TGXAS-富硒花生中硒形態(tài)的測(cè)定高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法編制說(shuō)明

團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)《富硒花生中硒形態(tài)的測(cè)定高效液相色譜—電感耦合等離子體質(zhì)譜法》（征求意見稿）編制說(shuō)明項(xiàng)目來(lái)源根據(jù)《關(guān)于下達(dá)2021年第十一批團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)制修訂項(xiàng)目計(jì)劃的通知》（桂標(biāo)協(xié)﹝2021﹞28號(hào)）文件精神，由廣西大學(xué)提出，廣西大學(xué)、廣西西大檢測(cè)有限公司、杭州市食品藥品檢驗(yàn)研究院、蘇州堯智生態(tài)環(huán)保科技有限公司共同起草的團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)《富硒花生中硒形態(tài)的測(cè)定高效液相色譜—電感耦合等離子體質(zhì)譜法》（項(xiàng)目編號(hào)：2021-1101）。項(xiàng)目背景及目的意義食物是人體硒元素的主要來(lái)源，通過(guò)植物生產(chǎn)將土壤硒轉(zhuǎn)化為食物硒，提高食物鏈硒水平是預(yù)防硒缺乏和調(diào)控硒營(yíng)養(yǎng)的有效途徑。硒在自然界和生物體中有多種形態(tài)，自然界中的硒多以無(wú)機(jī)鹽形式存在，據(jù)硒鹽的毒理分析表明，無(wú)機(jī)硒均為劇毒，其中毒性較大的有硒酸鹽Se（VI）、亞硒酸鹽Se（IV），不易被人體吸收；而有機(jī)硒具有較高的生物利用度和生物活性，與人體代謝密切相關(guān)的有硒代蛋氨酸（SeMet）、硒代胱氨酸（SeCys2）、甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys）等。隨著我國(guó)居民保健需求的增加，保健品市場(chǎng)不斷擴(kuò)大，開發(fā)利用硒資源,生產(chǎn)富硒食品、保健品，已逐漸成為我國(guó)食品行業(yè)的一個(gè)新熱點(diǎn)。隨著研究水平和人類身體健康要求的不斷提高，人們認(rèn)識(shí)到元素的生理效應(yīng)、不光與元素的含量相關(guān)，只有當(dāng)元素以特定形態(tài)存在，并處于一定濃度范圍內(nèi)時(shí)，才會(huì)對(duì)生物體和生命系統(tǒng)發(fā)揮作用。與水稻等作物相比花生具有更強(qiáng)的硒元素富集能力，隨著人們保健意識(shí)的逐漸提升，對(duì)富硒花生的需求量逐漸增加，富硒花生價(jià)格30元/公斤，普通花生12元/公斤，價(jià)格差異明顯。由于當(dāng)下有關(guān)硒的檢測(cè)檢測(cè)方法和判定標(biāo)準(zhǔn)多以硒的總量為標(biāo)準(zhǔn)，部分不法商人為牟取高額利潤(rùn)，通過(guò)添加無(wú)機(jī)硒來(lái)提高總硒含量的“富硒”產(chǎn)品，導(dǎo)致富硒市場(chǎng)魚龍混雜，嚴(yán)重制約富硒花生產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。本標(biāo)準(zhǔn)《富硒花生中硒形態(tài)的測(cè)定高效液相色譜—電感耦合等離子體質(zhì)譜法》的前處理簡(jiǎn)便快捷，試劑無(wú)毒無(wú)害，檢測(cè)特異性強(qiáng)、靈敏度高，定量精準(zhǔn)，滿足花生中無(wú)機(jī)硒和多種有機(jī)硒形態(tài)分析的需要（硒代蛋氨酸、L-硒代胱氨酸、Se-甲基硒代-L-半胱氨酸、硒酸鈉、亞硒酸鈉），為食品中硒形態(tài)的分析鑒定提供了切實(shí)可行的方法依據(jù)。本標(biāo)準(zhǔn)的制定推動(dòng)硒檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展與進(jìn)步，有助于對(duì)硒的生物學(xué)功能進(jìn)行更全面而深入的了解；有助于富硒花生的深度開發(fā)利用，提高富硒花生的經(jīng)濟(jì)價(jià)值；有助于制定花生中有毒無(wú)機(jī)硒限量，為科學(xué)有效的進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供技術(shù)支撐和數(shù)據(jù)支持。目前關(guān)于花生硒含量限定主要為GH/T1135-2017《富硒農(nóng)產(chǎn)品》豆類總硒含量0.1mg/kg～1.00mg/kg,硒代氨基酸總量＞65％、DB45/T1061-2014《富硒農(nóng)產(chǎn)品硒含量分類要求》油料類總硒含量0.05mg/kg～0.5mg/kg；T/LYFLA004-2018《富硒花生》富硒花生果總硒含量0.1mg/kg～0.3mg/kg,富硒花生仁總硒含量0.2mg/kg～0.3mg/kg；檢測(cè)主要為GB5009.93-2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中硒的測(cè)定》、GB5009.268-2016kw《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中多元素的測(cè)定》，關(guān)于硒的測(cè)定方法主要有氫化物發(fā)生－原子熒光光譜法(HG－AFS)、氫化物發(fā)生－電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法、電化學(xué)分析法、氫化物發(fā)生－原子吸收光譜法(HG－AAS)、熒光法和極譜法等。