三七基因組分析及鐵皮石斛基因編輯體系的建立的開題報(bào)告

三七基因組分析及鐵皮石斛基因編輯體系的建立的開題報(bào)告一、研究背景及意義三七是傳統(tǒng)中藥材之一，其主要活性成分為三七皂苷。其具有調(diào)節(jié)血管張力、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、抗炎、抗病毒、抗菌等功效，因此被廣泛應(yīng)用于臨床。鐵皮石斛是另一種重要中藥材，其主要活性成分為多糖和皂苷。該藥材有明顯的免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗炎及抗腫瘤等功效，因此在中藥領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。近年來，基因組學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展為藥材研究帶來了全新的思路。通過基因組學(xué)研究可以識別重要基因、鑒定特異DNA序列、快速建立分類樹等。同時(shí)，基于CRISPR/Cas9的基因編輯技術(shù)也為藥材研究提供了很好的平臺，可以精準(zhǔn)、快速地改造藥材中的關(guān)鍵基因，進(jìn)而提高藥材的活性成分含量和藥效。因此，本研究將利用基因組分析技術(shù)和CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，分別對三七和鐵皮石斛的基因組進(jìn)行分析和編輯，以期實(shí)現(xiàn)對這兩種藥材的重大基礎(chǔ)研究和應(yīng)用開發(fā)。二、研究內(nèi)容及方法1.三七基因組分析（1）對三七品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，并鑒定特異DNA序列。采用IlluminaHiSeq2500高通量測序技術(shù)，基于得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行遺傳多樣性分析，并結(jié)合序列比對和注釋方法，篩選出具有物種特異性、生物學(xué)功能和重要調(diào)控作用的DNA序列；（2）對重要基因進(jìn)行鑒定和克隆。利用PCR擴(kuò)增技術(shù)，獲取主要活性成分合成相關(guān)酶基因、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路基因、轉(zhuǎn)錄因子基因等，建立基因序列庫；（3）應(yīng)用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，對選定基因進(jìn)行編輯，探究不同基因的編輯對活性成分含量的影響，以期找到調(diào)節(jié)三七藥效的關(guān)鍵基因。2.鐵皮石斛基因編輯體系的建立（1）尋找合適的體外培養(yǎng)方式，建立外植體再生體系；（2）設(shè)計(jì)并化學(xué)合成sgRNA，確定編輯靶點(diǎn)；（3）構(gòu)建CRISPR/Cas9載體；（4）將構(gòu)建好的CRISPR/Cas9載體轉(zhuǎn)化到外植體組織中；（5）篩選編輯成功的外植體組織，進(jìn)行檢測，驗(yàn)證編輯效果。三、研究預(yù)期成果1.三七基因組分析（1）確定三七品種遺傳多樣性情況，篩選出具有重要藥用功效的特異DNA序列；（2）鑒定與主要活性成分合成相關(guān)的基因，建立基因序列庫；（3）找到調(diào)節(jié)三七主要活性成分含量的關(guān)鍵基因，為探索三七藥理機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。2.鐵皮石斛基因編輯體系的建立（1）建立鐵皮石斛外植體再生體系，為后續(xù)基因編輯提供外植體材料；（2）成功構(gòu)建CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)對鐵皮石斛重要基因的編輯；（3）驗(yàn)證編輯效果，為后續(xù)鐵皮石斛藥效成分含量提高研究提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)支持。四、進(jìn)度安排本研究計(jì)劃分為兩年完成，預(yù)計(jì)進(jìn)度安排如下：第一年：三七基因組分析1-6月：收集三七樣品，進(jìn)行DNA提取和測序；7-12月：對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，鑒定重要基因，建立基因序列庫。第二年：鐵皮石斛基因編輯體系的建立1-6月：建立鐵皮石斛外植體再生體系；7-12月：構(gòu)建CRISPR/Cas9載體，并進(jìn)行基因編輯，驗(yàn)證編輯效果。五、預(yù)期貢獻(xiàn)本研究預(yù)期通過對三七和鐵皮石斛基因組的分析和編輯，找到調(diào)節(jié)藥效成分含量的關(guān)鍵基因和關(guān)鍵調(diào)控途徑，為進(jìn)一步探究三七和鐵皮石斛藥理機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。同時(shí)，通過鐵皮石斛基因編輯體系的建立，實(shí)現(xiàn)對鐵皮石斛重