磁性介孔納米材料的制備及性能的研究

通過水熱法合成了分散性良好的Fe3O4納米微球，在其外層包覆了介孔二氧化硅（MSN），并進一步修飾了殼聚糖（CS）和透明質(zhì)酸（HA），形成了高分散的納米微球Fe3O4@SiO2@MSN@CS@HA。通過掃描電鏡（SEM）透射電鏡（TEM）表整了幾納米微球的結構、形貌、粒徑及分散性。利用熱重分析儀（TGA）和比表面分析儀（BET）測試了其外層含量、比表面積和孔徑大小。通過紫外可見光譜分析儀測定了參與芬頓反應的性能，并計算其反應速率。結果表明，納米微球具有良好的分散性和載藥能力，且含有的二價鐵離子（Fe2+）可以進一步實現(xiàn)腫瘤的化學動力學治療（CDT）潛力。順磁性鐵基納米材料是最為常見的鐵死亡誘導劑，可作為芬頓反應中的納米催化劑是因其含有亞鐵粒子，其進入富含過氧化氫的腫瘤細胞中可以產(chǎn)生的羥基自由基（·OH）進而誘導腫瘤細胞死亡，從而實現(xiàn)腫瘤的化學動力學療法(CDT)治療。將Fe3O4與碳納米材料、Au、二氧化硅（SiO2）等無機材料組成核殼結構，從而顯著增強其磁性、生物相容性等性能。殼聚糖（CS）具有pH藥物控釋的特點，是作為藥物載體的良好材料。以四氧化三鐵（Fe3O4）納米粒子為核，通過對其外層包覆介孔二氧化硅（MSN）并修飾CS和透明質(zhì)酸（HA），制備出了Fe3O4@SiO2@MSN@CS@HA納米微球，并研究了其載藥釋藥性能。結果表明，F(xiàn)e3O4@SiO2@MSN@CS@HA納米微球具有良好的介孔結構，同時其包含的Fe2+可與腫瘤組織內(nèi)高濃度的過氧化氫（H2O2）引發(fā)芬頓反應，產(chǎn)生強氧化性的?OH實現(xiàn)殺死腫瘤CDT的潛力。01實驗部分1.1試劑與儀器六水合三氯化鐵FeCl3·6H2O、乙酸鈉（CH3COONa）、聚（4-苯乙烯磺酸-共聚-馬來酸）鈉鹽（PSSMA）、乙二醇、氟化鈉、硅酸乙酯（TEOS）、三乙醇胺（TEA）、FS-66、3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）、氟化鈣（CaF2）、異丙醇、硅酸乙酯（TEOS）均為分析純。HitachiU-3900紫外分光光度計；JEOL-2100F透射電子顯微鏡（TEM）和SEM掃描電子顯微鏡（FEIMagallan400）；ShimadzuTGA-50熱重分析儀（TGA）；TriStarII3flex比表面及孔徑分析儀（BET）。1.2材料制備1.2.1Fe3O4納米粒子的合成取1.5g的FeCl3

·6H2O、4.5g的CH3COONa、1.5g的PSSMA、0.5g的CaF2于120mL的乙二醇中，置于不銹鋼反應釜中密封。將反應釜置210℃熱處理10h。待反應釜自然冷卻至室溫后，用磁鐵吸附制備好的Fe3O4分散無水乙醇中超聲5min，使其分散均勻，放入冰箱中密封冷藏。1.2.2Fe3O4@SiO2@MSN納米粒子制備取0.1g的Fe3O4中加入10mL的蒸餾水，1%NaF加入3mL的TEOS乙醇溶液中混合溶液攪拌15h。反應完成后將溶液轉(zhuǎn)移至離心管中進行乙醇洗滌并密封后放入冰箱中冷藏保存。取0.76g的CTAB和TEA加入2mL溶有FS-66的異丙醇溶液，磁力攪拌1h后再加入5mLTEOS可制備出Fe3O4@SiO2

。取Fe3O4@SiO20.05g溶于裝有5mL蒸餾水的燒杯中，再向燒杯中加入10mL的模板液，超聲5min，慢速攪拌5h。隨后進行磁鐵吸附放入冰箱中密封冷藏。1.2.3Fe3O4@SiO2

