第九章-細(xì)菌類疫苗總結(jié)

1第九章細(xì)菌類疫苗2細(xì)菌類疫苗定義：用細(xì)菌、支原體、螺旋體或其衍生物制成，進(jìn)入人體后使機(jī)體產(chǎn)生抵抗相應(yīng)細(xì)菌能力的生物制品——細(xì)菌類疫苗種類：（1）減毒活疫苗（2）滅活疫苗（3）亞單位疫苗或成分疫苗第一節(jié)概述3（3）亞單位疫苗或成分疫苗主要指在細(xì)菌培養(yǎng)液中提取，用化學(xué)方法脫毒的類毒素，如破傷風(fēng)類毒素、白喉類毒素。成分疫苗：主要指從莢膜細(xì)菌純化的細(xì)菌多糖疫苗，其誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的抗體可抵抗莢膜菌的感染。4附表：目前用于人群的細(xì)菌性疫苗卡介苗百日咳疫苗腦膜炎球菌疫苗傷寒疫苗精制破傷風(fēng)疫苗（類毒素）霍亂弧菌疫苗痢疾疫苗用法：i.d.,s.c.,d.s.,i.m.,p.o.5基本流程菌液佐劑+乳化分裝和保存原料配置滅活菌液滅活第二節(jié)細(xì)菌滅活疫苗6滅活疫苗的生產(chǎn)工藝與檢定菌種檢定與制備1）菌種檢定：包括培養(yǎng)特性、血清學(xué)特性、毒力試驗、抗原性試驗、免疫力試驗制苗用菌種多數(shù)為毒力強(qiáng)、免疫原性優(yōu)良的菌株，通常使用1-3個品系，均由中國藥品生物制品檢定所或中國獸藥監(jiān)察所傳代、鑒定、凍干保存和供應(yīng)。各種用于制造菌苗的菌種應(yīng)按規(guī)定定期復(fù)壯，并進(jìn)行形態(tài)、培養(yǎng)特性、菌型、抗原性和免疫原性鑒定，合格菌種準(zhǔn)許用于制苗。7滅活疫苗的生產(chǎn)工藝與檢定菌種檢定與制備2）菌種制備菌種啟開：接種于適宜的培養(yǎng)基上，37±1°C一代培養(yǎng)；擴(kuò)量轉(zhuǎn)種：一代菌種的擴(kuò)量接種，于37±1°C二代培養(yǎng)。將經(jīng)鑒定符合標(biāo)準(zhǔn)的菌種接種于菌苗生產(chǎn)規(guī)程中所規(guī)定的培養(yǎng)基進(jìn)行增殖培養(yǎng)，經(jīng)純粹檢查、活菌計數(shù)達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)后即為種子液，用于菌苗生產(chǎn)。種子液通常保存于2-8

C冷暗處，不得超過規(guī)程規(guī)定的使用期限。82.生產(chǎn)方法（1）固體培養(yǎng)法：克氏瓶、茄形瓶（2）液體靜置培養(yǎng)法、液體深層通氣培養(yǎng)法3.細(xì)菌采集（1）固體培養(yǎng)法采集時逐瓶檢查，污染雜菌者廢棄。（2）液體培養(yǎng)法采集時應(yīng)做純菌試驗，確定無雜菌生長。94.殺菌、脫毒（滅活）殺菌劑對疫苗的質(zhì)量至關(guān)重要，通常根據(jù)細(xì)菌的特性加入最有效的滅活劑，我國多用甲醛，終濃度不超過1%。殺菌檢查：取樣接種于不含瓊脂的硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基、瓊脂斜面及堿性瓊脂斜面各一支，37℃培養(yǎng)5d，應(yīng)無本菌生長。表幾種滅活菌苗的滅活方法

105濃縮

為提高某些滅活菌苗的免疫力，在培養(yǎng)過程中采取提高菌數(shù)的基礎(chǔ)上，再通過濃縮方法達(dá)到目的。

常用的濃縮方法：氫氧化鋁膠吸附沉淀法離心沉降法羧甲基纖維沉淀法

以上方法可使菌液濃縮一倍以上。

此外，有些細(xì)菌在生長過程中產(chǎn)生分子量小的可溶性抗原（如豬丹毒桿菌產(chǎn)生的糖蛋白）也可經(jīng)氫氧化鋁吸附濃縮；將破傷風(fēng)脫毒液按鹽酸—食鹽法處理，以作進(jìn)一步精制成提純破傷風(fēng)類毒素。116.原液檢定及保存：濃度測定：按“中國細(xì)菌濁度測定標(biāo)準(zhǔn)”測定濃度鏡檢：涂片染色，至少觀察10個視野，應(yīng)菌型典型，無雜菌凝集試驗：血清型定型凝集試驗，應(yīng)呈陽性反應(yīng)無菌試驗:需氧菌、厭氧菌及真菌試驗應(yīng)陰性免疫力試驗：原液保存：（2-8℃，3-4年有效）127.配苗及分裝由于滅活菌苗所用的佐劑不同，所以配苗方法也不相同。