當(dāng)下檢測(cè)方法仍以消解為主，硒限量主要為總硒含量或區(qū)分2種硒形態(tài)，且操作復(fù)雜，導(dǎo)致花生中硒含量限量安全閥值較窄，仍以硒總量、或僅可區(qū)分硒代氨基酸含量，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足當(dāng)下告訴發(fā)展的富硒行業(yè)。根據(jù)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，當(dāng)下花生硒檢測(cè)還存在的問(wèn)題如下：目前報(bào)道花生硒形態(tài)的檢測(cè)方法主要有分光光度法、毛細(xì)管電泳一電化學(xué)發(fā)光法、液相色譜法等，但均存在樣品前處理復(fù)雜或檢測(cè)硒形態(tài)種類較少等不足，效率低。高效液相色譜一電感耦合等離子體一質(zhì)譜(HPLC—ICP—MS)聯(lián)用技術(shù)具有接口簡(jiǎn)單、應(yīng)用廣泛、檢出限低、分離效率及靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，可同時(shí)完成不同硒形態(tài)的測(cè)定。當(dāng)前食品中硒形態(tài)含量檢測(cè)多針對(duì)糧谷，而花生研究相對(duì)較少，花生組成成分非常復(fù)雜，主要包括蛋白質(zhì)、脂肪和糖，此外還含有有糖類、維生素A、維生素B6、維生素E、維生素K，以及礦物質(zhì)鈣、鐵等營(yíng)養(yǎng)成分，含有8種人體所需的氨基酸及不飽和脂肪酸，含卵磷脂、膽堿、胡蘿卜素、粗纖維等物質(zhì)，且花生基質(zhì)以脂肪為主，與糧谷相比存在較大差異，但所用酶提取劑未有差異，導(dǎo)致酶提取過(guò)程中無(wú)法有效破壞植物組織和細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)天然物質(zhì)溶出量低，提取效率較低，不能滿足當(dāng)前檢測(cè)要求。本文件通過(guò)引用高效液相色譜－電感耦合等離子體－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，并選擇花生特異性水解酶（蛋白酶），達(dá)到簡(jiǎn)化操作、同時(shí)檢測(cè)5種形態(tài)硒的目的，大幅度提高富硒花生硒的檢測(cè)水平。標(biāo)準(zhǔn)編制過(guò)程（一）成立標(biāo)準(zhǔn)編制工作組團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)《富硒花生中硒形態(tài)的測(cè)定高效液相色譜—電感耦合等離子體質(zhì)譜法》項(xiàng)目任務(wù)下達(dá)后，成立了標(biāo)準(zhǔn)編制工作組，制定了標(biāo)準(zhǔn)編寫方案，明確任務(wù)職責(zé)，確定工作技術(shù)路線，開展標(biāo)準(zhǔn)研制工作，具體標(biāo)準(zhǔn)編制工作由廣西大學(xué)、廣西西大檢測(cè)有限公司、杭州市食品藥品檢驗(yàn)研究院、蘇州堯智生態(tài)環(huán)保科技有限公司相關(guān)人員配合。（二）收集整理文獻(xiàn)資料標(biāo)準(zhǔn)編制工作組收集了國(guó)內(nèi)與高效液相色譜—電感耦合等離子體質(zhì)譜法測(cè)定富硒花生中硒形態(tài)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，具體列出如下：GB/T5009.53《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中硒的測(cè)定》GB5009.268kw《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中多元素的測(cè)定》GB/T13883《飼料中硒的測(cè)定》DZ/T0253.2《生態(tài)地球化學(xué)評(píng)價(jià)動(dòng)植物樣品分析方法第2部分：硒量的測(cè)定原子熒光光譜法》NY/T3556《糧谷中硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸的測(cè)定液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法》DB45/T1175《植物類中藥材中總硒的測(cè)定原子熒光光譜法》DB45/T1061《富硒農(nóng)產(chǎn)品硒含量分類要求》（三）研討確定標(biāo)準(zhǔn)主體內(nèi)容標(biāo)準(zhǔn)編制工作組在對(duì)收集的資料進(jìn)行整理研究之后，標(biāo)準(zhǔn)編制工作組召開了標(biāo)準(zhǔn)編制會(huì)議，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的整體框架結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，并對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)鍵性內(nèi)容進(jìn)行了初步探討。經(jīng)過(guò)研究，標(biāo)準(zhǔn)的主體內(nèi)容確定為術(shù)語(yǔ)和定義、原理、試劑和材料、儀器和設(shè)備、試樣制備、分析步驟、結(jié)果計(jì)算、精密度。（四）調(diào)研、形成文本草案、征求意見稿2020年6月-2021年4月，標(biāo)準(zhǔn)起草工作小組進(jìn)行了廣泛調(diào)研工作，查閱了大量的國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)資料，對(duì)食品中硒形態(tài)的檢測(cè)方法進(jìn)行系統(tǒng)總結(jié)，并以富硒花生為試材，選擇花生特異性水解酶及確定儀器條件，進(jìn)行大量實(shí)驗(yàn)。