生物素-（鏈霉）親和素系統(tǒng)及其在體外診斷試劑中的應(yīng)用

生物素-（鏈霉）親和素系統(tǒng)及其在體外診斷試劑中的應(yīng)用（中國器審2024-02-28）一、前言生物素-親和素（鏈霉親和素）系統(tǒng)因其具有的特異性高親和力和級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，已被廣泛應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)領(lǐng)域當(dāng)中。樣本中高濃度生物素可能會(huì)對(duì)該檢測系統(tǒng)產(chǎn)生干擾。日常的生物素?cái)z入量通常不會(huì)產(chǎn)生干擾，但是近來隨著高劑量生物素的攝入以及更高劑量生物素的治療措施，生物素對(duì)體外診斷試劑的干擾以及對(duì)臨床檢驗(yàn)造成的風(fēng)險(xiǎn)引起人們廣泛關(guān)注。由于高劑量生物素的攝入人群分布評(píng)估差異很大，因此引起的不良事件也多有報(bào)道。由于在一項(xiàng)藥物臨床實(shí)驗(yàn)中觀察到因生物素干擾引起的檢測結(jié)果不準(zhǔn)確而導(dǎo)致嚴(yán)重不良事件，F(xiàn)DA先后出臺(tái)了應(yīng)對(duì)生物素干擾的警示信息及相應(yīng)指南。IVD生產(chǎn)企業(yè)也采取不同的措施來降低生物素干擾的影響。以下從生物素-親和素系統(tǒng)、生物素干擾機(jī)制、解決干擾的方法、對(duì)監(jiān)管的思考等幾個(gè)方面對(duì)該問題進(jìn)行探討。二、生物素-親和素系統(tǒng)生物素（biotin），又稱為維生素B7，維生素H，輔酶R，是一種水溶性維生素，分子量僅有244.31Da，在細(xì)胞中作為一種重要的輔酶，參與多條代謝途徑，如糖代謝、脂肪酸合成、氨基酸代謝、糖原異生等。在體內(nèi)生物素存在結(jié)合與游離兩種形態(tài)，大約12%的生物素是共價(jià)結(jié)合，7%為可逆結(jié)合，其余80%左右為游離生物素。人體需要從外界攝入生物素來滿足自身需求，通常通過膳食補(bǔ)充即可。生物素天然存在于多種食物（如蛋、肉、谷物、綠色蔬菜等）中，也可由腸道細(xì)菌合成。在復(fù)合維生素、孕期維生素以及促進(jìn)頭發(fā)、皮膚和指甲生長的營養(yǎng)品中也含有較高計(jì)量生物素。此外高劑量的生物素也可非處方用于糖尿病、脂代謝異常、生物素合成酶缺乏、羧化酶缺乏以及周圍神經(jīng)病變的醫(yī)學(xué)用途。圖1.生物素的結(jié)構(gòu)親和素（avidin）是一種糖蛋白，分子量為67~68kd，每個(gè)分子由四個(gè)亞基組成，能夠與4個(gè)生物素緊密結(jié)合。Neutravidin和鏈霉親和素（streptavidin）類似，是去除糖基化的親和素，分子量小于avidin，偏中性，其保留了對(duì)生物素的高親和力，但是非特異結(jié)合特性降低。鏈霉親和素從親和素鏈霉菌（Streptomycesavidinii）中分離，因其更低的非特異性而得到廣泛應(yīng)用。生物素-親和素系統(tǒng)（Biotin-（Strept）Avidin

System，BAS）是70年代末發(fā)展起來的一種新型生物反應(yīng)放大系統(tǒng)。生物素可與大多數(shù)蛋白、酶及其他分子的氨基共價(jià)結(jié)合形成偶聯(lián)物，親和素也可通過共價(jià)鍵連接到修飾的磁珠、固相載體等介質(zhì)上，而1分子親和素可與4分子生物素以非共價(jià)鍵的形式形成高親和力的結(jié)合，并且可以耐受pH值的變化、去污劑、多次洗脫步驟、螯合劑以及其他極端反應(yīng)條件（如溫度）。生物素與親和素之間的高親和力與級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)使BAS的免疫標(biāo)記和有關(guān)的示蹤分析更加靈敏，在不同檢測系統(tǒng)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。大約85%常見的化學(xué)發(fā)光分析儀采用了基于BAS的檢測方法。三、樣本中的生物素對(duì)BAS檢測系統(tǒng)的干擾1.生物素干擾的機(jī)制生物素干擾是基于BAS的檢測方法中普遍存在的問題。采用親和素-生物素系統(tǒng)進(jìn)行免疫檢測時(shí)，如果待測樣本中存在高濃度的游離生物素，將與生物素化抗體競爭結(jié)合親和素的結(jié)合位點(diǎn)，若超過耐受的閾值，有可能影響檢測結(jié)果。