@MSN@CS@HA的制備取Fe3O4@SiO2

@MSN溶于20mL蒸餾水中，再向燒杯中加入SDS溶液和20mmol/L的CS溶液過夜攪拌。Fe3O4@SiO2

@MSN@CS溶于裝有120mL蒸餾水的燒杯中，加入10mmol/L的HA溶液，攪拌12h后進行磁吸分離，并置于冰箱中保存。1.3性能測試1.3.1材料表征使用熱重分析儀測試和計算材料的熱損失曲線，以及分析Fe3O4@SiO2@MSN@CS@HA該復合納米材料中有機物的含量。通過透射電子顯微鏡（TEM）和掃描電子顯微鏡（SEM）觀察材料的形貌、微觀結構及組成。比表面積及其孔徑分析（BET）利用比表面積測試儀器對樣品進行測試，得到樣品的比表面積以及孔徑大小的數(shù)據(jù)。1.3.2芬頓反應測試在評估Fe3O4@SiO2@MSN@CS@HA復合納米顆粒催化H2O2產(chǎn)生?OH時，利用顯色反應實驗，將H2O2（50mol/L）、TMB（0.8mol/L）和Fe3O4@SiO2@MSN@CS@HA（50μg/mL）混合并測定其吸光度值，以檢測?OH的存在。將不同濃度的H2O2（20、50、100和200mol/L）、TMB（0.8mol/L）和Fe3O4@SiO2@MSN@CS@HA（50μg/mL）均勻混合，測定混合溶液在652nm處吸光度值5min的變化。1.3.3芬頓反應動力學根據(jù)Michaelis-Menten方程，測定不同H2O2濃度對芬頓反應的速率變化曲線并Lineweaver-Burke擬合方法計算Fe3O4@SiO2@MSN@CS@HA納米材料對的催化速率和Michaelis-Menten常數(shù)值。1.3.4載藥量測試利用紫外-可見分光光度計測定的Fe3O4@SiO2@MSN@CS@HA納米粒子負載抗癌藥物鹽酸阿霉素（DOX）的藥物釋放能力（DOX特定吸光波長為480nm）。DOX標準曲線計算選擇分別測定5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL濃度的吸光度。將超聲分散于蒸餾水中的相同濃度的復合納米粒子Fe3O4@SiO2@MSN@CS@HA（1mg/mL）與不同濃度DOX（20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL）溶液均勻混合，然后于離心管中避光震蕩反應24小時。然后離心（5000rpm，10min）后，測定離心管上清液的吸光度，然后計算DOX的包封率和載藥量，根據(jù)如下（1）和（2）公式計算。1.3.5體外藥物釋放體外藥物釋放研究采用透析袋法，在36℃溫度下，模擬腫瘤細胞微環(huán)境pH=6和正常細胞pH=7.5下進行。利用磷酸二氫鉀和醋酸氫二鈉溶液配置了pH=6與pH=7.5的PBS緩沖溶液，根據(jù)DOX的包封率和載藥量選取合適的鹽酸阿霉素的濃度，向兩種不同pH的PBS緩沖溶液中加入選取的合適的相同濃度的DOX負載的Fe3O4@SiO2@MSN@CS@HA復合納米粒子。02結果與討論2.1Fe3O4@SiO2@@MSN@CS@HA復合微球材料表征2.1.1納米微球形貌本研究通過水熱法合成Fe3O4@納米微球，通過多層包覆修飾后利用SEM與TEM對最終材料Fe3O4@SiO2@@MSN@CS@HA做了表征。從圖1（a）的SEM圖可以看到水熱法合成Fe3O4納米微球具有良好的分散性，且粒徑大小為175±50nm.圖1（b）為TEM照片，可以看到該納米微球是由眾多粒徑大小為5nm的Fe3O4納米粒子聚合而成。圖1（c）該復合納米粒子Fe3O4@SiO2@MSN@CS@HA的SEM照片，其呈現(xiàn)出清晰且均勻分散的顆粒狀形態(tài)，且顆粒呈球體狀，表面具有漏洞型凹槽，根據(jù)標尺的大小可看出該納米粒子的粒徑為250±100nm。從圖1（c）的TEM圖可以看出該復合納米粒子Fe3O4@SiO2@MSN@CS@HA具有核—殼結構，且其最外層有明顯的薄膜狀物質(zhì)，且具有樹枝狀介孔結構，可推測出是CS與HA已成功包覆到MSN的表層。通過元素面分布圖進一步證明該復合納米粒子中含有C、N、O、Si、Fe元素（圖2）。