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文檔簡介
《生物分離提取技術(shù)》習題及答案1.認識生物分離提取技術(shù)生物分離與純化的目的?生物分離與純化的目的是從微生物發(fā)酵液,酶反應(yīng)產(chǎn)物,動植物細胞培養(yǎng)和生物體本身分離并純化對人類有用的,符合質(zhì)量要求的各種生物藥物和生物制品。生物物質(zhì)的來源?(1)動物器官與組織(2)植物器官與組織(3)微生物及其代謝產(chǎn)物(4)細胞培養(yǎng)產(chǎn)物(5)血液、分泌物及其它代謝物3.生化分離技術(shù)的主要種類?種類:細胞破碎、沉淀分離、膜過濾、層析分離、電泳分離、離心分離。4.生物分離技術(shù)的特點是什么?(1)目的產(chǎn)物濃度低,純化難度大(2)活性物質(zhì)性質(zhì)不穩(wěn)定,操作過程容易失活(3)生物材料中生化組分數(shù)量大,分離困難(4)生物材料易變質(zhì),保存困難(5)生物產(chǎn)品的質(zhì)量標準高5.生化分離的主要步驟?(1)選材:來源豐富,含量相對較高,雜質(zhì)盡可能少(2)提?。簩⒛康奈飶牟牧现幸匀芙鉅顟B(tài)釋放出來,方法與存在部位及狀態(tài)有關(guān)。(3)分離純化:核心操作,須據(jù)目的物的理化性質(zhì),生物學性質(zhì)及具體條件定。(4)濃縮、結(jié)晶、干燥。(5)保存:整個過程應(yīng)有快速靈敏準確的分析方法來衡量效果(收率、純度)。5.指出胞內(nèi)產(chǎn)物和胞外產(chǎn)物的分離純化流程不同之處?胞內(nèi)產(chǎn)物需要破壁的過程:需要將目的物從胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到外界溶液中,需要細胞提取物破碎、勻漿、離心,如果是液體的話,獲得提取液,如果是想獲得固體目的物,就對沉淀進行洗滌再獲得提取物。
2.發(fā)酵液的預(yù)處理發(fā)酵液預(yù)處理的目的是什么?(1)改善發(fā)酵液的物理性質(zhì):流變性質(zhì)、顆粒粒度;(2)盡可能使產(chǎn)物轉(zhuǎn)入便于后處理的某一相中(多數(shù)是液相);(3)去除部分雜質(zhì):雜蛋白、多糖、高價無機離子等。2、發(fā)酵液預(yù)處理降低液體黏度常用的方法?(1)加熱(2)凝聚和絮凝(3)變性沉淀(4)調(diào)節(jié)PH3.何謂凝聚?其作用機理是什么(加入電解質(zhì)凝聚劑的目的)?凝聚:凝聚是在高價無機鹽作用下,由于經(jīng)典排斥力的降低,而使膠體體系不穩(wěn)定的現(xiàn)象。作用機理:發(fā)酵液中的細胞,菌體或蛋白質(zhì)等膠體粒子表面都帶有同種電荷,使得這些膠體粒子之間相互排斥,保持一定距離而不互相凝聚。另外,這些膠體粒子和水有高度的親和性,其表面很容易吸住水分,形成一層水膜,從而使膠體粒子呈分散狀態(tài)。在發(fā)酵液中加入電解質(zhì),就能中和膠體粒子的電性,奪取膠體粒子表面的水分子,破壞其表面的水膜,從而使膠體粒子能直接碰撞而聚集起來。4.何謂絮凝?其作用機理是什么?絮凝:是指在某些高分子絮凝劑存在下,基于架橋作用,使膠粒形成粗大的絮凝團的過程,是一種以物理的集合為主的過程。作用機理:絮凝劑一般為高分子聚合物,具有長鏈線狀結(jié)構(gòu),容易溶于水,其相對分子質(zhì)量高達數(shù)萬至1000萬以上,在長的鏈節(jié)上含有相當多的活性功能團。絮凝劑的功能團能強烈地吸附在膠粒的表面,由于一個高分子絮凝劑的長鏈節(jié)上含有相當多的活性功能團,所以一個絮凝劑分子可分別吸附在不同顆粒的表面,從而產(chǎn)生架橋鏈接。5.絮凝的主要影響因素絮凝的影響因素:主要是絮凝劑的相對分子質(zhì)量和種類、絮凝劑用量、溶液的PH、攪拌速度和時間等。6.除去發(fā)酵液中雜蛋白質(zhì)的常用方法有哪些?(1)沉淀法(2)變性法(3)吸附法7.發(fā)酵液中不溶性多糖怎樣去除?當發(fā)酵液中含有較多不溶性多糖時,黏度增大,固液分離困難,可用酶將其轉(zhuǎn)化為單糖。
3.細胞破碎技術(shù)1.細胞破碎就是采用一定的方法,在一定程度上破壞細胞壁和細胞膜,使細胞內(nèi)容物包括目的產(chǎn)物成分釋放出來的技術(shù),是分離純化細胞內(nèi)合成的非分泌型生化物質(zhì)(產(chǎn)品)的基礎(chǔ)。細胞破碎常用的技術(shù)?(1)高壓勻漿法(2)高速珠磨法(3)超聲波法(4)化學法(5)酶解法(6)滲透壓沖擊法(7)凍結(jié)-融化法(8)干燥法常用的溶酶:溶菌酶、透明質(zhì)酸酶、蛋白酶、脂肪酶、核酸酶等。高壓勻漿法的原理?細胞懸浮液在高壓作用下從閥座與閥之間的環(huán)隙高速噴出后撞擊到碰撞環(huán)上,細胞在受到高速撞擊后,幾句釋放到低壓環(huán)境,從而在撞擊力和剪切力等綜合作用下破碎影響因素:壓力、循環(huán)操作次數(shù)和溫度化學滲透法破碎細胞的特點?速度低,效率差,且化學或生化試劑的添加形成新的污染,但化學滲透法選擇性高,胞內(nèi)產(chǎn)物的總釋放率低,可有效抑制核酸的釋放,料液粘度小,有利于后處理。