經(jīng)編制組反復(fù)討論，形成了標(biāo)準(zhǔn)的基本構(gòu)架，對(duì)主要內(nèi)容進(jìn)行了討論并對(duì)項(xiàng)目的工作進(jìn)行了部署和安排。2021年5月～2021年10月，在前期工作的基礎(chǔ)之上，通過(guò)理清邏輯脈絡(luò)，整合已有參考資料中有關(guān)高效液相色譜—電感耦合等離子體質(zhì)譜法測(cè)定富硒花生中硒形態(tài)檢測(cè)方法，并結(jié)合前期預(yù)實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，按照簡(jiǎn)化、統(tǒng)一等原則編制完成團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)《富硒花生中硒形態(tài)的測(cè)定高效液相色譜—電感耦合等離子體質(zhì)譜法》（草案）。2021年11月～2022年3月，標(biāo)準(zhǔn)編制工作組在南寧市組織全區(qū)相關(guān)領(lǐng)域?qū)＜覍?duì)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)《富硒花生中硒形態(tài)的測(cè)定高效液相色譜—電感耦合等離子體質(zhì)譜法》（草案）進(jìn)行征求意見。并針對(duì)該檢測(cè)方法于廣西大學(xué)、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部亞熱帶果品蔬菜質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心、杭州市食品藥品檢驗(yàn)研究院進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，針對(duì)檢測(cè)結(jié)果經(jīng)過(guò)多次討論、研究，最終形成團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)《富硒花生中硒形態(tài)的測(cè)定高效液相色譜—電感耦合等離子體質(zhì)譜法》（征求意見稿）和編制說(shuō)明。標(biāo)準(zhǔn)制定原則（一）實(shí)用性原則本文件是在充分收集相關(guān)資料和文獻(xiàn)，根據(jù)現(xiàn)有食品中硒含量的檢測(cè)方法如，氫化物發(fā)生－原子熒光光譜法(HG－AFS)、氫化物發(fā)生－電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法、電化學(xué)分析法、氫化物發(fā)生－原子吸收光譜法(HG－AAS)、熒光法和極譜法等，優(yōu)化富硒花生中硒形態(tài)檢測(cè)方法，在現(xiàn)有國(guó)家、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)富硒花生中硒形態(tài)檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上，結(jié)合多年經(jīng)驗(yàn)而總結(jié)起草的。符合當(dāng)前富硒花生中硒形態(tài)檢測(cè)的要求，有利于行業(yè)的長(zhǎng)遠(yuǎn)發(fā)展，具有較強(qiáng)的實(shí)用性和可操作性。（二）協(xié)調(diào)性原則本文件編寫過(guò)程中注意了高效液相色譜—電感耦合等離子體質(zhì)譜法測(cè)定富硒花生中硒形態(tài)的技術(shù)要求與相關(guān)法律法規(guī)的協(xié)調(diào)問(wèn)題，在內(nèi)容上與現(xiàn)行法律法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)協(xié)調(diào)一致。（三）規(guī)范性原則本文件嚴(yán)格按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫》的要求和規(guī)定編寫本標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)容，保證標(biāo)準(zhǔn)的編寫質(zhì)量。（四）前瞻性原則本文件以的當(dāng)前食品中硒含量檢測(cè)方法為基礎(chǔ)，以富硒花生為原料，通過(guò)高效液相色譜—電感耦合等離子體質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定富硒花生中5種形態(tài)硒形態(tài)含量，為我國(guó)富硒花生中硒形態(tài)檢測(cè)、富硒產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展提供新途徑，在標(biāo)準(zhǔn)中體現(xiàn)了個(gè)別特色性、前瞻性和先進(jìn)性條款，作為對(duì)富硒花生中硒形態(tài)檢測(cè)技術(shù)的指導(dǎo)。標(biāo)準(zhǔn)主要章節(jié)內(nèi)容及確定依據(jù)自2020年起，廣西大學(xué)、廣西西大檢測(cè)有限公司等起草單位就已經(jīng)開始對(duì)富硒農(nóng)產(chǎn)品中不同硒形態(tài)進(jìn)行檢測(cè)，期間進(jìn)行了上百個(gè)樣品的檢測(cè)，數(shù)據(jù)量十分豐富，在不斷的試驗(yàn)過(guò)程中試驗(yàn)方法得到不斷完善，最終形成準(zhǔn)確度高、可操作性強(qiáng)的富硒花生中5種形態(tài)硒形態(tài)的檢測(cè)方法。（一）原理試樣中5種硒形態(tài)用酶提取，經(jīng)過(guò)反相液相色譜分離，電感耦合等離子體質(zhì)譜儀測(cè)定，外標(biāo)法定量。