從上述實驗現(xiàn)象進一步說明MSN的外層成功的包覆了一層CS與HA，證明已經(jīng)成功制備分散性良好的Fe3O4@SiO2@MSN@CS@HA復合納米粒子。通過圖3磁分離前與磁分離后的圖可表明Fe3O4@SiO2@MSN@CS@HA納米顆粒具有良好的磁性。2.1.2TGA分析TGA對比包覆不同材料后的納米粒子進行表征發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)e3O4在包覆MSN后，材料在200攝氏度有質(zhì)量損失，而Fe3O4的熱損失較小，可歸其原因為Fe3O4材料外層包裹MSN后，F(xiàn)e3O4@SiO2@MSN材料孔道內(nèi)自由水和結合水的熱損失，（圖4）。200-450攝氏度附近，F(xiàn)e3O4和Fe3O4@SiO2@MSN的熱損失可歸因于該納米材料在合成過程中未洗脫的部分有機物的損失，F(xiàn)e3O4的熱損失物質(zhì)可能為PSSMA、乙二醇等；Fe3O4@SiO2@MSN的熱損失可歸因于其孔道內(nèi)和顆粒表面的硅羥基吸附了一些有機物質(zhì)，可能為FS-66、TEA、TEOS、PSSMA等的熱損失。Fe3O4@SiO2@MSN@CS材料比Fe3O4@SiO2@MSN多4%-6%的質(zhì)量損失，說明材料外層包覆了CS；200攝氏度Fe3O4@SiO2@MSN@CS比Fe3O4@SiO2@MSN多的質(zhì)量損失可進一步證明CS的成功修飾。Fe3O4@SiO2@MSN@CS@HA比Fe3O4@SiO2@MSN@CS多約6%-9%的質(zhì)量損失，進一步說明在MSN層上成功的包覆了CS和HA。通過計算可知該復合納米材料Fe3O4@SiO2@MSN@CS@HA中MSN層的含量為5.6%，CS層的含量為2.2%，HA層的含量為7.1%。2.1.3納米微球比表面及孔徑分析將Fe3O4@SiO2@MSN、Fe3O4@SiO2@MSN@CS、Fe3O4@SiO2@MSN@CS@HA干燥并進行預處理后，通過BET的氮氣吸附和脫附測試來了解材料的比表面積和孔徑大小。實驗結果Fe3O4@SiO2@MSN的比表面積為150.6499m2/g，F(xiàn)e3O4@SiO2@MSN@CS的比表面積為233.8965m2/g，F(xiàn)e3O4@SiO2@MSN@CS@HA的比表面積為259.1863m2/g。且樣品出現(xiàn)滯后環(huán)，表現(xiàn)出典型的IV型等溫線，是介孔二氧化硅通道的典型特征（圖5）。Fe3O4@SiO2@MSN、Fe3O4@SiO2@MSN@CS、Fe3O4@SiO2@MSN@CS@HA的吸附量逐漸增加，證明隨著CS與HA的包覆，納米材料的比表面積逐漸增大，表明最終的復合納米粒子可裝載更多的藥物分子，易于實現(xiàn)化療與化學動力學的協(xié)同治療。如圖6所示，孔徑分布曲線實驗結果表明Fe3O4@SiO2@MSN的平均孔徑為3.2nm，而Fe3O4@SiO2@MSN@CS和Fe3O4@SiO2@MSN@CS@HA的平均孔徑相同，為4.3nm。Fe3O4@SiO2@MSN@CS@HA的孔徑比Fe3O4@SiO2@MSN@CS的略小，孔體積比Fe3O4@SiO2@MSN@CS大。Fe3O4@SiO2@MSN@CS的孔徑比Fe3O4@SiO2@MSN的小，孔體積比Fe3O4@SiO2@MSN的大，說明CS與HA的鏈接使得該復合納米材料的孔隙增加，可為接下來的載藥提供更多的空間。上述實驗結果表明成功地制備出的Fe3O4@SiO2@MSN@CS@HA磁性復合納米粒子具有良好的分散性和穩(wěn)定性，可以在生物體內(nèi)長期循環(huán)具有潛在的應用于腫瘤治療的能力。2.2Fe3O4@SiO2@MSN@CS@HA化學動力學測試2.2.1芬頓反應腫瘤細胞的微環(huán)境具有酸性，且腫瘤細胞中線粒體內(nèi)的過表達超氧化物歧化酶產(chǎn)生過量的H2O2，會使得Fe3O4@SiO2@MSN@CS@HA納米材料解離產(chǎn)生Fe2+

