JJF(魯) 138-2022 熒光定量PCR儀校準規(guī)范

JJF(魯)138-JJF（魯）138—2022JJF（魯）138—2022 （II） （1） （1） （1） （3） （4） （5） （5） （5） （6） （6） （6） （13） （13） （14） （18） （22）JJF（魯）138—2022《測量不確定度評定與表示》共同構成支撐校JJF（魯）138—20221實時熒光定量PCR儀校準規(guī)范本規(guī)范適用于實時熒光定量PCR儀的校準，其他類型PCR儀相同原理部分可參照本3.1PCR（聚合酶鏈反應）polymerasec3.2PCR儀（聚合酶鏈反應分析儀）polymerasechainreactionanalyze對擴增產(chǎn)物量進行定量分析，并通過對熒光的采集3.4溫度示值誤差temperatureindJJF（魯）138—202223.5溫度均勻度temperatur3.6溫度波動度temperature在被檢設備穩(wěn)定的狀態(tài)下，在規(guī)定的時間間隔3.7溫度最大過沖量temperaturemaxi3.8平均升溫速率mean3.11熒光強度精密度precisionoffluorescenceintensity對多個檢測孔在同一熒光條件下重復熒光強度檢測擴增過程前3～15個循環(huán)的熒光值的10倍標準差為閾值，當熒光值超過閾值時的循環(huán)數(shù)均熱塊不同測量孔在同一熒光條件下，閾值3.14熔解溫度melttemperature,TmPCR過程中均熱塊測量孔的熒光強度（縱坐標）與溫度（橫坐標）JJF（魯）138—20223.18通道峰值強度一致性channelpeak3.19線性靈敏系數(shù)linearsensitivityfactor,LSF注：理想的熒光定量PCR儀，線性靈敏度應該是1.00。LSF在0.80和1.20之間，溶解曲線呈現(xiàn)基本線性；LSF<0.80：在高熒光強度下線性降低，注意信號飽和；LSF>1.20：在低熒光強度下線性降低，注意最小信號檢測和靈敏度。3.20熔解溫度比ratioofmelttemperature,RTm注：RTm在0.80到1.20之間：相同產(chǎn)品熔解溫度不同，差異僅基于控溫模塊特性，熔解峰漂移與溫度不均勻直接相關；RTm>1.20：相同產(chǎn)品熔解溫度不同，差異是由控溫模塊、光學和光學檢測系統(tǒng)不準確共同導致的；RTm<0.80：相同產(chǎn)品熔解溫度不同，差異是與光學、光學檢測系統(tǒng)及分析軟件直接相關。3.21樣本示值誤差errorofsample’sindication實時熒光定量PCR儀，全稱為實時熒光定量聚對擴增基因進行定量分析的儀器。標記有熒光染料性、低溫復性和適溫延伸的熱循環(huán)后，與模板基因于反應體系中，在特定光激發(fā)下熒光染料發(fā)出熒光4基因片段呈指數(shù)規(guī)律增長，通過實時檢測與之對應的隨擴增而變實時熒光定量PCR儀均熱塊一般有32孔板、48孔板、96孔板和384孔板等幾種類型，其中96孔板應用最為廣泛。其主要由軟件控制系統(tǒng)、溫度控制模塊、熒光檢測模塊、均熱塊檢測孔組成，詳細結構如圖1所示。應用于新冠病毒核酸快速檢測的儀器檢測通量通常不大于16。1—光源2—濾光片3—準直器4—光導束5—樣品6—均熱塊檢測孔7—溫度傳感器8—加熱制冷供電9—光開關陣列10—光敏器11—電控裝置12—通訊接口13—計算機5計量特性實時熒光定量PCR儀計量性能指標如表1所示。備注1溫度示值誤差溫度項目2溫度均勻度3溫度波動度4/56JJF（魯）138—20225續(xù)表1實時熒光定量PCR儀計量性能指標7閾值循環(huán)數(shù)示值誤差光學系統(tǒng)物理項目8閾值循環(huán)數(shù)均勻度9閾值循環(huán)數(shù)精密度通道峰值強度一致性1±0.2線性靈敏系數(shù)1±0.2熔解溫度飄移熔解溫度比1±0.2樣本示值誤差光學系統(tǒng)生物化學項目樣本線性相關系數(shù)≥0.980注：以上所有指標不適用于合格性判別，僅供參考。6項目時，可根據(jù)客戶要求與實際情況選擇光學系統(tǒng)物理方法中的一種方法進行校準。對校準結果產(chǎn)生疑義或仲裁時，7.2校準方法實時熒光定量PCR儀均熱塊孔數(shù)少于96孔時，測量點為12個，布點圖(以48孔為例)如圖2所示，均熱塊孔數(shù)為其他數(shù)量時，可參照圖2布點。實時熒光定量PCR儀均熱塊孔數(shù)等于或大于96點時，測量點為15個，布點圖如圖3所示，均熱塊孔數(shù)為其他數(shù)量時，可參照圖3布點。也可以根據(jù)被測實時熒光定量PCR儀說明書或客戶要求，增加或減校準前將實時熒光定量PCR儀預熱30min。