珠磨法破碎細胞的影響因素有哪些?攪拌速度、料液的循環(huán)速度、細胞懸浮液的濃度、珠粒大小和數(shù)量、溫度等。6.簡要說明常用細胞破碎的主要方法、原理、特點及適用范圍?答:常用的細胞破碎方法有:組織搗碎、珠磨法、高速勻漿法、擠壓法、超聲破碎法、酶溶法、化學滲透法、干燥法等。(1)組織搗碎,其原理是利用機械運動產(chǎn)生剪切力的作用破細胞,利用高速旋轉(zhuǎn)的葉片所產(chǎn)生的剪切力將組織細胞破碎。(10000~20000r/min);適用范圍:動植物組織。(2)珠磨法,工作原理是:進入珠磨機的細胞懸浮液與極細的玻璃小珠、石英砂、氧化鋁等研磨劑(直徑小于1mm)一起快速攪拌或研磨,研磨劑、珠子與細胞之間相互剪切、碰撞,使細胞破碎,釋放出內(nèi)含物;特點:一般可以達到較高的破碎率,但同時為控制溫度,冷耗能耗較高,成本亦隨之增加;適用范圍:微生物(細菌)與植物細胞。(3)高速勻漿法,工作原理:利用高壓使細胞懸浮液通過針性閥,由于突然減壓和高速沖擊撞擊環(huán)使細胞破裂;特點:破碎程度較高,而其機械剪切力對生物大分子的破壞較少,處理量大;適用范圍:較柔軟、易分散的組織細胞。(4)擠壓法,工作原理:微生物細胞在高壓下通過一個狹窄的孔道高速沖出,因突然減壓而引起一種空穴效應(yīng),使細胞破碎;適用范圍:細菌(革蘭氏陰性菌)(5)超聲破碎法,工作原理:聲頻高于15-20kHz的超聲波在高強度聲能輸入下可以進行細胞破碎,破碎機理不詳,可能與空化現(xiàn)象引起的沖擊波和剪切力有關(guān),空化現(xiàn)象是在強聲波作用下,氣泡形成、脹大和破碎的現(xiàn)象;特點:多采用短時多次處理樣品,且由于過程產(chǎn)熱較多,常在冰浴中進行超聲;處理少量樣品,操作簡便,液量損失少;適用范圍:微生物細胞。(6)酶溶法,又分為外加酶和自溶兩種,外加酶原理:用生物酶將細胞壁核細胞膜消化溶解;特點:具有選擇性釋放產(chǎn)物、核酸泄露少、細胞外形完整,但價格較高、通用性差。自溶法。原理:控制一定條件,誘發(fā)微生物細胞產(chǎn)生過剩的溶胞酶或激發(fā)溶胞酶活力,使細胞自溶;特點:對不穩(wěn)定的微生物,易引起所需蛋白質(zhì)的變性。(7)化學滲透法,原理:某些有機溶劑、表面活性劑、抗生素等化學藥品都可以改變細胞壁或膜的通透性,使內(nèi)含物有選擇的滲透出來;特點:對產(chǎn)物釋放有一定的選擇性,細胞外形保持完整,漿液黏度低,但反應(yīng)時間長,效率低,有毒。(8)干燥法,原理:細胞壁膜的結(jié)合水喪失,改變細胞滲透性。又分為熱空氣干燥(適用酵母)、真空干燥(適用細菌)、冷凍干燥(制備不穩(wěn)定的酶)。(9)急熱驟冷法,原理:將材料投入沸水,維持85~90℃數(shù)分鐘,冰浴中急速冷卻,使胞壁結(jié)構(gòu)破壞;適用范圍:細菌及病毒等中對熱不太敏感的物質(zhì)提取。(10)反復(fù)凍融法,原理:將材料深冷(-15℃~-20℃),形成水晶,破壞胞膜疏水鍵,增加親水性,反復(fù)可破細胞;適用:動物材料。7.細胞破碎技術(shù)今后的研究發(fā)展方向?細胞破碎技術(shù)研究發(fā)展方向:(1)多種破碎方法相結(jié)合(2)與上游技術(shù)相結(jié)合(3)與下游技術(shù)相結(jié)合。破碎率測定的方法有哪些?破碎率:被破碎細胞的數(shù)量占原始細胞數(shù)量的百分比。破碎率測定方法:(1)直接測定法(2)目的產(chǎn)物測定法(3)導電率測定法。
4.過濾技術(shù)1.過濾及其原理?概念:在推動力或者其他外力作用下懸浮液(或含固體顆粒發(fā)熱氣體)中的液體(或氣體)透過介質(zhì),固體顆粒及其物質(zhì)被過濾介質(zhì)截留,從而使固體及其他物質(zhì)與液體(或氣體)分離的操作。原理:利用物質(zhì)的溶解性差異,將液體和不溶于液體的固體分離開來的一種方法。過濾的推動力是什么?驅(qū)使液體通過過濾介質(zhì)的推動力可以是重力、壓力或離心力。3.過濾的類型?按料液的流動方向常不同分為:常規(guī)過濾和錯流過濾;按操作壓力的不同分為:常壓過濾、減壓過濾和加壓過濾;按過濾方式的不同可分為:表面過濾和深層過濾。4.常用的過濾介質(zhì)有哪些?(1)濾紙(2)脫脂棉(3)織物介質(zhì)(4)燒結(jié)金屬過濾介質(zhì)(5)多孔塑料過濾介質(zhì)(6)垂熔玻璃過濾介質(zhì)(7)多孔陶瓷(8)微孔濾膜。5.常用的過濾裝置有哪些?(1)普通漏斗:常用玻璃漏斗和布氏漏斗,常用濾紙、長纖維和脫脂棉以及絹布等作過濾介質(zhì)。(2)垂熔玻璃濾器(3)砂濾棒(4)板框式壓濾機(5)微孔濾膜過濾器(6)其他過濾裝置:超濾裝置、鈦濾器等。6.助濾劑的原理?助濾劑原理:通過加入助濾劑改變進入濾池之前的顆粒或濾料表面性質(zhì)、電性與尺寸。改變?yōu)V料表面性質(zhì)可提高顆粒向濾料遷移速度與黏附效率;改變進入濾池懸浮顆粒的表面性質(zhì)與尺寸可提高顆粒黏附效率。按照該機理形成的聚合物–顆粒絮體,使顆粒和黏附作用都得到加強。助濾劑的主要種類?助濾劑的主要種類有:⑴聚合無機高分子(如聚合氯化鋁、聚合硫酸鋁)⑵合成有機高分子(如聚丙烯酰胺、HAC陽離子絮凝劑)⑶天然有機高分子(如骨膠、海藻酸鈉)⑷氧化劑(如氯、臭氧、二氧化氯等)。助濾劑使用方法?助濾劑使用方法:(1)在過濾之前先在過濾介質(zhì)表面預(yù)涂一層助濾劑;(2)助濾劑按一定比例均勻加入待過濾的料液中。9.濾餅及濾餅的作用?濾餅:濾漿中被過濾介質(zhì)截留的固體顆粒稱為濾餅或濾渣。濾餅的作用:過濾介質(zhì)一般有一定孔徑的紗布或不銹鋼網(wǎng)。過濾介質(zhì)一般是形成濾餅用的。真正起到過濾作用的是濾餅。濾餅的孔隙較過濾介質(zhì)小,截留能力大,所以,在實驗時一般將頭一定體積的濾液重新過濾。過濾介質(zhì)、濾餅都有一定的過濾阻力。過濾介質(zhì)阻力是不變的。而隨著過濾的進行,濾餅不斷變厚。阻力不斷增加。過濾速度不斷減小。
