分子生物學第一章

第一章

核酸的分子結構、性質和功能核酸由許多核苷酸聚合而成的生物大分子化合物，為生命的最基本物質之一。最早由F.

Miescher于1868年在膿細胞中發(fā)現和分離出來。包括核糖核酸（RNA）和脫氧核糖核酸（DNA）除少數病毒（RNA病毒）以RNA作為遺傳物質外，多數有機體的遺傳物質是DNA。核酸的組成成分核酸nucleicacid核苷酸nucleotide核苷nucleoside磷酸phosphate嘌呤堿purinebase或嘧啶堿pyrimidinebase堿基base核糖→

RNA或脫氧核糖→DNA戊糖amylsugar1、戊糖：核糖和脫氧核糖OHOH2COHOHOH12OHOH2COHHOH12β-D-2-核糖β-D-2-脫氧核糖O核酸的組成2、堿基(base)核酸中的嘧啶堿基核酸中的嘌呤堿基嘌呤堿和嘧啶堿NNNNHHHHNNNNHHHH123456789嘌呤NH2腺嘌呤adenine（A）NNNNHHHHOH2N鳥嘌呤guanine（G）NNHHHH嘧啶123456NNHHHHNH2OH胞嘧啶Cytosine（C）NNHHHHOOHH尿嘧啶uracil（U）NNHHHHOOHHCH3胸腺嘧啶thymine（T）3、核苷（戊糖+堿基）OHOH2COHHOH1′2′3′4′5′脫氧核糖NNNNHNH2HH9腺嘌呤脫氧腺苷OHOH2COHOHOH1′2′3′4′5′核糖NNOOHHH尿嘧啶H1尿苷核苷核糖核苷（上）與脫氧核糖核苷（下）4、核苷酸（核苷+磷酸）OHOH2COHHOH1′2′3′4′5′核糖NNNNHHHH9腺嘌呤脫氧胸苷PO-O‖5′-胸腺嘧啶脫氧核苷酸O-—核苷酸核糖核苷酸（上）與脫氧核糖核苷酸（下）第一節(jié)DNA的結構和功能

一、DNA的一級結構☆概念：

是指四種脫氧核苷酸（dAMP、dCMP、dGMP、dTMP）通過3’,5’磷酸二酯鍵連接成具有一定長度的多聚體（脫氧核苷酸的數量），以及這些脫氧核苷酸的排列順序。DNA一級結構的表達方式書寫：線條式和文字式核苷酸之間的連接方式是：DNA中前一個脫氧核苷酸的3’羥基和下一個脫氧核苷酸的5’磷酸形成3’,5’磷酸二酯鍵。通常堿基順序從DNA鏈的5′→3′方向書寫。名稱：DNA序列/DNA順序、堿基序列HO-O

O—CH2

TO=P—O-3′5′OHHO-O

O—CH2

GO=P—O-3′5′OHO

O—CH2OHH

AO=P—OO-3′5′3′5′1′PPPOHATGpGpTpAOHpG-T-A5′GTA3′DNA序列（一級結構）：

e.g.甲苯雙加氧酶基因

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ctag生物學意義DNA一級結構決定了DNA分子的多樣性由1000個脫氧核苷酸組成的DNA，有41000個排列組合，即有41000個DNA分子DNA一級結構的不同是物種間差異的根本原因?！盎颉迸c“DNA”不同的基因，其DNA順序不同二、DNA的二級結構☆概念：指兩條脫氧核苷酸鏈（DNA單鏈/一級結構）以反向平行的形式，圍繞一個中心軸盤繞所形成的雙螺旋結構。DNA分子由兩條多聚脫氧核糖核苷酸鏈(DNA單鏈)組成。兩條鏈走向相反，沿著同一根軸平行盤繞，形成雙螺旋結構。堿基位于螺旋的內側，磷酸和脫氧核糖基位于螺旋外側。螺旋內部：A-T,G-CDNA的雙螺旋結構特征大溝小溝DNA二級結構模式右手螺旋B型：最穩(wěn)定的構型，生理條件下，DNA雙螺旋大多以B型形式存在。

A型C型、D型左手螺旋Z型不同構型的DNAWatsonandCrick雙螺旋結構模型DNA雙螺旋結構（B型DNA）1979年Rich等在研究人工合成的CGCGCG的晶體結構時發(fā)現。結構特點是兩條反向平行的多核苷酸互補鏈組成的螺旋呈鋸齒形，其表面只有一條深溝，每旋轉一周是12個堿基對。其功能可能與基因表達的調控有關。