（二）試劑和材料1.以下所用試劑，除特殊注明外，均為優(yōu)級(jí)純?cè)噭?；?shí)驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T6682中一級(jí)水的要求。2.七氟丁酸（C4HF7O2，98%）。3.磷酸二氫鉀（KH2PO4），優(yōu)級(jí)純。4.甲醇（CH3OH）：色譜純。5.鏈霉蛋白酶E（PronaseE，Solarbio）。6.微孔濾膜(PES)：47mm，0.22μm。7.流動(dòng)相（30mmol/L磷酸二氫鉀-0.15％七氟丁酸-2％甲醇）：稱取8.1654g磷酸二氫鉀（KH2PO4）(精確到0.0001g）于2L水中，攪拌至溶解，過(guò)0.22μm微孔濾膜（PES)，再量取磷酸二氫鉀濾液1000mL于1L潔凈廣口瓶中，加入1.5mL七氟丁酸和20mL甲醇溶液，超聲30min，現(xiàn)配現(xiàn)用。8.標(biāo)準(zhǔn)品1）硒代蛋氨酸（化學(xué)式：C5H11NO2Se，CAS號(hào)：2578-28-1），純度≥98％。2）L-硒代胱氨酸（化學(xué)式：C6H12N2O4Se2，CAS號(hào)：29621-88-3），純度≥98％。3）Se-甲基硒代-L-半胱氨酸(化學(xué)式：C4H9NO2Se，CAS號(hào)：26046-90-2)，純度≥98％。4）硒酸鈉（化學(xué)式：Na2O4Se，CAS號(hào)：13410-01-0），純度≥98％。5）亞硒酸鈉（化學(xué)式：Na2SeO3，CAS號(hào)：10102-18-8），純度≥98％。9.標(biāo)準(zhǔn)溶液1）硒代蛋氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（100mg/L，按Se計(jì)）：稱取2.43mg硒代蛋氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，用水溶解并定容至10mL。0℃～4℃避光保存，有效期3個(gè)月。2）L-硒代胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（100mg/L，按Se計(jì)）：稱取4.15mgL-硒代胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，用水溶解并定容至10mL。0℃～4℃避光保存，有效期3個(gè)月。3）Se-甲基硒代-L-半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（100mg/L，按Se計(jì)）：稱取2.26mgSe-甲基硒代-L-半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，用水溶解并定容至10mL。0℃～4℃避光保存，有效期3個(gè)月。4）硒酸鈉標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（100mg/L，按Se計(jì)）：稱取2.34mg硒酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品，用水溶解并定容至10mL。0℃～4℃避光保存，有效期3個(gè)月。5）亞硒酸鈉標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（100mg/L，按Se計(jì)）：稱取2.15mg亞硒酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品，用水溶解并定容至10mL。0℃～4℃避光保存，有效期3個(gè)月。6）混合標(biāo)準(zhǔn)中間儲(chǔ)備液(1mg/L)：分別準(zhǔn)確吸取1.0mL硒代蛋氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(100mg/L)、L-硒代胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(100mg/L)、Se-甲基硒代-L-半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(100mg/L)、硒酸鈉標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(100mg/L)、亞硒酸鈉標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(100mg/L)于100mL容量瓶中，加水稀釋并定容至刻度。0℃～4℃避光保存，有效期3個(gè)月。7）混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(硒代蛋氨酸、L-硒代胱氨酸、Se-甲基硒代-L-半胱氨酸500μg/L；硒酸鈉100μg/L；亞硒酸鈉50μg/L）：分別準(zhǔn)確吸取50.0mL硒代蛋氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1mg/L)、L-硒代胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1mg/L)、Se-甲基硒代-L-半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1mg/L)；10.0mL硒酸鈉標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1mg/L)、5.0mL亞硒酸鈉標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1mg/L)于100mL容量瓶中，加水稀釋并定容至刻度。0℃～4℃避光保存，有效期2個(gè)月。