5.離心技術(shù)1.低速、中速、高速離心機是如何劃分的?主要應(yīng)用范圍?一般如何表示轉(zhuǎn)速?低速離心機:轉(zhuǎn)速8000r/min以下(最大相對離心力10000g以下),用于分離細胞、細胞碎片及培養(yǎng)基殘渣等。高速離心機:轉(zhuǎn)速10000~25000r/min(10000~100000g),用于分離各種沉淀物、細胞碎片和較大細胞器等。超速離心機:25000~150000r/min(100000~1000000g),其中制備型超速離心機用于生物大分子、細胞器和病毒等的分離純化;分析型用于樣品純度檢測、沉降系數(shù)和分子質(zhì)量的測定。一般低速離心通常以轉(zhuǎn)子每分鐘的轉(zhuǎn)速表示(r/min);而較高速度離心時,往往用相對離心力來表示(g)。2.超速離心機由哪幾部分構(gòu)成?其制備型和分析型在配置和應(yīng)用上有何差異?由驅(qū)動系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、恒溫系統(tǒng)、控制系統(tǒng)、潤滑系統(tǒng)等組成。配置:制備型上常用角式轉(zhuǎn)子、甩出吊桶式轉(zhuǎn)子、垂直轉(zhuǎn)子、區(qū)帶轉(zhuǎn)子,有些還配備可以大容量離心的連續(xù)流轉(zhuǎn)子,分析型則使用專門的分析轉(zhuǎn)子。較為先進的制備型離心機還可選配附屬設(shè)備,如分析光學附件、密度梯度形成-收集器、切管器等。分析型離心機可認為是一臺制備型超速離心機和一套在樣品沉降過程中能直接測定離心池中樣品濃度的光學系統(tǒng)的結(jié)合體。離心機中裝有柱面透鏡、紫外可見光或干涉光等光學檢測系統(tǒng)進行沉降系數(shù)、分子質(zhì)量、擴散系數(shù)等測定和諸如顆粒形狀和結(jié)構(gòu)的分析,數(shù)據(jù)的處理由計算機完成。應(yīng)用:制備型超速離心機用于生物大分子、細胞器和病毒等的分離純化。分析型用于樣品純度檢測、沉降系數(shù)和分子質(zhì)量的測定,主要為了研究生物大分子物質(zhì)的沉降特性和結(jié)構(gòu),使用特殊設(shè)計的分析轉(zhuǎn)子和檢測系統(tǒng),連續(xù)的監(jiān)測物質(zhì)在離心力場中的沉降過程。3.轉(zhuǎn)子有哪些種類?各有何特點和各自的使用分離范圍是什么?轉(zhuǎn)子種類:角式轉(zhuǎn)子、甩出吊桶式轉(zhuǎn)子(水平轉(zhuǎn)子)、垂直轉(zhuǎn)子、區(qū)帶轉(zhuǎn)子、連續(xù)流轉(zhuǎn)子,分析轉(zhuǎn)子。角式轉(zhuǎn)子:基本轉(zhuǎn)子,轉(zhuǎn)速最高,管孔中心線和旋轉(zhuǎn)軸夾角通常為15~45°,強度高、重心低、運轉(zhuǎn)平穩(wěn)、使用方便、壽命長。對于分離沉降特性差異較大的顆粒效果較好,常用于差速離心。甩出吊桶式轉(zhuǎn)子(水平轉(zhuǎn)子):在轉(zhuǎn)子體上懸吊著3~6個自由活動的吊桶,裝樣品的離心管安放于吊桶內(nèi),加速過程中離心管中心線逐漸與旋轉(zhuǎn)中心線垂直,即被甩到水平位置;離心時間較長。主要用于密度梯度區(qū)帶離心垂直轉(zhuǎn)子:離心管垂直放置;樣品沉降行程特別短,由碰撞和溫差引起的對流不顯著。同樣離心速度下,離心所需時間比角式轉(zhuǎn)子和水平轉(zhuǎn)子短;加工用料多、價格貴、密封要求高。可用于差速離心和區(qū)帶離心區(qū)帶轉(zhuǎn)子:高速區(qū)帶轉(zhuǎn)子一般用鋁合金制造,超速區(qū)帶轉(zhuǎn)子一般用鈦合金制造。樣品槽用十字形隔板隔趁4個扇形室,隔板中心加工有導管,離心室上部安裝有防護支撐板。轉(zhuǎn)子耐腐蝕要求高。用于差速離心連續(xù)流轉(zhuǎn)子:形狀類似于區(qū)帶轉(zhuǎn)子,中心部分差別較大。用于超速離心機上的連續(xù)流轉(zhuǎn)子適用于從大量的組織勻漿中分離亞細胞組織、培養(yǎng)液中收集細胞、純化病毒等,最大額定轉(zhuǎn)速32000~35000rpm;用于高速離心機上的連續(xù)流轉(zhuǎn)子最適合培養(yǎng)液濃縮,用以收集菌體或其他沉降物,最大額定轉(zhuǎn)速20000rpm以下。分析轉(zhuǎn)子:有數(shù)個裝離心池的小室,配以多種離心池,離心池可以上下透光。轉(zhuǎn)速18000~72000rpm4.