接酶，也無需dNTPs，其測(cè)序過程中包含了以下幾種關(guān)鍵物質(zhì)，如圖1、圖2所示。納米孔蛋白（Nanopore），可以嵌入到細(xì)胞膜中作為離子或分子通道的跨膜蛋白，具有天然的蛋白納米孔。多聚物薄膜（Membrane），跨膜蛋白會(huì)被嵌入到高電阻率的由人工合成的多聚物膜中，膜兩側(cè)是離子溶液，在兩側(cè)加不同的電位，離子就會(huì)在孔中流動(dòng)，形成電流。馬達(dá)蛋白（Motorprotein），在納米孔測(cè)序文庫構(gòu)建時(shí)，需要在接頭上連接一種馬達(dá)蛋白，用于將DNA或RNA分子推入納米孔中。連接臂（Tether），用于錨定DNA或RNA鏈，防止其在溶液中飄動(dòng)，并使其進(jìn)入納米孔中。將人工合成的多聚物膜浸沒在離子溶液中，膜上布滿了由解旋酶和蛋白孔兩部分組成的跨膜通道蛋白納米孔，在膜兩側(cè)施加不同電壓形成電壓差。由于多聚物膜不可導(dǎo)電，電流只能通過納米孔進(jìn)行傳導(dǎo)。連接臂引導(dǎo)待測(cè)鏈進(jìn)入納米孔，待測(cè)鏈在馬達(dá)蛋白的牽引下經(jīng)解螺旋后以單鏈形式穿過納米孔（如圖1）。不同堿基在通過納米孔的恒定的電場(chǎng)時(shí)會(huì)引起電流不同幅度的變化，使用計(jì)算機(jī)軟件及人工智能算法識(shí)別并推斷出堿基類型，從而完成了DNA或RNA的測(cè)序[3]（如圖2）。二、納米孔的類型1.生物納米孔納米孔測(cè)序的概念首次在80年代被提出，并且隨著納米孔蛋白及馬達(dá)蛋白的技術(shù)發(fā)展而得以實(shí)現(xiàn)。第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)可以通過DNA或RNA影響離子電流并能使之被檢測(cè)到的納米孔蛋白是1996年Kasianowicz等提出的α-溶血素蛋白[4]。但是因DNA通過納米孔的速率過快，而無法獲得有效的電流信號(hào)。之后的2010年，恥垢分枝桿菌蛋白A（Msp-A）納米孔被發(fā)現(xiàn)可以減緩DNA穿過納米孔的速度，提高DNA單堿基的檢測(cè)靈敏度[5]。隨后，2014年研究者發(fā)現(xiàn)使用phi29DNA聚合酶作為馬達(dá)蛋白[6]，可以控制DNA穿過納米孔的速度。生物納米孔主要包含以上3種，均為由某種蛋白質(zhì)分子鑲嵌在磷脂膜上形成的天然納米孔，可以進(jìn)行靈活的生物化學(xué)修飾。然而生物納米孔在膜穩(wěn)定性、電流噪聲等方面的問題在一定程度上限制了其發(fā)展。牛津納米孔公司在蛋白納米孔的應(yīng)用方面取得了一定進(jìn)展，他們的GridION和MinION系統(tǒng)就是基于生物蛋白納米孔的測(cè)序平臺(tái)。

2.

固態(tài)納米孔Li等在2001年開啟了固態(tài)納米孔的研究[7]。固態(tài)納米孔主要是在氧化硅、石墨烯等固態(tài)材質(zhì)上通過離子束刻蝕等技術(shù)制備出的納米孔，因其尺寸可調(diào)、可靠性高、易修改等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于DNA測(cè)序、蛋白質(zhì)檢測(cè)和能量轉(zhuǎn)換等研究領(lǐng)域[8]，其中比較常見用于DNA檢測(cè)的固態(tài)納米孔是氮化硅納米孔和石墨烯納米孔。相比于生物納米孔，固態(tài)納米孔在穩(wěn)定性、電流噪聲、工藝集成方面有著顯著的優(yōu)勢(shì)，但是因?yàn)槭芟抻谌缃竦陌雽?dǎo)體工藝制造水平，固態(tài)納米孔的制造還較為復(fù)雜與昂貴。三、納米孔測(cè)序的特點(diǎn)相比于其他測(cè)序平臺(tái)，納米孔測(cè)序作為一種新型測(cè)序技術(shù)在成本、速度、讀長和準(zhǔn)確率等諸多方面有著不同的特點(diǎn)，其優(yōu)勢(shì)十分顯著，主要可以概括為以下幾點(diǎn)：1.較長的測(cè)序讀長納米孔測(cè)序技術(shù)利用堿基穿過納米孔時(shí)電信號(hào)的改變實(shí)現(xiàn)測(cè)序，理論上可檢測(cè)通過納米孔的全部核酸序列，讀長長度僅受限于所測(cè)單鏈DNA的長度[9]。長度長可以提供更完整、更連續(xù)的基因組組裝，在具有大型結(jié)構(gòu)變異和高水平重復(fù)區(qū)域的基因組中優(yōu)勢(shì)顯著。2.可快速實(shí)時(shí)測(cè)序相比于其他傳統(tǒng)測(cè)序，納米孔測(cè)序真正意義上做到了動(dòng)態(tài)實(shí)時(shí)測(cè)序，可邊測(cè)序邊輸出結(jié)果，用戶可以在測(cè)序早期了解樣本的質(zhì)量和狀態(tài)，也可以在獲得足夠的數(shù)據(jù)后停止測(cè)序。同時(shí)納米孔測(cè)序技術(shù)所需的時(shí)長也是遠(yuǎn)遠(yuǎn)短于其他測(cè)序方法，節(jié)約了操作時(shí)間同時(shí)降低了測(cè)序成本。3.納米孔測(cè)序設(shè)備簡單便攜目前使用最成熟的MinION測(cè)序儀尺寸只有一支筆的長度，重量大約100g，長度僅10cm，可使用高速USB插入電腦，以其極小的體積徹底顛覆了人們對(duì)測(cè)序儀的印象，被稱為“Ｕ盤測(cè)序儀”[10]。因其便攜性，可在實(shí)驗(yàn)室、野外甚至太空等各種復(fù)雜環(huán)境下完成實(shí)時(shí)測(cè)序，可保證對(duì)突發(fā)疫情處理的時(shí)效性。

