《大豆品種對大豆花葉病毒病田間抗性鑒定技術(shù)規(guī)程》征求意見稿

1T/BJNZJXXXX—2024大豆品種對大豆花葉病毒病田間抗性鑒定技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了大豆花葉病毒病田間抗性鑒定的鑒定設(shè)計、大豆花葉病毒接種體制備、接種、病情調(diào)查、抗性評價、鑒定記載表格。本文件適用于各類大豆品種、品系、農(nóng)家種及野生豆資源對大豆花葉病毒病田間鑒定圃的設(shè)置、抗性鑒定與評價。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T19557.4植物品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南大豆NY/T3428—2019大豆品種大豆花葉病毒病抗性鑒定技術(shù)規(guī)程3術(shù)語和定義NY/T3428—2019界定的術(shù)語和定義適用于本文件。4鑒定設(shè)計4.1鑒定環(huán)境選擇田間防蟲網(wǎng)室進行人工接種鑒定試驗，網(wǎng)室需具備良好的自然發(fā)病條件和可控的灌溉條件，適宜溫度在（25±3）℃。網(wǎng)室內(nèi)土地平整后覆蓋尼龍地膜，抑制雜草生長。及時防治大豆蚜蟲，以免蚜蟲傳毒導(dǎo)致交叉感染。4.2試驗設(shè)計鑒定材料隨機排列，且每批次鑒定試驗均設(shè)置感病和抗病對照。對照及鑒定材料設(shè)計3次重復(fù)，每份材料每次重復(fù)接種15～20株健康幼苗。4.3試驗對照品種選擇已知且表型穩(wěn)定的感病和抗病材料作為對照品種，感病對照可選擇南農(nóng)1138-2（國內(nèi)大豆）和Williams82（國外大豆），抗病材料可根據(jù)國內(nèi)外大豆鑒別寄主接種試驗選擇，如早熟18、齊黃1號和科豐1號（國內(nèi)大豆）等，或是PI96983、L29和V94-5152（國外大豆）等。4.4株系選擇選擇我國不同大豆生態(tài)區(qū)優(yōu)勢毒株作為病毒鑒定株系，或有明確來源的國內(nèi)病毒株系如SC1-SC22株系。2T/BJNZJXXXX—20244.5鑒定材料播種精選待鑒定的大豆種子和對照材料，剔除表皮斑駁的種子，避免種子帶毒影響鑒定結(jié)果。種子質(zhì)量應(yīng)符合GB/T19557.4的規(guī)定。將種子播種于3加侖塑料花盆中，每份材料播種3盆，每盆20粒。當(dāng)大豆幼苗生長到第一片真葉完全展開后，剔除發(fā)育畸形和發(fā)育階段不一致的幼苗后開始接種試驗。5大豆花葉病毒接種體制備5.1病毒分離田間采集具有典型大豆花葉病毒病癥狀的大豆葉片，通過人工摩擦接種在感病大豆材料上分離純化病毒分離物。采用生物學(xué)鑒定及血清學(xué)鑒定等方法，確定分離株系為大豆花葉病毒（Soybeanmosaicvirus，SMV參見NY/T3428—2019中附錄A的A.1）。5.2病毒株系鑒定將分離純化后的病毒接種于大豆鑒別寄主上進行致病性鑒定，通過不同大豆材料上的抗感表型組合推測分離病毒屬于何種國內(nèi)株系（參見NY/T3428—2019中附錄A的A.2）?；蛲ㄟ^提取感病葉片RNA后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以其為模板擴增病毒衣殼蛋白基因后測序，在數(shù)據(jù)庫中比對確定病毒類型及其與已知SMV病毒株系的親緣關(guān)系。5.3接種體的繁殖和保存5.3.1接種體的繁殖將供試株系人工摩擦接種在感病品種的無毒株上隔離繁殖，顯癥后采集上部具有典型花葉癥狀的新鮮病葉用作接種毒源。5.3.2接種體的保存病毒株系可活體保存在防蟲網(wǎng)室或人工氣候箱內(nèi)種植的大豆幼苗上，也可將病葉保存在-80℃超低溫冰箱中。6接種6.1接種時期接種時期在大豆植株的單葉葉片充分展開時。6.2接種液制備將研缽、研棒和毛刷清洗干凈并用超純水沖洗三遍后晾干，研缽和研棒用無水乙醇灼燒，毛刷用紫外消毒半小時以上，防止侵染大豆時有病毒殘留或交叉感染。在繁毒大豆植株上采集典型花葉病癥狀的新鮮葉片置于研缽中，按1：10的質(zhì)量/體積比（g/mL）加入0.1mol/L磷酸緩沖液（8.64gNa2HPO4·12H2O，1.05gKH2PO4，加去離子水溶解后調(diào)節(jié)pH至7.3～7.4，定容到1000mL），加入少許綠色碳化硅（600目）后充分研磨成綠色汁液備用。6.3接種方法3T/BJNZJXXXX—2024采用人工摩擦接種法。接種時戴上橡膠手套，手指沾取少量綠色碳化硅摩擦大豆葉片產(chǎn)生輕微傷口，再用毛刷沾帶有病毒的汁液均勻涂抹整個葉片上。待葉片稍干后，用去離子水沖洗葉片去除多余的病毒汁液及細微殘渣，晾干幾分鐘后重復(fù)涂抹帶病毒汁液一次，用去離子水沖洗。7病情調(diào)查7.1調(diào)查時間一般在接種20d～30d后調(diào)查。感病對照發(fā)病率95%以上，調(diào)查各鑒定材料的發(fā)病情況。7.2調(diào)查方法根據(jù)病害癥狀描述，記錄病情級別及調(diào)查株數(shù)，計算病情指數(shù)（DiseaseIndex，DI）。7.3病情分級病情分級及其對應(yīng)的癥狀描述見表1。表1大豆抗花葉病毒病鑒定植株病情級別劃分01輕花葉型，植株生長正常，葉片平展不皺，有黃綠3重花葉型，植株生長基本正常，葉片明脈微皺，有5皺花葉型，植株生長接近正常，不矮化，葉片有波狀斑或沿葉緣曲葉或泡狀突起7皺縮型，植株生長不正常，略矮化及黃化，葉片明顯皺9矮化型，植株極端矮化，葉片僵化狹窄、畸形卷曲，嚴重的出現(xiàn)7.4病情指數(shù)計算按公式（1）計算病情指數(shù)：式中：DI——病情指數(shù)；s——各病情級別代表數(shù)值；n——該病情級別相應(yīng)的植株數(shù)，單位為株；N——調(diào)查總株數(shù)，單位為株；S——最高病情級別代表數(shù)值。8抗性評價8.1有效性鑒定當(dāng)設(shè)置的對照品種達到其相應(yīng)感病程度（感病對照DI＞50），該批次視為有效。8.2抗性評價標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)所鑒定品種3次重復(fù)