離心管在離心時除要考慮以旋轉(zhuǎn)心中對稱放置、質(zhì)量相等外,還應(yīng)考慮什么?為什么?還應(yīng)考慮容量、強度、轉(zhuǎn)速、耐熱耐腐蝕性、離心介質(zhì)。由于離心管材質(zhì)不同,能承受的應(yīng)力就有很大不同,使用時不能超過離心管所能承受的最大轉(zhuǎn)速,否則離心管要變形開裂。常用的離心分離設(shè)備有哪些?碟片式離心機(2)管式離心機(3)傾析式離心機何謂差速離心法?簡述分離原理和應(yīng)用范圍?答:差速離心法:采用不同的離心速度和離心時間,使沉降速度不同的顆粒分批分離的方法。此法適用于沉降系數(shù)差別較大的組分之間的分離,主要用來分離培養(yǎng)液、細胞器和病毒等。7.何謂密度梯度區(qū)帶離心法?密度梯度區(qū)帶離心法分為哪兩種類型?簡述他們的分離原理和應(yīng)用范圍?密度梯度區(qū)帶離心法:樣品在密度梯度分布的惰性介質(zhì)中以一定的離心力進行離心沉降或離心平衡,把顆粒分配到梯度中某些特定位置上,形成不同區(qū)帶的分離方法。此方法用于分離沉降系數(shù)或密度差異較小的組分,并可獲得較高的純度。密度梯度區(qū)帶離心法分為:(1)差速-區(qū)帶離心法,它是一種沉降速率法,當不同的顆粒間存在沉降速度差時,在一定的離心力作用下,顆粒各自以一定速率沉降,在密度梯度不同的區(qū)域上形成區(qū)帶的方法。該方法適用于分離有一定沉降系數(shù)差的顆粒。大小相同、密度不同顆粒不能用該方法分離。(2)等密度離心法,是一種沉降平衡法。當不同顆粒存在浮力密度差時,在離心場下,顆?;蛳蛳鲁两?,或向上浮起,一直沿梯度移動到他們密度恰好相等的位置上(即等密度點,σ=ρ)形成區(qū)帶。它的有效分離取決于顆粒的浮力密度差,時間和區(qū)帶的密度。此方法常用來分離大小相似而密度有差異的顆粒。由于大多數(shù)蛋白質(zhì)有相似的密度,所以通常不用這種方法分離蛋白質(zhì),但利用含有大量磷酸鹽或脂質(zhì)的蛋白質(zhì)與一般蛋白質(zhì)在密度上有明顯區(qū)別,可以用等密度離心法將它們分離。
6.吸附分離技術(shù)1.什么是吸附分離技術(shù)?是指在一定條件下,將待分離的料液(或氣體)通入適當?shù)奈絼┲?,利用吸附劑對料液(或氣體)中某一組分具有選擇吸附的能力,使該組分富集在吸附劑表面,然后再用適當?shù)南疵摍C將吸附的組分從吸附劑上解吸下來的一種分離技術(shù)。吸附分離技術(shù)的特點?(1)操作簡單,設(shè)備廉價、安全(2)選擇性低,收率低(3)由于處理的料液濃度低,故處理能力低.(4)pH值變化穩(wěn)定,故不易引起生物活性物質(zhì)的變性。3.吸附劑的類型有哪些?類型:(1)物理吸附(范德華力)(2)化學吸附(電子轉(zhuǎn)移)(3)交換吸附(離子交換)4.常用的吸附劑有哪幾類?(1)有機吸附劑:如活性炭、纖維素、大孔吸附樹脂、聚酰胺等;(2)無機吸附劑:如氧化鋁、硅膠、人造沸石、磷酸鈣、氫氧化鋁等。5.活性炭的吸附規(guī)律?對具有極性基團的化合物吸附力較大;對芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物;對相對分子質(zhì)量大的化合物的吸附力大于相對分子質(zhì)量小的化合物。6.影響吸附的因素有哪些?影響因素:(1)吸附劑的性質(zhì);(2)吸附物的性質(zhì);(3)吸附條件(溫度、PH、鹽的濃度)(4)溶劑的影響。
7.萃取技術(shù)1.萃?。豪萌苜|(zhì)在互不相溶的兩相之間分配系數(shù)的不同而使溶質(zhì)得到純化或濃縮的技術(shù)。2.萃取劑選擇的原則?(1)萃取劑分子至少有一個萃取功能基(2)萃取劑分子中必須有相當長的鏈烴或芳烴(3)選擇性好、萃取容量大、化學和輻射穩(wěn)定性強、容易與原料液分層、操作安全等。3.影響萃取的主要因素有哪些?影響因素:(1)PH(2)溫度(3)無機鹽(4)有機溶劑的選擇4.萃取的分類?(1)根據(jù)參與溶質(zhì)分配的兩相不同分類:液-液萃取和液-固萃取;(2)根據(jù)組分數(shù)目不同分類:分為三元體系和多組元體系;(3)根據(jù)有無化學反應(yīng)分類:分為物理萃取和化學萃??;(4)根據(jù)萃取劑的種類和形式不同分類:溶劑萃取,雙水相萃取,反膠團萃取,凝膠萃取,超臨界萃取等。5.溶劑萃取的流程有哪些?(1)混合(2)分離(3)回收6.什么是乳化現(xiàn)象,其產(chǎn)生原因是什么;如何消除乳化現(xiàn)象?(1)由于表面活性劑的作用,使本來不能互相溶解的兩種液體能夠混到一起的現(xiàn)象稱為乳化現(xiàn)象。(2)在進行萃取,洗滌操作過程中,混合液在分液漏斗中發(fā)生乳化,可能是由于所萃取物的酸堿度過強,或者所用溶劑密度過于接近,或者所萃取溶液有較大的粘度造成的。(3)對于不同原因造成的乳化,我們可以用不同方法予以消除:①較長時間靜置。②輕輕地旋搖漏斗,加速分層。③若因兩種溶劑(水與有機溶劑)部分互溶而發(fā)生乳化,可以加入少量電解質(zhì)(如氯化鈉),利用鹽析作用加以破壞;若因兩相密度差小發(fā)生乳化,也可以加入電解質(zhì),以增大水相的密度。④若因溶液呈堿性而產(chǎn)生乳化,??