4.可直接對(duì)RNA進(jìn)行測(cè)序納米孔測(cè)序可以直接對(duì)各類原始DNA和RNA進(jìn)行測(cè)序，不僅節(jié)省了時(shí)間和成本，完整地保留堿基修飾的信息，還能避免將RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA擴(kuò)增所產(chǎn)生的偏向性及可能引入的突變。其文庫制備的工作流程也較為簡單。雖然納米孔測(cè)序的優(yōu)點(diǎn)十分明顯，與前幾代技術(shù)相比在成本、速度方面有著很大優(yōu)勢(shì)，但是目前還處在起步階段，從測(cè)序原理到制造工藝都存在有許多問題。首先，檢測(cè)準(zhǔn)確度相對(duì)較低，這是納米孔測(cè)序發(fā)展過程中一直致力于解決的問題，除了通過優(yōu)化納米孔和馬達(dá)蛋白外，還通過獨(dú)立研究開發(fā)的算法來解決準(zhǔn)確度的問題。其次，檢測(cè)通量和文庫產(chǎn)量也限制了該技術(shù)的應(yīng)用。目前仍然缺乏針對(duì)少量樣品的高產(chǎn)量文庫制備和測(cè)序規(guī)范流程。而且也并非總是能夠從臨床樣本中獲得足夠大且完整的高分子量DNA和全長RNA。讀取長度和產(chǎn)量之間仍需權(quán)衡。四、納米孔測(cè)序的應(yīng)用納米孔測(cè)序有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：長度長，測(cè)序速度快，這讓它在某些場(chǎng)景中占有很大的優(yōu)勢(shì)，但是通量偏低、價(jià)格高、準(zhǔn)確度偏低也嚴(yán)重限制了它的應(yīng)用場(chǎng)景。根據(jù)之前的分析，對(duì)讀長要求高，但是對(duì)序列數(shù)和準(zhǔn)確度要求不高的應(yīng)用場(chǎng)景才是納米孔測(cè)序的最適場(chǎng)景。1.大基因組拼接在以往基于短片段的基因組拼接中，由于一些動(dòng)植物基因組本身具有多倍體，高度重復(fù)，高度雜合的特性，導(dǎo)致基因組拼接異常艱難。而納米孔測(cè)序技術(shù)具有長讀長的特點(diǎn)，利于大基因組的拼接，可以極大的提高基因組的完整性。2.全長轉(zhuǎn)錄組以往的轉(zhuǎn)錄組分析由于無法直接對(duì)RNA進(jìn)行測(cè)序，往往需要先對(duì)mRNA進(jìn)行打斷，再反轉(zhuǎn)錄為cDNA，無法獲取和分析全長轉(zhuǎn)錄本。納米孔的長讀長特點(diǎn)可以準(zhǔn)確識(shí)別各基因的多個(gè)同源異構(gòu)體，簡單準(zhǔn)確；并且可以直接測(cè)序RNA，直接識(shí)別RNA的堿基修飾。3.大片段結(jié)構(gòu)變異基因組上會(huì)產(chǎn)生很多與人類疾病相關(guān)的大片段結(jié)構(gòu)變異（如缺失、倒位和易位等），短測(cè)序讀長無法準(zhǔn)確檢測(cè)這些變異，而納米孔測(cè)序的讀長較長，適合進(jìn)行大片段結(jié)構(gòu)變異的檢測(cè)，在疾病研究等方面具有良好的發(fā)展前景。4.病原微生物快速鑒定[11]由于納米孔測(cè)序具有實(shí)時(shí)，快速的特點(diǎn)，可以在采集點(diǎn)直接進(jìn)行測(cè)序，實(shí)時(shí)得到序列信息進(jìn)行物種分類鑒定，完成病原微生物的快速鑒定。目前納米孔測(cè)序技術(shù)在傳染病、臨床感染病原快速檢測(cè)中的應(yīng)用研究較為廣泛。五、結(jié)論與展望納米孔測(cè)序技術(shù)近年來發(fā)展迅猛，相比于其他測(cè)序技術(shù)，其憑借著超長讀長、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)、簡單便攜等特點(diǎn)開始被廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域，但是目前納米孔測(cè)序技術(shù)也不盡完美。目前國內(nèi)外多家企業(yè)在研發(fā)準(zhǔn)備申報(bào)相關(guān)單分子測(cè)序產(chǎn)品的過程中，主要集中在病原體檢測(cè)和腫瘤、遺傳病早篩等方向，后續(xù)我們會(huì)繼續(xù)關(guān)注相關(guān)產(chǎn)品的準(zhǔn)確度、檢測(cè)通量及文庫制備的相關(guān)技術(shù)進(jìn)展。

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