生物素干擾生物素化免疫檢測的機(jī)制因檢測原理不同而不同。生物素的干擾在競爭法和夾心法中表現(xiàn)出相反的方向。當(dāng)生物樣本含有過量的生物素時(shí)，生物素會(huì)與生物素化抗體或抗原競爭結(jié)合到鏈霉親和素包被的磁性表面，導(dǎo)致生物素化抗體或抗原的捕獲減少。過量的生物素會(huì)在夾心免疫測定中產(chǎn)生錯(cuò)誤的低結(jié)果，因?yàn)闇y定信號(hào)與分析物濃度成正比。在競爭性免疫測定中，過量的生物素會(huì)導(dǎo)致結(jié)果錯(cuò)誤地升高，因?yàn)闇y定信號(hào)與分析物濃度成反比。競爭法通常用于小分子的檢測，如睪酮，雌二醇、皮質(zhì)醇、類固醇、T3（三碘甲狀腺原氨酸）和T4、羥基維生素D等。已有多篇文獻(xiàn)描述了生物素干擾的具體細(xì)節(jié)。2.生物素干擾依賴于幾個(gè)因素：免疫檢測試劑的組成及檢測原理、患者服用生物素的劑量，樣本中生物素的濃度，以及從最后一次服用生物素到樣本采集的時(shí)間間隔等。外源過量生物素不太會(huì)對(duì)不采用生物素和鏈霉親和素系統(tǒng)的檢測方法產(chǎn)生干擾，對(duì)于采用生物素-親和素系統(tǒng)的檢測試劑則需要充分評(píng)估生物素可能產(chǎn)生的干擾。每日攝入的生物素在不同年齡與狀態(tài)的人群中參考量不同。美國推薦的生物素?cái)z入量不同人群有所不同，總體在5~35μg/d的范圍。中國居民膳食生物素參考攝入量AI適宜攝入量）值為5~50μg/d。高劑量的攝入生物素有可能使人體樣本中的生物素超過檢測試劑的閾值從而干擾檢測結(jié)果。以美甲、護(hù)膚、美發(fā)為目的生物素?cái)z入可高達(dá)1250~2500μg/d，而多發(fā)性硬化癥患者服用高達(dá)300mg/d的生物素，其他一些生物素缺乏的相關(guān)罕見病每日服用的生物素劑量也達(dá)到10~40mg。血液中的生物素濃度及代謝動(dòng)力學(xué)不同研究有不同結(jié)果。30μg/日的生物素?cái)z入量，正常循環(huán)濃度通常為0.1至0.8ng/mL。生物素在攝入后迅速吸收，并在1至2小時(shí)內(nèi)達(dá)到血漿濃度峰值?？诜?0mg劑量，相當(dāng)于非處方藥中的一些最高劑量，導(dǎo)致血漿峰濃度范圍為55至140ng/mL(225~573nmol/L)。而口服劑量100mg導(dǎo)致血漿峰濃度范圍為375至450ng/mL(1535~1842nmol/L)。多發(fā)性硬化癥患者口服生物素300mg/d，可導(dǎo)致血漿/血清生物素水平大于1000ng/mL。當(dāng)每日攝入500mg生物素，會(huì)導(dǎo)致血液中的生物素濃度非常高，從而干擾檢測結(jié)果。不同試劑受到生物素干擾的程度也不同，生物素干擾水平從31.35~1000ng/mL（0.13~4.09μM）不等。生物素積累效應(yīng)也確實(shí)存在。研究結(jié)果顯示，每天連續(xù)給藥到第7天的循環(huán)濃度是第1天同一時(shí)間點(diǎn)的兩倍。研究數(shù)據(jù)表明持續(xù)攝入生物素3天后可達(dá)到穩(wěn)態(tài)濃度。此外攝入的生物素濃度不同，血液中的清除半衰期也不同，血漿生物素的半衰期為110分鐘，理論上5.5個(gè)半衰期（大約9小時(shí)）可以從血循環(huán)中清除。低濃度的生物素從健康個(gè)體的循環(huán)中迅速清除，消除半衰期約為2小時(shí)，而高劑量實(shí)驗(yàn)表明半衰期長達(dá)18.8小時(shí)。一項(xiàng)針對(duì)表觀健康個(gè)體的藥代動(dòng)力學(xué)研究表明，口服生物素劑量為1、5、10、100和300毫克的生物素之后，分別在1、5.5、20、108和146小時(shí)后，血液濃度預(yù)計(jì)會(huì)降至20ng/mL(81.9nmol/L)以下。但是生物素的清除還受到腎功能的影響。文獻(xiàn)報(bào)道中血漿的中生物素濃度僅是游離生物素，而實(shí)際上生物素與蛋白存在著可逆的結(jié)合。目前沒有充分證據(jù)來明確服用生物素后多長時(shí)間再檢測會(huì)消除生物素干擾對(duì)檢測結(jié)果的影響。越來越多的文獻(xiàn)表明在促甲狀腺激素(TSH)、甲狀腺素等甲狀腺功能檢測、甲狀旁腺激素(PTH)、促腎上腺皮質(zhì)激素、催乳素、睪酮、皮質(zhì)醇等內(nèi)分泌檢測、腫瘤標(biāo)志物、心臟功能性標(biāo)志物等檢測中均不同程度收到生物素的干擾。