杉尤肷倭康南←}酸或采用過濾等方法消除。根據(jù)不同情況,還可以加入乙醇、磺化蓖麻油等消除乳化。7.萃取分液的操作步驟?(1)查漏;(2)加藥品;(3)倒振;(4)靜置;(5)放液。8.何謂超臨界流體萃?。科涮攸c有哪些?(1)超臨界流體萃取:利用超臨界流體作為萃取劑的萃取操作。(2)與其它常規(guī)分離方法相比,超臨界流體萃取具有以下特點:①通過調(diào)節(jié)溫度和壓力可全部或選擇性地提取有效成分或脫除有害物質(zhì)②選擇適宜的溶劑如CO2可在較低溫度和無氧環(huán)境下操作,分離、精制熱敏性物質(zhì)和易氧化物質(zhì);③臨界流體具有良好的滲透性和溶解性,能從固體或粘稠的原料中快速提取有效成分;④降低超臨界相的密度,很容易使溶劑從產(chǎn)品中分離,無溶劑污染,且回收溶劑無相變過程,能耗低;⑤兼有蒸餾和萃取雙重功能,可用于有機物的分離、精制。何謂雙水相萃取?常見的雙水相構(gòu)成體系有哪些?其成相機理如何?(1)雙水相萃取:利用物質(zhì)在不相溶的兩水相間分配系數(shù)的差異進行萃取的方法。(2)常見的雙水相體系:①高聚物/高聚物體系:聚乙二醇(PEG)/葡聚糖(Dextran)②高聚物/低分子物質(zhì)體系:PEG/硫酸鹽PEG/磷酸鹽(3)根據(jù)熱力學第二定律,混合是熵增過程可以自發(fā)進行,但分子間存在相互作用力,這種分子間作用力隨相對分子質(zhì)量增大而增大。當兩種高分子聚合物之間存在相互排斥作用時,由于相對分子質(zhì)量較大的分子間的排斥作用與混合熵相比占主導地位,即一種聚合物分子的周圍將聚集同種分子而排斥異種分子,當達到平衡時,即形成分別富含不同聚合物的兩相。為什么說雙水相萃取適用于生物活性大分子物質(zhì)分離?雙水相系統(tǒng)中兩相密度和折射率差別較小,相界面張力小,兩相易分散,活性生物物質(zhì)或細胞不易失活。
8.中草藥提取分離技術(shù)什么是提取?提取是指根據(jù)天然藥物中各種化學成分的溶解性能,選擇對有效成分溶解度大而對其他成分溶解度小的溶劑,用適當?shù)姆椒▽⑺枰幕瘜W成分盡可能完全地從藥材組織中溶解提出的過程。2.什么是溶劑提取法?利用天然藥物化學成分在特定溶劑中溶解的性質(zhì),將其從藥材中提取出來。3.溶劑提取法中選擇溶劑的依據(jù)是什么?依據(jù)“相似者相溶”原理。4.溶劑提取法中選擇溶劑的原則?原則:(1)對有效成分溶解度大,對雜質(zhì)溶解度?。唬?)惰性,不與目標成分反應(yīng),即使反應(yīng)也屬于可逆性的;(3)經(jīng)濟安全、后續(xù)操作容易進行,如:過濾、濃縮等。5.常見的溶劑提取法有哪些?說明各自的適用范圍?(1)浸漬法(浸泡法)適用范圍:遇熱易破壞及含多糖物質(zhì)較多的藥材。(2)滲漉法適用范圍:遇熱易破壞成分的提取。(3)回流提取法適用范圍:脂溶性、對熱穩(wěn)定的成分。(4)連續(xù)回流提取法(索氏提取)適用范圍:遇熱穩(wěn)定,脂溶性成分,藥量少時。(5)超聲法適用范圍:適用于任何提取溶劑。天然藥物常用的提取方法有哪些?說明各自的適用范圍?(1)溶劑提取法適用范圍:多數(shù)情況下采用溶劑法。(2)升華法適用范圍:具有升華性質(zhì),而且化學結(jié)構(gòu)遇熱穩(wěn)定、不易被破壞的化合物。(3)水蒸氣蒸餾法適用范圍:能隨水蒸氣蒸發(fā)而且化學結(jié)構(gòu)遇熱穩(wěn)定、不易被破壞的揮發(fā)油、小分子生物堿(麻黃堿、煙堿、檳榔堿等)或酚類(牡丹酚等)化合物。7.抽提的含義是什么?影響抽提有效成分的主要因素有哪些?(1)抽提是從一種固體或一種液體混合物中將所要的物質(zhì)根據(jù)其特性用溶劑提取分離出來的方法。(2)影響因素:①離子強度:影響物質(zhì)溶解度的主要因素。適當?shù)牡碗x子強度溶液(0.05~0.2mol/l)除增加溶解度,還對活性有穩(wěn)定作用。②pH影響目的物的溶解度及穩(wěn)定性。一般控制在pI附近的穩(wěn)定性范圍內(nèi)。③添加劑:抑制劑(主要水解酶抑制劑)如提取核酸時,添加核酸酶抑制劑防目的物被分解。保護劑(穩(wěn)定性)如對含巰基的酶添加谷胱甘肽等巰基保護劑。8.在生物活性物質(zhì)的提取中,怎樣選擇合適的提取劑?造成提取液混濁的主要原因是什么?如何解決?(1)在生物活性物質(zhì)的提取中,選擇提取劑的要求:目的物溶其中,保活性,減雜質(zhì)量??紤]因素如下:①離子強度影響物質(zhì)溶解度的主要因素。適當?shù)牡碗x子強度溶液(0.05~0.2mol/l)除增加溶解度,還對活性有穩(wěn)定作用。②
pH影響目的物的溶解度及穩(wěn)定性。一般控制在pI附近的穩(wěn)定性范圍內(nèi)。③添加劑抑制劑(主要水解酶抑制劑),如提取核酸時,添加核酸酶抑制劑防目的物被分解。保護劑(穩(wěn)定性),如對含巰基的酶添加谷胱甘肽等巰基保護劑另外提取劑的用量,對于目標:收率(80%以上)且目的物濃度大時:動物、微生物—加1.5~3體積的提取劑;植物—加入0.5~1體積的提取劑。(2)造成提取液混濁的主要原因是蛋白質(zhì)和核酸等雜質(zhì)未除凈;使提取液澄清的方法有:㈠.粒子聚結(jié)(增大顆粒粒徑)
⑴.
25%(NH4)SO4處理(適用于動物細胞)⑵.