8）混合標(biāo)準(zhǔn)使用液:取混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（5.8.4）0.1mL、0.5mL、1mL、2.5mL、5mL置于50mL容量瓶中，用超純水稀釋至刻度，混勻，得到以下系列標(biāo)準(zhǔn)使用液：—— 硒代蛋氨酸濃度為（1μg/L、5μg/L、10μg/L、25μg/L、50μg/L）（以Se計(jì)）；—— L-硒代胱氨酸濃度為（1μg/L、5μg/L、10μg/L、25μg/L、50μg/L）（以Se計(jì)）；—— Se-甲基硒代-L-半胱氨酸濃度為（1μg/L、5μg/L、10μg/L、25μg/L、50μg/L）（以Se計(jì)）；—— 硒酸鈉濃度為（0.2μg/L、1μg/L、2μg/L、5μg/L、10μg/L）（以Se計(jì)）；—— 亞硒酸鈉濃度為（0.1μg/L、0.5μg/L、1μg/L、2.5μg/L、5μg/L）（以Se計(jì)），現(xiàn)用現(xiàn)配。9.甲烷：純度99.999％。10.液氬：純度99.999％。（三）儀器和設(shè)備1.高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜儀:配碰撞反應(yīng)池。2.分析天平:感量為0.1mg和0.01mg。3.谷物粉碎機(jī)。4.恒溫振蕩器:振蕩轉(zhuǎn)速≥300r/min05.超聲波清洗器。6.離心機(jī):轉(zhuǎn)速15000r/min。7.渦旋混合器。8.旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。（四）測(cè)定步驟1.試樣制備將花生樣品干樣放入粉碎機(jī)中粉碎，全部過(guò)0.850mm的標(biāo)準(zhǔn)網(wǎng)篩，混勻，制備好的試樣平均分成兩份，裝入潔凈的盛樣容器內(nèi)，密封并標(biāo)明標(biāo)記。試樣常溫干燥保存。2.試樣提取稱取0.2g(精確至0.0001g)富硒花生樣品于50mL離心管中，加入20mg鏈霉蛋白酶E和20mL超純水，渦旋混勻，置于37℃水浴振蕩器中，振蕩提取2h,待提取結(jié)束后，于10000r/min離心30min，吸取上清液37℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮5倍，用1ml超純水渦旋2min，超聲復(fù)溶，過(guò)0.22μm的雙層水系濾膜，待測(cè)。3.測(cè)定（1）液相色譜條件—— 色譜柱：Hypersi1GOLDC8250mm×4.6mm，5μm液相色譜柱；—— 流動(dòng)相：30mmol/L磷酸二氫鉀-0.15％七氟丁酸-2％甲醇；—— 流動(dòng)相流速：1.0mL/min；—— 進(jìn)樣量：50μL。（2）電感耦合等離子體質(zhì)譜條件—— 霧化器：同心霧化器；—— 炬管內(nèi)徑：2.5mm；—— 釆樣錐/截取錐(Ni)孔徑：1.0/0.4mm；—— 采集質(zhì)量數(shù)：80；—— 采集模式：反應(yīng)模式；—— 高頻等離子體發(fā)射功率：1300W；—— 霧化器流量：0.88L/min；—— 甲烷氣體流量：0.6mL/min；—— 低質(zhì)量截?。?.45；—— 蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速：35rpm；—— 駐留時(shí)間：1000ms。4.標(biāo)準(zhǔn)曲線取混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，按濃度由低到高依次進(jìn)樣測(cè)定，以各硒形態(tài)色譜峰面積和濃度作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。5.試樣溶液測(cè)定取試樣溶液進(jìn)樣測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜保留時(shí)間定性，從標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的樣液中硒代蛋氨酸、L-硒代胱氨酸、Se-甲基硒代-L-半胱氨酸、硒酸鈉、亞硒酸鈉濃度。試樣溶液中5種硒形態(tài)的響應(yīng)值均應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)；當(dāng)試液超出線性范圍時(shí)，應(yīng)用流動(dòng)相（30mmol/L磷酸二氫鉀-0.15％七氟丁酸-2％甲醇）進(jìn)行適當(dāng)稀釋后進(jìn)樣測(cè)定。6.空白試驗(yàn)除不加試樣外，按2和3步驟，隨同試樣進(jìn)行空白試驗(yàn)。（五）計(jì)算及結(jié)果分析試樣中硒代蛋氨酸、L-硒代胱氨酸、Se-甲基硒代-L-半胱氨酸、硒酸鈉、亞硒酸鈉含量（以Se計(jì)）用質(zhì)量分?jǐn)?shù)ωi計(jì)，單位以毫克每千克（mg/kg）表示，按式（1）計(jì)算。 ωi=（Ci式中：ωi——試樣中硒代蛋氨酸、L-硒代胱氨酸、Se-甲基硒代-L-半胱氨酸、硒酸鈉、亞硒酸鈉含量，單位為毫克每千克（mg/kg）；Ci——樣液中硒代蛋氨酸、L-硒代胱氨酸、Se-甲基硒代-L-半胱氨酸、硒酸鈉、亞硒酸鈉濃度，單位為微克每升(μg/L）；C0——空白試液中硒代蛋氨酸、L-硒代胱氨酸、Se-甲基硒代-L-半胱氨酸、硒酸鈉、亞硒酸鈉濃度，單位為微克每升（μg/L）；V——試液最終定容體積，單位為毫升（mL）；N ——試液稀釋倍數(shù)；m ——試樣溶液所代表試樣的質(zhì)量，單位為克（g）；1000——換算系數(shù)。