在許多此類案例研究中，當(dāng)患者停止服用生物素時(shí)，受影響的實(shí)驗(yàn)室結(jié)果發(fā)生顯著變化證實(shí)了生物素干擾的存在。四、降低生物素干擾的方法1.系列稀釋樣本再進(jìn)行檢測。2.換一個(gè)對(duì)生物素不敏感的檢測方法進(jìn)行檢測，如液相質(zhì)譜法等，而質(zhì)譜法通常需要送到參考實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測。3.待生物素在體內(nèi)清除后再重復(fù)檢測，但是該方法現(xiàn)實(shí)中不易執(zhí)行，患者通常意識(shí)不到生物素可能會(huì)產(chǎn)生干擾。所需的時(shí)間與服用的生物素劑量，腎功能等多種因素有關(guān),短則2小時(shí)可清除低劑量的生物素，長則可需15天（如甲狀腺功能檢測試劑）甚至數(shù)月才能清除。對(duì)于多發(fā)性硬化癥或其他生物素缺乏相關(guān)疾病的人群來說延長時(shí)間重新檢測不太適用。4.清除游離生物素后再進(jìn)行檢測。樣本中的生物素可以通過包被有親和素/鏈霉親和素的固相介質(zhì)上（如磁珠、瓊脂微珠、硅化微珠等），與樣本混合孵育后去除親和素-親和素復(fù)合物。結(jié)合鏈霉親和素的多聚物可以預(yù)裝到小的注射器中，方便加載含生物素的樣本。需要注意的是清除方案需要全面評(píng)估后才能應(yīng)用。盡管經(jīng)過生物素清除后的檢測結(jié)果不能報(bào)告，但是可以提醒干擾的存在，讓患者避免攝入生物素后一定時(shí)間再次取樣進(jìn)行檢測。羅氏開發(fā)了專利抗體清除游離生物素減少樣本中的游離生物素。5.通過臨床一致性進(jìn)行驗(yàn)證。對(duì)于企業(yè)而言，開發(fā)不受生物素干擾的體系需要改變試劑的組成、進(jìn)行充分的性能驗(yàn)證、并且獲得監(jiān)管機(jī)構(gòu)的批準(zhǔn)。對(duì)于醫(yī)療結(jié)構(gòu)與患者，均應(yīng)當(dāng)意識(shí)到樣本中高劑量的生物素可能產(chǎn)生干擾，從而避免誤診或者采取錯(cuò)誤的治療措施。須注意的是生物素僅僅是可能產(chǎn)生干擾的一個(gè)因素之一。對(duì)于檢測結(jié)果的干擾，可能是由多個(gè)影響因素共同起作用，例如嗜異性抗體(如HAMA，HAAA)等，其他常見內(nèi)源性干擾物質(zhì)（如溶血、高血脂、高膽紅素等）等。因此需要更全面的進(jìn)行分析，結(jié)合臨床表型以及其他驗(yàn)證方法對(duì)結(jié)果進(jìn)行綜合判斷。五、監(jiān)管思考對(duì)于以生物素-親和素系統(tǒng)為基本原理的IVD試劑，樣本中生物素對(duì)檢測系統(tǒng)的干擾性是在產(chǎn)品設(shè)計(jì)開發(fā)中就需要考慮的問題。對(duì)于生物素干擾性的研究，EP37(2018年)文件中顯示生物素的最高藥物濃度為1.17E-01mg/dL(1.17ng/mL),建議的檢測濃度為3.51ng/mL。按照FDA的推薦劑量攝入30μg/d生物素通常不會(huì)對(duì)3.51ng/mL的閾值的產(chǎn)品產(chǎn)生生物素干擾。但是隨著生物素?cái)z入量的增加以及不良反應(yīng)的不斷報(bào)道，F(xiàn)DA先后發(fā)布警示信以及相關(guān)指南對(duì)生物素干擾進(jìn)行監(jiān)管，將需要研究的生物素最高濃度設(shè)定到3500ng/mL。部分企業(yè)已經(jīng)在陸續(xù)按照指南要求對(duì)各自的相關(guān)產(chǎn)品進(jìn)行生物素干擾評(píng)估，并采取不同的措施提高產(chǎn)品抗生物素干擾性能，使其能夠耐受高濃度的生物素干擾，如在說明書增加警示信息注明相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)，或者優(yōu)化產(chǎn)品設(shè)計(jì)、優(yōu)化檢測流程等。對(duì)于此類變更注冊的申請，需要綜合考慮產(chǎn)品發(fā)生的具體變化及其對(duì)產(chǎn)品性能的影響，通過充分的性能驗(yàn)證保證變更后產(chǎn)品的安全有效。

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