酸化法㈡.降低提取液粘度NA(DNA、RNA),類樹膠等易造成粘度大。(適用于微生物細胞)㈢.其他方法
⑴80%硫胺或55%丙酮,使蛋白質(zhì)沉淀類樹膠不沉淀;⑵吸附法;⑶改善破碎方法。
9.鹽析技術(shù)固相析出分離技術(shù)主要有哪些?固相析出分離技術(shù)主要有鹽析法、有機溶劑沉淀法、等電點沉淀法和結(jié)晶法。2.等電點沉淀法的基本原理?等電點概念:蛋白質(zhì)或兩性電解質(zhì)(如氨基酸)所帶凈電荷為零時溶液的pH,此時蛋白質(zhì)或兩性電解質(zhì)在電場中的遷移率為零?;驹恚簝尚陨镔|(zhì)在溶液PH處于等電點時,分子表面電荷為零,分子間靜電排斥作用減弱,因此吸引力增大,能相互聚集起來,發(fā)生沉淀。3.什么是鹽溶?什么是鹽析?低濃度中性鹽離子對蛋白質(zhì)分子表面極性基團及水活度的影響,增加蛋白質(zhì)與溶劑相互作用力,使其溶解度增大,這一現(xiàn)象稱為鹽溶。在高濃度中性鹽存在的情況下,蛋白質(zhì)(或酶)等生物大分子在水溶液中的溶解度降低并沉淀出的現(xiàn)象稱為鹽析。4.簡述鹽析分離的原理?(1)破壞雙電層:在高鹽溶液中,帶大量電荷的鹽離子能中和蛋白質(zhì)表面的電荷,使蛋白質(zhì)分子之間電排斥作用相互減弱而能相互聚集起來。(2)破壞水化層:中性鹽的親水性比蛋白質(zhì)大,鹽離子在水中發(fā)生水化而使蛋白質(zhì)脫去了水化膜,暴露出疏水區(qū)域,由于疏水區(qū)域的相互作用,使其沉淀。5.影響鹽析的因素有哪些?影響因素:(1)鹽飽和度;(2)蛋白質(zhì)濃度;(3)PH值;(4)溫度6.可采用什么措施提高鹽析效率?對于某種蛋白質(zhì)的鹽析提取過程,要提高鹽析效率,主要從鹽的種類、pH、溫度等方面考慮。其中,對于鹽的選擇,可使用的中性鹽有:(NH4)2SO4Na2SO4MgSO4NaClNaAcNa3PO4檸檬酸鈉硫氰化鉀等,以(NH4)2SO4Na2SO4最廣泛,前者最受歡迎。pH影響了蛋白質(zhì)的溶解度,故在其他條件一定時,通過改變pH也可實現(xiàn)蛋白質(zhì)的分離。在高離子強度的溶液中,升高溫度可使β值下降,,若在保證蛋白質(zhì)不失活的情況下,可使蛋白質(zhì)溶解度下降,加快鹽析過程。此外,蛋白液的濃度對沉淀有雙重影響,蛋白濃度越高,鹽的飽和度極限越低,但雜蛋白的共沉淀現(xiàn)象也隨之加重,故一般控制蛋白濃度在2.5-3%。7.鹽析法中鹽加入的方式有哪些?鹽加入方式:(1)加入飽和溶液法(2)直接加入固體鹽法8.鹽析用鹽的選擇原則?選擇原則:(1)鹽析作用要強(2)鹽析用鹽需有較大的溶解度(3)鹽析用鹽必須是惰性的(4)來源豐富、經(jīng)濟9.鹽析中常用的鹽有哪些?常用的鹽有硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鎂、磷酸鉀、磷酸鈉、氯化鈉、檸檬酸鈉、硫氰化鉀等,以硫酸銨、硫酸鈉最廣泛,前者最受歡迎。10.硫酸銨是最常用的蛋白質(zhì)鹽析沉淀劑,說明其優(yōu)缺點?優(yōu)點:(1)價廉;(2)溶解度大,溫度系數(shù)小,許多蛋白質(zhì)可以鹽析出來;(3)硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好(4)不易引起蛋白質(zhì)變性。缺點:(1)水解變酸;(2)高pH釋氨,腐蝕;(3)殘留產(chǎn)品有影響
10.有機溶劑沉淀技術(shù)1.什么是有機溶劑沉淀法?有機溶劑沉淀法常用的有機溶劑有哪些?向蛋白質(zhì)等生物大分子的水溶液中加入一定量親水性的有機溶劑,能顯著降低蛋白質(zhì)等生物大分子的溶解度,使其沉淀析出。常用有機溶劑:乙醇、丙酮、甲醇等。2.有機溶劑沉淀法的原理?(1)降低了介質(zhì)的介電常數(shù),使溶質(zhì)分子之間的靜電引力增加,聚集形成沉淀。(2)水溶性有機溶劑本身的水合作用降低了自由水的濃度,壓縮了親水溶質(zhì)分子表面原有水化層的厚度,降低了它的親水性,導致脫水凝集。3.有機溶劑沉淀法的優(yōu)缺點?優(yōu)點:1)分辨能力比鹽析法高,即蛋白質(zhì)等只在一個比較窄的有機溶劑濃度下沉淀;2)溶劑易除去3)沉淀不用脫鹽,過濾較為容易;缺點:1)對具有生物活性的大分子容易引起變性失活,2)操作要求在低溫下進行。3)成本高,需防火防爆總體來說,蛋白質(zhì)和酶的有機溶劑沉淀法不如鹽析法普遍。4.影響有機溶劑沉淀法的因素有哪些?(1)有機溶劑種類及用量能與水無限混溶;介電常數(shù)小、沉淀強;變性??;毒性小,揮發(fā)性適中(2)pH的影響控制溶液pH時務(wù)必使溶液中大多數(shù)蛋白質(zhì)分子帶有相同電荷,勿使目的物與雜質(zhì)帶異電荷導致共沉淀。(3)溫度嚴格控制低溫,有機溶劑與水混合時產(chǎn)生放熱反應(yīng);溫度影響有機溶劑對蛋白質(zhì)的沉淀能力,一般溫度越低,沉淀越完全。無機鹽的含量少量的中性鹽:保護作用,減少蛋白質(zhì)變性,穩(wěn)定介質(zhì)pH,減少水和溶劑互溶現(xiàn)象;鹽濃度較高(>0.2mol/L):鹽溶,增大蛋白質(zhì)在有機溶劑―水溶液中的溶解度,會增加溶媒用量,沉淀物中可能夾帶鹽,需除鹽。某些金屬離子的助沉淀作用Zn、Cu等與呈陰離子狀態(tài)的蛋白質(zhì)形成復(fù)合物,而活性不變,有助于沉淀,降低有機溶劑用量。(6)樣品濃度較?。喝軇┝吭龃?,收率降低較高:共沉淀增強,分辨率下降,回收率上升蛋白質(zhì)初濃度:0.5%~2%粘多糖:1~2%