方法驗(yàn)證報(bào)告（一）檢出限表A1-1檢出限測(cè)試數(shù)據(jù)表（廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院）項(xiàng)目花生Se(IV)Se(VI)SeCys2SeMeCysSeMet檢出限(μg/L)0.10.10.10.20.2備注注：為實(shí)驗(yàn)室編號(hào)。Se(IV)—亞硒酸根;Se(VI)—硒酸根;SeCys2—硒代胱氨酸;SeMeCys—硒甲基硒代半胱氨酸;SeMet—硒代蛋氨酸。表A1-2檢出限測(cè)試數(shù)據(jù)表（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部亞熱帶果品蔬菜質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心）項(xiàng)目花生Se(IV)Se(VI)SeCys2SeMeCysSeMet檢出限(μg/L)0.10.10.10.20.2備注注：為實(shí)驗(yàn)室編號(hào)。Se(IV)—亞硒酸根;Se(VI)—硒酸根;SeCys2—硒代胱氨酸;SeMeCys—硒甲基硒代半胱氨酸;SeMet—硒代蛋氨酸。（二）精密度表A2-1方法精密度測(cè)試數(shù)據(jù)（廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院）平行測(cè)定次數(shù)樣品Se(IV)Se(VI)SeCys2SeMeCysSeMet測(cè)定結(jié)果（mg/kg）10.0980.016未檢出未檢出0.3920.0880.024未檢出未檢出0.4230.0920.023未檢出未檢出0.4540.0970.016未檢出未檢出0.3750.0840.019未檢出未檢出0.4560.0820.018未檢出未檢出0.3370.0790.017未檢出未檢出0.4680.0870.018未檢出未檢出0.4290.0860.021未檢出未檢出0.38100.0890.025未檢出未檢出0.32平均值(mg/kg）0.0880.020//0.40相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(%）6.916.9//12.4注：為實(shí)驗(yàn)室編號(hào)。Se(IV)—亞硒酸根;Se(VI)—硒酸根;SeCys2—硒代胱氨酸;SeMeCys—硒甲基硒代半胱氨酸;SeMet—硒代蛋氨酸。表A2-2方法精密度測(cè)試數(shù)據(jù)（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部亞熱帶果品蔬菜質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心）平行測(cè)定次數(shù)50μg/L混標(biāo)Se(IV)Se(VI)SeCys2SeMeCysSeMet測(cè)定結(jié)果（cps）10.0780.025未檢出未檢出0.3720.0850.019未檢出未檢出0.430.0910.02未檢出未檢出0.4540.0870.017未檢出未檢出0.4750.0890.018未檢出未檢出0.4560.0830.021未檢出未檢出0.3570.0760.022未檢出未檢出0.4280.0770.022未檢出未檢出0.4490.0760.016未檢出未檢出0.48100.0870.025未檢出未檢出0.37平均值(cps）0.0830.021//0.42相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(%）6.915.1//10.8注：為實(shí)驗(yàn)室編號(hào)。Se(IV)—亞硒酸根;Se(VI)—硒酸根;SeCys2—硒代胱氨酸;SeMeCys—硒甲基硒代半胱氨酸;SeMet—硒代蛋氨酸。表A2-3方法精密度測(cè)試數(shù)據(jù)（杭州市食品藥品檢驗(yàn)研究院）樣品編號(hào)Se(IV)含量（mg/kg）Se(VI)含量（mg/kg）SeCys2含量（mg/kg）SeMeCys含量（mg/kg）SeMet含量（mg/kg）10.0920.019未檢出未檢出0.4520.0990.022未檢出未檢出0.4330.0900.019未檢出未檢出0.4540.0950.018未檢出未檢出0.4150.0860.018未檢出未檢出0.4260.0780.015未檢出未檢出0.3670.0760.015未檢出未檢出0.3680.0880.018未檢出未檢出0.3690.0860.018未檢出未檢出0.33100.0760.015未檢出未檢出0.36平均值（mg/kg）0.0870.018//0.39相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(%)9.212.5//11.1（三）回收率表A3-1樣品加標(biāo)回收率測(cè)試數(shù)據(jù)（廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院）平行測(cè)定次數(shù)樣品低濃度加標(biāo)回收率Se(IV)Se(VI)SeCys2SeMeCysSeMet測(cè)定結(jié)果(μg/L）12.42.62.52.92.622.52.52.72.62.532.52.72.42.82.3平均值(μg/L）2.52.62.52.82.6加標(biāo)量(μg/L）3.03.03.03.03.0平均加標(biāo)回收率（%）82.286.784.492.285.6注：為實(shí)驗(yàn)室編號(hào)。Se(IV)—亞硒酸根;Se(VI)—硒酸根;SeCys2—硒代胱氨酸;SeMeCys—硒甲基硒代半胱氨酸;SeMet—硒代蛋氨酸。樣品中5種硒形態(tài)含量均為未檢出。