將儀器及光學標準器各部件連接完好，在光學標準器下部的溫度量導熱油，以確保其與均熱塊測量孔接觸良好。將光學標準器溫度項目校準時，典型的校準設置程序如表2步驟4～11所示(其中平均升、降溫速率的測量數(shù)據(jù)分別來源于步驟4～5和步驟5～6;溫度示值誤差的測量數(shù)據(jù)來源于步驟5~11;溫度均勻度、溫度波動度、溫度最大過沖量的測量數(shù)據(jù)來源于步驟5～10)。光學系統(tǒng)采用物理校準方法時，典型的校準設置程序如表2步驟12～16所示(步驟12和步驟13之間設定程序循環(huán)32次)。光學系統(tǒng)采用生物化學校準方法時，典型的校準設置程序如表JJF（魯）138—2022表2溫度項目、光學系統(tǒng)物理項目典型的校準設置程序步驟設定溫度點持續(xù)時間（s）備注13060預熱程序295603306043060溫度技術指標校準程序595630790850970603060模擬光學擴增程序：在85℃/60℃之間循環(huán)32次，同時進行光學檢測。603095擴增變性程序6030熔解曲線分解過程95表3光學系統(tǒng)生物化學項目典型的校準設置程序步驟設定溫度點持續(xù)時間（s）循環(huán)數(shù)15012956001395304546060i（1）T——溫度示值誤差，℃;8JJF（魯）138—2022 T TTuTmaxTmin（2）T Tmax——所有測溫傳感器測定值平均值的最大值，℃; Tmin——所有測溫傳感器測定值平均值的最小值，℃。Tfmax[(TjmaxTjmin)/2]（3）TTjmax——測量點j溫度傳感器在m次測量中的最高溫度，℃;Tjmin——測量點j溫度傳感器在m次測量中的最低溫度，℃。TtTtmax-Ts（4）TJJF（魯）138—20229TTT/n（5）Tah——平均升溫速率，℃/s；TTT/n（6）T精密度按照公式（9）計算Ct值的相對實驗標準偏差，以其作為Ct值精密度的表征。CtiCtqiCts（7）JJF（魯）138—2022RSDCtCtuCtqmaxRSDCtnnCtqii1nnCtm1qiCti——第i個采樣測量點閾值循環(huán)數(shù)Ct示值誤差；Cts——熒光信號達到閾值時光學標準器實際經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)；Ctu——閾值循環(huán)數(shù)均勻度；RSDCt——閾值循環(huán)數(shù)精密度；CPHCiLSFiBiCiBCABBiCiCPHCi——通道峰值強度一致性；JJF（魯）138—2022 Ai——第i個采樣孔測量熔解LSFi——線性靈敏系數(shù)。TTTRTm——熔解溫度比；Ttmax——所有采樣測量孔實時熒光定量PCR儀的Tm最大值，℃;Ttmin——所有采樣測量孔實時熒光定量PCRTJJF（魯）138—2022ccccs（14）c——樣本示值誤差，copies/μLcc——儀器測量平均值，copies/μLcs——標準物質(zhì)標稱值，copies/μLrn(CtiCt)(lncilnc)n(CtiCt)2(lncilnc)2r——線性相關系數(shù)；Cti——系列稀釋標準物質(zhì)的第i個擴增Ct值； 校準結果應在校準證書（報告）上反映，校準證書（報JJF（魯）138—2022h)如果與校準結果的有效性和應用有關時，應對被校樣品的抽樣程序進j)本次校準所用測量標準的溯源性及有效性說明；n)校準證書和校準報告簽發(fā)人的簽名、職務或等p)未經(jīng)實驗室書面批準，不得部分復制證書或報告的聲JJF（魯）138—2022實時熒光定量PCR儀校準原始記錄參考格式記錄編號：第X頁共X頁基本信息委托單位名稱：委托單位地址：儀器名稱：制造廠商：規(guī)格型號：出廠編號：校準依據(jù)：標準器信息計量標準（器）名稱計量標準證書號有效期至計量標準器證書號有效期至測量范圍準確度等級標準物質(zhì)信息標準物質(zhì)名稱型號規(guī)格批號量值特性/不確定度證書編號有效日期環(huán)境溫度：℃環(huán)境濕度：%RH校準員：核驗員：一、溫度示值誤差、溫度均勻度設定點：次數(shù)測量點12345A1A4A7A10A12D1D7D12E4E10H1H4H7H10H12JJF（魯）138—2022記錄編號：第X頁共X頁設定溫度點(℃)305060709095測量點實測溫度平均值 (℃)A1A4A7A10A12D1D7D12E4E10H1H4H7H10H12平均值(℃)實測最高溫度(℃)實測最低溫度(℃)溫度示值誤差(℃)不確定度(℃)溫度均勻度(℃)二、溫度波動度設定點：次數(shù)測量點123456789A1A4A7A10A12D1D7D12E4E10H1H4H7H10H12JJF（魯）138—2022記錄編號：第X頁共X頁Tmax-Tmin305060709095測量點(℃)A1A4A7A10A12D1D7D12E4E10H1H4H7H10H12溫度波動度(℃)三、溫度最大過沖量、平均升溫速率和平均降溫速率設定溫度點(℃)305060709095最低或最高測量值(℃)溫度最大過沖量(℃)平均升溫速率(℃/s）平均降溫速率(℃/s）四、閾值循環(huán)數(shù)（Ct值）示值誤差、均勻度、精密度（光學系統(tǒng)物理項目）類別熒光定量PCR儀光學標準器光學標準器不同分布位置測量的閾值循環(huán)數(shù)A1A4A7A10A12D1D7D12E4E10H1H4H7H10H12JJF（魯）138—2022記錄編號：第X頁共X頁閾值循環(huán)數(shù)示值誤差不確定度閾值循環(huán)數(shù)均勻度閾值循環(huán)數(shù)精密度（光學系統(tǒng)物理項目）T(℃)T(℃)TAiBiCiAi-BiBi-CiCPHCLSFRTm光學標準器分布位置A1A4A7A10A12D1D7D12E4E10H1H4H7H10H12平均值六、樣本示值誤差、樣本線性相關系數(shù)（光學系統(tǒng)生物化學項目）樣本值：項目測量值（copies/μL）U2樣本示值誤差：樣本線性系數(shù)：JJF（魯）138—2022設定溫度點(℃)305060709095溫度示值誤差(℃)溫度均勻度(℃)溫度波動度(℃)溫度最大過沖量(℃)平均升溫速率(℃/s）50℃→90℃平均降溫速率(℃/s）90℃→50℃閾值循環(huán)數(shù)示值誤差閾值循環(huán)數(shù)均勻度閾值循環(huán)數(shù)精密度通道峰值強度一致性線性靈敏系數(shù)熔解溫度漂移(℃)熔解溫度比樣本示值誤差（copies/μL）樣本線性相關系數(shù)JJF（魯）138—2022確保與加熱模塊接觸良好。按照儀器說明書或用TTTiT——采樣測量孔內(nèi)溫度示值誤差，℃;TT根據(jù)上述數(shù)學模型以及測量方法，其不確定度來源a)測量重復性引入的標準不確定度分量u1；b)溫度傳感器分辨力引入的標準不確定度分量u1；c)溫度傳感器準確度引入的標準不確定度分量u2。C.4.1重復性測量引入的不確定度分量u1sp(ykjyj)2j1k1m(n1)JJF（魯）138—2022ykj——第j個測量點第k次的測量值，℃; yj——第j個測量點測量值的平均值，℃;表C.1溫度測量結果次數(shù)測量點不同測量點溫度傳感器測量結果(℃)123456789A195.0194.9895.0194.9594.9894.9895.0195.0495.0194.98A495.2295.2295.2595.2595.2895.2295.1995.2295.1995.22A794.9394.9394.9394.9694.9394.9694.9394.9994.9194.96A1095.2695.2695.2695.2695.2695.2995.2695.2995.2695.26A1295.4995.4095.4095.4995.4695.5295.4695.4695.5295.46D195.0395.1595.0995.0995.0395.0695.0995.0995.06D794.9094.8794.8794.8294.9394.9094.8794.8494.8794.87D1295.3795.2695.2995.2995.3295.2095.2995.2995.3595.29E494.9494.8594.8594.8594.8594.9494.8894.8594.9794.91E1095.3795.2895.3495.2895.3495.3795.3195.2895.3495.31H195.4795.4795.5095.4795.5095.5095.4795.4795.4795.50H495.0395.0695.0695.0395.0995.0695.0695.0995.06H795.0395.0095.0395.0095.0095.0095.0095.0695.0095.00H1095.2595.2895.2595.3195.3195.2595.2895.2595.2595.28H1295.0194.9895.0194.9894.9594.9895.0194.9595.0395.01sp=0.0313℃u10.0134℃C.4.2溫度傳感器分辨力引入的不確定度u1'JJF（魯）138—2022者具有一定的相關性，因此在不確定度計算時不量u1'。C.4.3溫度傳感器準確度引入的標準不確定度分量u2；u20.058℃C.5合成標準不確定度ucc22 u1u2取k2，則：JJF（魯）138—2022并運行該程序，同時啟動PCR擴增光學