Z-DNA B-DNA

Z型DNA生物學意義DNA二級結構的各種構象間、二級結構和高級結構間、以及高級結構間的各種構象變化，始終處于一個動力學平衡中，是基因表達調控的基礎三、DNA的三級結構概念：指在DNA雙螺旋結構基礎上，進一步扭曲折疊所形成的特定空間結構。超螺旋DNA：指DNA雙螺旋通過彎曲和扭轉所形成的特定構象，是DNA三級結構的一種結構模式。正超螺旋：使雙螺旋結構更緊密，雙螺旋圈數增加負超螺旋：可以減少雙螺旋的圈數。幾乎所有天然DNA中都存在負超螺旋結構。DNA的超螺旋結構閉合環(huán)狀DNA形成的超螺旋共價閉合環(huán)狀DNA分子生物學意義DNA的超螺旋化及其程度，在整個DNA分子中并不是均勻的，而DNA特定區(qū)域中超螺旋程度的增加和改變，有助于DNA的構象轉化，從而促使DNA雙鏈解鏈或局部熔解，這種結構上的變化對復制、轉錄等的啟動具有重要的調控作用1957年發(fā)現在基因的調控區(qū)或染色質的重組部位有DNA的三螺旋結構四、三鏈DNAHoogsteen配對在三股螺旋中，通常是一條同型寡聚核苷酸與寡聚嘧啶核苷酸-寡聚嘌呤核苷酸雙螺旋的大溝結合。第三股的堿基可與Watson-Crick堿基對中的嘌呤堿形成Hoogsteen配對。第三股螺旋與寡聚嘌呤核苷酸同向平行。類型：Py.Pu*Py

Py.Pu*PuDNA→→→染色體

DNA的高級結構第二節(jié)RNA的結構和功能RNA的結構單鏈線型局部雙螺旋結構、環(huán)狀結構高級結構功能mRNA，tRNA，rRNA其他小分子RNARNA的功能mRNA(messengerRNA，信使RNA）是蛋白質合成的模板tRNA（transferRNA，轉運RNA）轉運活化的氨基酸至mRNA模板上rRNA（ribosomalRNA，核糖體RNA）為核糖體的主要部份，功能為提供一個環(huán)境能使tRNA對應到mRNA上的密碼子，而合成蛋白質。核苷酸語言—氨基酸語言一、mRNA，tRNA，rRNA（一）mRNA和hnRNA核內不均一RNA(hnRNA)

真核生物中，細胞核基因轉錄初產物RNA的平均長度比mRNA長，性質非常不穩(wěn)定，序列的復雜程度也非常高，因此稱之為核內不均一RNA(hnRNA)，主要為mRNA前體。mRNA是蛋白質合成的模板真核生物mRNA的結構特點①3’-端具有polyA結構②mRNA的5’端有一個“帽子”結構：

m7G5’pppN防止核酸外切酶對mRNA的降解識別起始點（核糖體識別mRNA）③只有一個開放閱讀框（ORF），只能編碼一條肽鏈

開放閱讀框開放閱讀框(openreadingframe,ORF)

從mRNA分子上5

端起始密碼子AUG到3

端終止密碼子之間的核苷酸序列，各個三聯體密碼連續(xù)排列編碼一個蛋白質多肽鏈真核生物和原核生物mRNA結構比較真核生物mRNA原核生物mRNA70-90個核苷酸組成3′端：CCA序列（CpCpAOH

）氨基酸通過與3′-OH端連接，形成氨基酰-tRNA分子含稀有堿基如假尿嘧啶核苷(ψ)，各種甲基化的嘌呤和嘧啶核苷，二氫尿嘧啶等

tRNA一級結構特點（二）tRNA的結構與功能三葉草結構氨基酸臂二氫尿嘧啶環(huán)反密碼環(huán)額外環(huán)TψC環(huán)tRNA二級結構特點密碼子-反密碼子反向互補配對tRNA三維結構

tRNA與酶結合的模型tRNA氨基酰-tRNA合成酶ATP氨基酸+

tRNA氨基酰-tRNAATP

AMP＋PPi氨基酰-tRNA合成酶蛋白質生物合成的起始：氨基酸的活化（即形成氨基酰-tRNA）氨基酰-tRNA（三）rRNA16SrRNA結構特征：莖環(huán)結構rRNA為核糖體主要成分rRNA為核糖體的主要部份，其功能為提供一個環(huán)境能使tRNA對應到mRNA上的密碼子，而合成蛋白質。mRNA核糖體肽鏈粗面內質網核糖體是蛋白質的生物合成的場所核糖體是最小的細胞器，光鏡下見不到的結構。在1953年由Ribinson和Broun用電鏡觀察植物細胞時發(fā)現胞質中存在一種顆粒物質。核糖體的結構組成核糖體種類亞基rRNA蛋白質分子數目原核生物70s（30s、50s）16s5s23s2134真核生物80s（40s、60s）18s5s5.8s28s3050二、其它小分子RNA真核細胞的小分子RNA：核小RNA（snRNA）：核內

胞漿小RNA（scRNA）：胞漿內端粒酶RNA和核酶端粒酶（telomerase）是一種自身攜帶RNA模板的的逆轉錄酶，催化端粒DNA的合成，能夠在缺少DNA模板的情況下延伸端粒內3′端的寡聚核苷酸片段。核酶（ribozyme）是具有酶作用的一類RNA第三節(jié)核酸的分子雜交一、核酸分子雜交的基本原理在一定的條件下，雙螺旋之間氫鍵斷裂，雙螺旋解開，形成無規(guī)則線團，雙鏈解鏈成為單鏈——變性變性DNA經過一定處理重新形成雙螺旋的過程復性核酸的雜交兩條來源不同，但具有互補序列的核酸（DNA或RNA），按堿基配對原則復性形成一個雜交體，這個過程即雜交（hybridization）