表A3-2樣品加標(biāo)回收率測(cè)試數(shù)據(jù)（廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院）平行測(cè)定次數(shù)樣品中濃度加標(biāo)回收率Se(IV)Se(VI)SeCys2SeMeCysSeMet測(cè)定結(jié)果(μg/L）112.113.511.913.114.0212.813.712.013.614.0312.013.811.313.214.9平均值(μg/L）12.313.711.713.314.3加標(biāo)量(μg/L）15.015.015.015.015.0加標(biāo)回收率（%）82.091.178.288.795.3注：為實(shí)驗(yàn)室編號(hào)。Se(IV)—亞硒酸根;Se(VI)—硒酸根;SeCys2—硒代胱氨酸;SeMeCys—硒甲基硒代半胱氨酸;SeMet—硒代蛋氨酸。樣品中5種硒形態(tài)含量均為未檢出。表A3-3樣品加標(biāo)回收率測(cè)試數(shù)據(jù)（廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院）平行測(cè)定次數(shù)樣品高濃度加標(biāo)回收率Se(IV)Se(VI)SeCys2SeMeCysSeMet測(cè)定結(jié)果(μg/L）145.949.045.144.245.2246.946.545.944.645.9346.746.846.245.946.7平均值(μg/L）46.547.445.744.945.9加標(biāo)量(μg/L）50.050.050.050.050.0加標(biāo)回收率（%）93.094.991.589.891.9注：為實(shí)驗(yàn)室編號(hào)。Se(IV)—亞硒酸根;Se(VI)—硒酸根;SeCys2—硒代胱氨酸;SeMeCys—硒甲基硒代半胱氨酸;SeMet—硒代蛋氨酸。樣品中5種硒形態(tài)含量均為未檢出。表A3-4樣品加標(biāo)回收率測(cè)試數(shù)據(jù)（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部亞熱帶果品蔬菜質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心）平行測(cè)定次數(shù)樣品低濃度加標(biāo)回收率Se(IV)Se(VI)SeCys2SeMeCysSeMet測(cè)定結(jié)果(μg/L）12.72.62.82.52.522.52.52.72.42.732.62.42.62.22.7平均值(μg/L）2.62.52.72.42.6加標(biāo)量(μg/L）3.03.03.03.03.0加標(biāo)回收率（%）86.783.390.078.986.7注：為實(shí)驗(yàn)室編號(hào)。Se(IV)—亞硒酸根;Se(VI)—硒酸根;SeCys2—硒代胱氨酸;SeMeCys—硒甲基硒代半胱氨酸;SeMet—硒代蛋氨酸。樣品中5種硒形態(tài)含量均為未檢出。表A3-5樣品加標(biāo)回收率測(cè)試數(shù)據(jù)（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部亞熱帶果品蔬菜質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心）平行測(cè)定次數(shù)樣品中濃度加標(biāo)回收率Se(IV)Se(VI)SeCys2SeMeCysSeMet測(cè)定結(jié)果(μg/L）111.511.612.213.612.6211.211.512.412.912.2311.811.812.512.513.6平均值(μg/L）11.511.612.413.012.8加標(biāo)量(μg/L）15.015.015.015.015.0加標(biāo)回收率（%）76.777.682.486.785.3注：為實(shí)驗(yàn)室編號(hào)。Se(IV)—亞硒酸根;Se(VI)—硒酸根;SeCys2—硒代胱氨酸;SeMeCys—硒甲基硒代半胱氨酸;SeMet—硒代蛋氨酸。樣品中5種硒形態(tài)含量均為未檢出。表A3-6樣品加標(biāo)回收率測(cè)試數(shù)據(jù)（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部亞熱帶果品蔬菜質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心）平行測(cè)定次數(shù)樣品高濃度加標(biāo)回收率Se(IV)Se(VI)SeCys2SeMeCysSeMet測(cè)定結(jié)果(μg/L）132.335.634.834.435.3230.935.231.532.934.0332.533.831.635.835.5平均值(μg/L）31.934.932.634.434.9加標(biāo)量(μg/L）40.040.040.040.040.0加標(biāo)回收率（%）79.887.281.685.987.3注：為實(shí)驗(yàn)室編號(hào)。Se(IV)—亞硒酸根;Se(VI)—硒酸根;SeCys2—硒代胱氨酸;SeMeCys—硒甲基硒代半胱氨酸;SeMet—硒代蛋氨酸。樣品中5種硒形態(tài)含量均為未檢出。表A3-7樣品加標(biāo)回收率測(cè)試數(shù)據(jù)（杭州市食品藥品檢驗(yàn)研究院）回收率實(shí)驗(yàn)分離情況良好■較差□濃度組分水平13.0μg/L水平215.0μg/L水平350.0μg/L測(cè)量值（μg/L）回收率%測(cè)量值（μg/L）回收率%測(cè)量值（μg/L）回收率%Se(IV)2.32.22.276.711.412.412.376.046.544.444.093.073.382.788.873.382.088.0Se(VI)2.92.72.696.712.813.412.885.348.748.047.697.490.089.396.086.785.395.2SeCys22.62.42.486.711.712.412.278.047.046.145.994.080.082.792.280.081.391.8SeMeCys2