，并與H2O2發(fā)生芬頓反應，產(chǎn)生大量具有細胞毒性的·OH，具有殺死腫瘤細胞的能力，從而實現(xiàn)腫瘤CDT治療。為了進一步探究Fe3O4@SiO2@MSN@CS@HA能否發(fā)生芬頓反應，從圖7（a）中可以得到，通過UV-Vis吸收光譜（400-800nm）向同濃度的Fe3O4@SiO2@MSN@CS@HA溶液中加入TMB或H2O2

，相對應的吸光度無明顯的吸收峰，表明TMB未變藍，證明Fe3O4@SiO2@MSN@CS@HA沒發(fā)生反應，在此基礎上再加入H2O2

，整個體系的吸光度發(fā)生明顯變化，且在652nm處有明顯的吸收峰，說明有·OH產(chǎn)生。加了H2O2的Fe3O4@SiO2@MSN@CS@HA溶液也沒有明顯的吸收峰變化，并不能說明該材料Fe3O4@SiO2@MSN@CS@HA與H2O2不反應，因為Fe3O4@SiO2@MSN@CS@HA分解產(chǎn)生的Fe2+與H2O2反應發(fā)生芬頓反應產(chǎn)生的·OH并不能被UV-Vis捕捉檢測到，由圖7（b）可以看到只加了TMB與H2O2沒有明顯的顯色變化，而加了TMB和H2O2有明顯的顯色變化，說明TMB是作為顯色劑存在，證明H2O2和Fe3O4@SiO2@MSN@CS@HA發(fā)生了芬頓反應。2.2.2H2O2濃度對芬頓反應的影響在上述實驗驗證H2O2和Fe3O4@SiO2@MSN@CS@HA發(fā)生芬頓反應后，又探究了在652nm下，H2O2濃度對芬頓反應的影響，選擇20mmol/mL、50mmol/mL、100mmol/mL、200mmol/mL的濃度來測試溶液生成·OH的濃度（圖7c）。證明相同濃度的Fe3O4@SiO2@MSN@CS@HA和TMB發(fā)生芬頓反應時，溶液的吸光度隨著H2

O2濃度的增大而增大，這表明在腫瘤微環(huán)境H2O2的濃度越高，納米粒子Fe3O4@SiO2@MSN@CS@HA參與的芬頓反應中會產(chǎn)生更多的·OH，增加腫瘤細胞的死亡率。圖7（d）進一步佐證了H2O2對Fe3O4@SiO2@MSN@CS@HA參與芬頓反應的影響，溶液變藍說明有芬頓反應的發(fā)生。2.2.3芬頓反應動力學為了進一步評估初始羥基自由基的生成速率，使用Bill-Lambert定律（A=kbc)計算氧化后TMB（藍色）的濃度變化率。根據(jù)Michaelis-Menten方程可以得到不同濃度的TMB與H2O

2發(fā)生酶促反應的的關系圖（圖8（a）），如下式（3）所示。通過lineweaver-burke擬合（圖8b）計算出Fe3O4@SiO2@MSN@CS@HA納米顆粒催化H2O2反應的Vmax為0.0134mol/s，Km為68.8064mol/L，表明了合成的復合納米顆粒Fe3O4@SiO2@MSN@CS@HA引發(fā)芬頓反應可產(chǎn)生·OH，且具有良好的催化性能，可應用于腫瘤CDT。2.3Fe3O4@SiO2@MSN@CS@HA納米顆粒的載藥能力和釋藥能力2.3.1載藥能力測試為了提高藥物利用率，降低單獨注射化療藥物不能集中而對生物體造成的傷害，實現(xiàn)可控釋藥。Fe3O4@SiO2@MSN@CS@HA同濃度的條件下，不同濃度的DOX的吸光度（圖9a），得到其紫外可見吸收標準曲線及其線性關系函數(shù)。測試了Fe3O4@SiO2@MSN@CS@HA復合納米粒子條件對不同濃度的DOX的包封率及載藥量，當DOX的濃度為20μg/mL時，包封率可達90%以上，DOX濃度為50μg/mL時，包封率達60%以上，DOX為100μg/mL時，包封率為30%左右，實驗說明隨著DOX濃度的增加，該復合納米粒子Fe3O4@SiO2@MSN@CS@HA的包封率在降低（圖9b），相同條件下復合納米粒子Fe3O4@SiO2@MSN@CS@HA的載藥量隨DOX濃度的增加而增加。如圖9（c）所示，雖然DOX濃度為50μg/mL和100μg/mL的差別很小，但100μg/mL的載藥量比50μg/mL的大，實驗總體的載藥量低于4%，是由于制劑中藥物的含量遠遠小于制劑總量。實驗結果說明該復合納米粒子Fe3O4@SiO2@MSN@CS@HA具有