11.色譜技術(shù)什么是色譜分離技術(shù)?利用不同組分在固定相和流動相中的物理化學性質(zhì)(如吸附力、分子極性及其大小、分子親和力、分配系數(shù)等)的差別,使各組分在兩相中以不同的速率移動而進一步分離的技術(shù),稱為色譜分離技術(shù)。2.何謂固定相?何謂流動相?固定相:是色譜的一個基質(zhì)。它可以是固體物質(zhì)(如吸附劑、凝膠、離子交換劑等),也可以是液體物質(zhì)(如固定在硅膠或纖維素上的溶液),這些基質(zhì)能與待分離的化合物進行可逆的吸附、溶解、交換等作用。他對色譜的效果起關(guān)鍵作用。流動相:流動相是不斷運動的氣體或液體,又稱展層劑、洗脫劑。它攜帶各組分朝著一個方向移動,也是色譜分離中的重要影響因素之一。3.色譜分離技術(shù)的類型主要有哪些?(1)據(jù)固定相基質(zhì)的形式分類可分為紙層析、薄層層析和柱層析。(2)據(jù)流動相的形式分類可分為液相層析和氣相層析。(3)據(jù)分離的原理不同分類可分為吸附層析、凝膠過濾層析、離子交換層析、疏水層析、反相層析、親和層析等。吸附色譜的色譜過程?(1)吸附(2)解吸(3)再吸附(4)再解吸5.色譜法的特點?(1)分離效率高:可在很短的時間內(nèi)分離多達二、三百個組分的復(fù)雜物質(zhì)。(2)檢測能力強:可以檢測出10-11~10-15克級的痕量組分,能滿足環(huán)境檢測、農(nóng)藥殘留等大量日常檢測分析的需要。(3)樣品用量少:樣品用量一般為微升級,少的可達納克級。(4)適用范圍廣:幾乎所有與化學有關(guān)的領(lǐng)域都有其用武之地。6.什么是氣相色譜?氣相色譜法主要利用物質(zhì)的沸點、極性及吸附性質(zhì)的差異,以氣體為流動相,以液體或固體為固定相從而達到分離混合物的色譜方法。氣相色譜法的特點?(1)優(yōu)點:分離效率高、應(yīng)用范圍寬、分析速度快、樣品用量少;靈敏度高、分離和測定一次完成、自動化程度高.(2)缺點:不適用于高沸點(>450℃)、有生物活性的物質(zhì)的分離測定,不適用于制備。8.液相色譜的主要特點?(1)分離效率高;(2)選擇性好,適用于多種多元組分復(fù)雜混合物的分離;(3)應(yīng)用范圍廣,從無機物到有機物,從天然物質(zhì)到合成產(chǎn)物,從小分子到大分子,從一般化合物到生物活性物質(zhì)等。9.高效液相色譜(HPLC)由哪些部分組成?HPLC系統(tǒng)一般由高效液相色譜儀主要由進樣系統(tǒng)、輸液系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)等組成。其中高壓輸液泵、色譜柱、檢測器是關(guān)鍵部件。有的儀器還有梯度洗脫裝置、在線脫氣機、自動進樣器、預(yù)柱或保護柱、柱溫控制器等,現(xiàn)代HPLC儀還有微機控制系統(tǒng),進行自動化儀器控制和數(shù)據(jù)處理。制備型HPLC儀還備有自動餾分收集裝置。10.什么是離子交換色譜法?離子交換色譜法是利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)的結(jié)合來測定溶液中陽離子和陰離子的一種分離分析方法。
12.膜分離技術(shù)膜分離技術(shù)的概念?膜分離技術(shù)指物質(zhì)在推動力作用下由于傳遞速度不同而得到分離的過程。2.膜分離技術(shù)的特點?特點:易于操作;成本低、壽命長;高效;常溫下操作無相態(tài)的變化,分離精度高,沒有二次污染;膜材質(zhì)的價格高;操作過程中膜面容易被污染;膜的耐藥性,耐溶性,耐熱性能有限。3.膜分離技術(shù)的類型?類型:滲析;電滲析;微濾;超濾;反滲透;納濾;氣體分離4.以靜壓力差為推動力的膜過濾技術(shù)主要有哪些?他們有何特點?答:以靜壓力差為推動力的膜分離有四種:微濾、超濾、納濾和反滲透。特點:微濾膜特點:⑴屬于絕對過濾介質(zhì);⑵孔徑均勻,過濾精度高,通量大;⑶厚度薄,吸附量小;⑷無介質(zhì)脫落,不產(chǎn)生二次污染;⑸顆粒容量小,易堵塞。超濾特點:超濾屬于壓力驅(qū)動型膜分離過程,超濾膜的分離范圍為相對分子質(zhì)量500-100萬的大分子物質(zhì)和膠體特質(zhì),相對應(yīng)粒子的直徑為0.005-0.1μm;分離機理一般認為是機械篩分超濾膜組件有板式、卷式、管式、毛細管式及中空纖維等幾種形式過濾的方式一般為錯流過濾。納濾膜的特點:具有納米級孔徑;操作壓力低(一般低于10MPa);可取代傳統(tǒng)處理的多個步驟;耐壓密性和抗污染能力強;此外帶電納濾膜還能根據(jù)離子的大小及電價的高低對低價離子和高價離子進行分離。反滲透膜的特點:(1)所成的膜要有高脫鹽率和高通量;(2)要有足夠的機械強度;(3)應(yīng)有良好的化學穩(wěn)定性,耐水解、耐清洗劑侵蝕、耐強氧化劑殺菌消毒等;(4)耐熱性,以便能在較高溫度下工作;(5)耐生物降解(6)耐污染性,可較長期保持膜的性能,少清洗。