，或稱分子雜交。DNA-DNA

DNA-RNA

RNA-RNA具有互補序列的兩條單鏈核酸都可互補形成雙鏈：核酸探針（nucleicacidprobe）

指能與靶分子核酸按堿基互補原則特異性相互作用的一段已知序列的寡核苷酸或核酸。通常是人工合成的。二、核酸探針及標記

探針的標記探針以共價鍵形式結合能夠產生強烈信號的基團、原子、或能與一些產生強烈信號分子特異性結合的配體。標記物：同位素、熒光基團、發(fā)光基團、生物素等三、核酸分子雜交的應用（一）SouthernBlot用于檢測重組DNA，也可分析DNA樣品中是否有與探針序列同源的DNA片段。用于基因診斷SouthernBlot方法：將DNA經限制性內切酶酶切后進行瓊脂糖電泳把分離后定位在凝膠上的不同分子量的DNA經堿變性處理將凝膠中變性的DNA轉移至一固相支持濾膜（硝酸纖維素膜）。利用標記的探針與固著于硝酸纖維素膜上的DNA發(fā)生同源性雜交利用放射自顯影（化學發(fā)光法或顯色法）檢測。

SouthernBlot實驗流程分子雜交技術的應用SouthernblotNorthernblotWesternblot原位雜交基因芯片檢測DNA片段檢測RNA片段蛋白質印跡組織或細胞水平原位雜交復印至硝酸纖維素膜上用NaOH菌體裂解DNA變性雜交放射自顯影32P-cDNA與放射性cDNA雜交的菌落的斑點細菌菌落單鏈DNA結合到膜上（五）生物芯片——基因芯片生物芯片（biochip）將數以萬計的生物大分子探針分別固定在一個微小載體的表面制成的芯片。基因芯片基因芯片又稱DNA芯片、DNA微陣列，簡單地說就是在一塊指甲大小（1cm3）的有多聚賴氨酸包被的硅片上或其它固相支持物（如玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纖維素膜、尼龍膜等，但需經特殊處理）布放數千或數萬個核酸探針。1、將大量寡核苷酸分子固定于支持物上基因芯片基本原理2、然后與標記的樣品進行雜交

3、通過檢測雜交信號的強弱進而判斷樣品中靶分子的數量?；蛐酒夹g由于同時將大量探針固定于支持物上，所以可以一次性對樣品大量序列進行檢測和分析，從而解決了傳統(tǒng)

SouthernBlot和NorthernBlot技術操作繁雜、自動化程度低、操作序列數量少、檢測效率低等不足。應用價值：基因表達譜測定、突變檢測、多態(tài)性分析、基因組文庫作圖及基因測序等。第四節(jié)反義核酸及藥物1978年，Stephenson和Zarmmeenik首次報道了反義寡核苷酸（antisense

oligodeoxyribonucleotides，AS-ODN）可抑制勞斯肉瘤病毒（RSV）的復制。1984年，Lzant和Weintraub又提出了“反義核酸技術”的概念，即根據堿基互補原理，用人工合成或生物合成的特定互補的DNA或RNA序列，導入靶細胞，形成mRNA-DNA或mRNA-RNA雜交雙鏈，從而抑制或封閉基因表達，使其喪失活性，達到基因控制和治療的目的。反義核酸的概念反義核酸根據堿基互補原理，人工合成或生命體合成的特定的DNA或RNA片段，與目的核酸序列互補結合，通過空間位阻效應或誘導RNase活性的降解作用，抑制或封閉目的基因的表達。反義核酸的靶核酸區(qū)域mRNA5′端非翻譯區(qū)mRNA5′端編碼區(qū)mRNA5′端帽子形成位點區(qū)域mRNA3′端polyA形成位點區(qū)域阻止mRNA的成熟及向胞漿中的轉運反義技術與藥物反義DNA是人工合成的與待封閉基因的某一區(qū)段互補的正?；蚧瘜W修飾的DNA片段，用來抑制或封閉這一基因的表達。反義RNA序列與靶RNA（多為mRNA）的序列互補的RNA片段，通過與靶RNA形成雙鏈復合物而影響其正常的修飾、翻譯等過程，從而抑制或封閉靶RNA的功能。反義RNA作用機制反義RNA與基因治療siRNA與基因治療肽核酸（peptidenucleicacid，PNA）是一種全新的DNA類似物。該分子的特點是以中性的類氨基多肽鏈取代了DNA中的戊糖磷酸骨架，其余的與DNA相同。

PNA可以通過堿基配對的形式識別并結合DNA或RNA序列，形成穩(wěn)定的雙螺旋結構。反義核酸在疾病治療中的應用

用于腫瘤治療用于病毒感染的治療用于血管性疾病的治療用于遺傳性疾病的治療第五節(jié)RNAiRNAi(RNAinterference)即RNA干擾，是近年來發(fā)現的在生物體內普遍存在