.32.72.476.712.114.013.580.747.341.644.594.690.093.383.280.090.089.0SeMet2.62.52.386.713.813.712.892.045.045.843.090.083.391.391.676.785.386.0（四）準(zhǔn)確度表A4-1樣品測(cè)試數(shù)據(jù)（廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院）平行測(cè)定次數(shù)低濃度樣品Se(IV)Se(VI)SeCys2SeMeCysSeMet測(cè)定結(jié)果(mg/kg）10.0540.019未檢出未檢出0.2220.0580.015未檢出未檢出0.2730.0510.017未檢出未檢出0.25平均值(mg/kg）0.0540.017//0.25相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(%）6.511.8//10.2注：為實(shí)驗(yàn)室編號(hào)。Se(IV)—亞硒酸根;Se(VI)—硒酸根;SeCys2—硒代胱氨酸;SeMeCys—硒甲基硒代半胱氨酸;SeMet—硒代蛋氨酸。樣品中5種硒形態(tài)含量均為未檢出。表A4-2樣品測(cè)試數(shù)據(jù)（廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院）平行測(cè)定次數(shù)中濃度樣品Se(IV)Se(VI)SeCys2SeMeCysSeMet測(cè)定結(jié)果(mg/kg）10.0890.018未檢出未檢出0.4620.0980.019未檢出未檢出0.4930.0740.017未檢出未檢出0.48平均值(mg/kg）0.0870.018//0.48相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(%）13.95.6//3.2注：為實(shí)驗(yàn)室編號(hào)。Se(IV)—亞硒酸根;Se(VI)—硒酸根;SeCys2—硒代胱氨酸;SeMeCys—硒甲基硒代半胱氨酸;SeMet—硒代蛋氨酸。樣品中5種硒形態(tài)含量均為未檢出。表A4-3樣品測(cè)試數(shù)據(jù)（廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院）平行測(cè)定次數(shù)高濃度樣品Se(IV)Se(VI)SeCys2SeMeCysSeMet測(cè)定結(jié)果(mg/kg）10.0770.009未檢出未檢出0.7620.0810.008未檢出未檢出0.7930.0790.008未檢出未檢出0.68平均值(mg/kg）0.0790.008//0.74相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(%）2.56.9//7.6注：為實(shí)驗(yàn)室編號(hào)。Se(IV)—亞硒酸根;Se(VI)—硒酸根;SeCys2—硒代胱氨酸;SeMeCys—硒甲基硒代半胱氨酸;SeMet—硒代蛋氨酸。樣品中5種硒形態(tài)含量均為未檢出。表A4-4樣品測(cè)試數(shù)據(jù)（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部亞熱帶果品蔬菜質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心）平行測(cè)定次數(shù)低濃度樣品Se(IV)Se(VI)SeCys2SeMeCysSeMet測(cè)定結(jié)果(mg/kg）10.0530.015未檢出未檢出0.2820.0590.011未檢出未檢出0.2230.0550.012未檢出未檢出0.23平均值(mg/kg）0.0560.013//0.24相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(%）5.516.4//13.2注：為實(shí)驗(yàn)室編號(hào)。Se(IV)—亞硒酸根;Se(VI)—硒酸根;SeCys2—硒代胱氨酸;SeMeCys—硒甲基硒代半胱氨酸;SeMet—硒代蛋氨酸。樣品中5種硒形態(tài)含量均為未檢出。表A4-5樣品測(cè)試數(shù)據(jù)（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部亞熱帶果品蔬菜質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心）平行測(cè)定次數(shù)中濃度樣品Se(IV)Se(VI)SeCys2SeMeCysSeMet測(cè)定結(jié)果(mg/kg）10.0950.025未檢出未檢出0.4720.0900.018未檢出未檢出0.4430.0870.019未檢出未檢出0.38平均值(mg/kg）0.0910.021//0.43相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(%）4.518.3//10.7注：為實(shí)驗(yàn)室編號(hào)。Se(IV)—亞硒酸根;Se(VI)—硒酸根;SeCys2—硒代胱氨酸;SeMeCys—硒甲基硒代半胱氨酸;SeMet—硒代蛋氨酸。樣品中5種硒形態(tài)含量均為未檢出。表A4-6樣品測(cè)試數(shù)據(jù)（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部亞熱帶果品蔬菜質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心）平行測(cè)定次數(shù)高濃度樣品Se(IV)Se(VI)SeCys2SeMeCysSeMet測(cè)定結(jié)果(mg/kg）10.0740.007未檢出未檢出0.7120.0790.008未檢出未檢出0.7730.0760