5.何謂膜的污染,發(fā)生污染的主要原因是什么?怎樣防止和解決污染?(1)膜污染:隨操作時間的增加,若膜透過流速迅速下降,溶質(zhì)的截留率也明顯下降(2)原因:1)膜自身的劣化包括化學性(水解氧化)、物理性(擠壓)、生物性(微生物)三種和水生物(附生)污垢。2)水生污垢:由于形成吸著層和堵塞等外因而引起膜性能變化。(3)防止污染方法:供給液調(diào)整+預(yù)處理;抗污染膜的開發(fā)。6.膜選擇和使用時考慮的主要參數(shù)是什么?影響流率的主要因素是什么?(1)考慮的主要參數(shù):1)截留分子量:指截流率達90%以上的最小被截留物質(zhì)的分子量。(以球形分子測)2)流動速率:指在一定壓力下每分鐘通過單位面積膜的液體量。(ml/cm2.min)3)其它考慮因素還有操作溫度、化學耐受性、膜的吸附性能、膜的無菌處理等。(2)影響流率的主要因素:1)溶質(zhì)的分子性質(zhì):比重大的纖維分子擴散性差,比重較小的球形分子易擴散
2)溶質(zhì)濃度:一定壓力下,稀溶液比濃溶液流率高;3)壓力:不同溶質(zhì)應(yīng)選擇不同的操作壓力;4)攪拌:加快溶質(zhì)分子的擴散,減少濃度極化,從而提高流率;*對切力敏感的大分子(酶、核酸)須控制攪拌速度;5)溫度:升溫能提高流率(不同溶質(zhì)區(qū)別對待);6)其它:對流率有影響的還有如溶液pH、離子強度及溶劑性質(zhì)等因素。7.微孔濾過膜截留粒子的范圍?微孔濾過膜截留粒子的范圍:0.1—10μm的粒子。8.簡述微濾膜的主要種類,特點和主要分離機理。(1)種類:據(jù)材質(zhì)分成:1)有機微濾膜具韌性,適應(yīng)性強,制備簡單,易成形,工藝較成熟。常用聚乙烯、聚偏氟乙烯和聚四氟乙烯等聚烯烴類聚合物組成。2)無機微濾膜無機陶瓷膜具備化學穩(wěn)定性好、機械強度大、抗污染能力強、耐高溫、孔徑分布窄、可高壓反沖洗、再生能力強、分離效率高、不易老化等優(yōu)點。3)復(fù)合微濾膜復(fù)合微濾膜充分利用了有機與無機微濾膜的各自優(yōu)點.復(fù)合微濾膜的制備包括三種形式1)將一層微濾膜的薄膜和常規(guī)過濾介質(zhì)利用層壓技術(shù)復(fù)合在一起;2)通過不同的工藝手段實現(xiàn)有機與無機的黏合改性;3)將微濾膜技術(shù)與生物處理法相結(jié)合的新型復(fù)合式膜生物反應(yīng)器。(2)特點:1)屬于絕對過濾介質(zhì);2)孔徑均勻,過濾精度高,通量大;3)厚度薄,吸附量小;4)無介質(zhì)脫落,不產(chǎn)生二次污染;5)顆粒容量小,易堵塞.(3)分離機理:膜的過濾行為與膜及過濾對象的物理化學特性有關(guān)。對微濾而言,其分離機理主要是篩分截留。液固分離主要作用:1)篩分,膜將尺寸大于孔徑的顆粒截留。2)吸附,膜將尺寸小于孔徑的顆粒吸附截留。3)架橋,固體顆粒在膜微孔入口處因架橋而被截留。4)網(wǎng)絡(luò),截留發(fā)生在膜內(nèi)部,因膜孔的曲折而形成。5)靜電,分離懸浮液帶電顆粒時,可采用帶相反電荷的微濾膜。能用孔徑比待分離的顆粒尺寸大許多的微濾膜,不僅可達到較好的分離效果,還可獲較高通量。9.微孔濾膜清洗和再生方法?微孔濾膜清洗和再生方法:將濾膜平放于清潔盛器內(nèi),用60℃左右的蒸餾水浸泡,使全部濕潤,數(shù)小時候(約4小時以)傾去水,再用上法浸泡12小時,使用前再用適量溫蒸餾水清洗一次。10.從原理上比較超濾和納濾兩種膜過濾技術(shù),簡要說明它們的主要差別?超濾的原理:以特殊超濾膜為分離介質(zhì),以膜兩側(cè)的壓差為推動力,將不同分子量物質(zhì)選擇性分離。納濾的原理:除按分子大小截留外,納濾膜表現(xiàn)出建立在離子電荷密度基礎(chǔ)上的選擇性,對含不同自由離子的溶液,透過膜的離子分布是不相同的(透過率隨離子濃度的變化而變化)主要差別:1)超濾是根據(jù)分子大小截留,而納濾除根據(jù)分子大小截留外,還會對不同價態(tài)離子選擇截留。對于極性(或荷電)溶質(zhì),其通過納濾膜時的截留率由靜電作用與位阻效應(yīng)共同決定,而對于非極性溶質(zhì)則主要取決于位阻效應(yīng)。2)超濾膜大多為不對稱膜,具有不對稱微孔結(jié)構(gòu),納濾膜大多為荷電膜,可選擇截留不同價態(tài)離子。3)超濾主要用于分離、提純和濃縮產(chǎn)品,而納濾在截留小分子有機物的同時可透析出鹽,即集濃縮于透析為一體。
13.濃縮技術(shù)1.什么是濃縮?濃縮是低濃度溶液通過除去溶劑(包括水)變?yōu)楦邼舛热芤旱倪^程。2.蒸發(fā)濃縮的基本原理?蒸發(fā)是溶液表面的溶劑分子獲得的動能超過了溶液內(nèi)溶劑分子間的吸引力而脫離液面而逸向空間的過程。當溶液受熱,溶劑分子動能增加,蒸發(fā)過程加快;液體表面積越大,蒸發(fā)越快。常用的濃縮方法有哪些?(1)薄膜蒸發(fā)濃縮:按膜的形成方法薄膜式蒸發(fā)濃縮可分為:①管式薄膜蒸發(fā)器,液膜在管壁加熱時形成,按其流動方向可分為:a.升膜式蒸發(fā)器:形成的液膜與蒸發(fā)的汽流的方向相同,由下而
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