氫氧化鋁菌苗：可在加入甲醛滅活的同時，按比例加入氫氧化鋁膠配制；也可在菌液經(jīng)甲醛滅活后再按比例加入氫氧化鋁膠配苗。有的廠油佐劑菌苗的配制程序為：于滅菌的油乳劑135m110號白油、11.4m1Span-85、3.6mlTween80混合液中，在邊攪拌下加入等量甲醛滅活菌液配制。配苗和分裝：應(yīng)充分混勻，及時塞塞、貼簽或印字8.成品檢定按規(guī)程進(jìn)行13常用滅活細(xì)菌疫苗1.霍亂疫苗（1）霍亂簡介由霍亂弧菌引起的烈性腸道傳染病，霍亂弧菌在小腸分泌霍亂毒素（choleratoxin），引起腹瀉及其他癥狀。（2）抗原鞭毛抗原：不耐熱，無分型意義，有免疫保護(hù)作用。菌體抗原：主要成分為脂多糖（LPS），耐熱，根據(jù)其抗原決定基可分為200多鐘血清型，O1和O139為流行血清型。14（3）目前最常用的霍亂疫苗口服霍亂滅活全菌體+重組霍亂毒素B亞單位重組霍亂毒素B亞單位（sBS）具有黏膜免疫佐劑特性，該疫苗安全有效且無明顯不良反應(yīng)，保護(hù)力持久。152.傷寒疫苗（1）概述由傷寒沙門桿菌引起的急性全身感染，患者出現(xiàn)高熱，胃腸炎，敗血癥等。含有三類抗原:LPS，莢膜多糖(vi)，鞭毛抗原，耐藥性比較嚴(yán)重。（2）生產(chǎn)工藝與檢定全菌體死疫苗分三種，按殺菌劑不同可分為丙酮滅活苗，加溫加酚滅活苗，甲醛滅活苗。16①菌株我國現(xiàn)用兩個菌株生產(chǎn)疫苗：國際通用Ty2株國內(nèi)代表株②培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法采用馬丁瓊脂、肉湯瓊脂或其他經(jīng)批準(zhǔn)的培養(yǎng)基，主要采用固體培養(yǎng)法，也可進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)接種后35~37℃培養(yǎng)18~24h。17③成品檢定鑒別試驗、外觀、化學(xué)檢定、無菌試驗、異常毒性試驗、菌形及純度檢查④疫苗規(guī)格及有效期每安瓿瓶5ml，每人用劑量含傷寒菌6×107~3×108，2~8℃避光保存和運(yùn)輸，有效期1.5年。18（3）傷寒Vi多糖疫苗早期乙酸處理Vi多糖，抗原性明顯降低，經(jīng)溴化-16-烷基-3-甲基氨處理Vi多糖，得到的非變性多糖可顯示較好的免疫原性，但是對2歲以下兒童無效，且多糖是T淋巴細(xì)胞非依賴性抗原，不具有加強(qiáng)免疫記憶的作用，蛋白質(zhì)-Vi多糖結(jié)合疫苗正在研制當(dāng)中。莢膜（Vi）抗原:即莢膜多糖（CPS）,是傷寒桿菌細(xì)胞外壁的一種莢膜抗原,Vi抗原與其致病性有關(guān)Vi來源于毒力的縮寫。19（4）傷寒Ty21a口服減毒活疫苗德國學(xué)者將野生型菌株Ty2經(jīng)化學(xué)突變劑亞硝基胍處理而獲得的突變株，在提供較高免疫保力的同時具有很高的安全性。203.百日咳疫苗1）概述由百日咳桿菌引起的急性呼吸道傳染病，主要侵犯嬰幼兒，全病程較長，可持續(xù)幾個月，故名百日咳。百日咳菌可分四種相變：Ⅰ相菌毒力最強(qiáng)，有免疫原性；Ⅳ相毒力消失，無免疫原性；Ⅱ、Ⅲ相菌介于Ⅰ、Ⅳ之間。222）百日咳死疫苗的生產(chǎn)工藝與檢定①菌種生產(chǎn)用菌種采用百日咳Ⅰ相含1型、2型、和3型凝集原的菌株。②培養(yǎng)方法固體培養(yǎng)采用半綜合碳瓊脂培養(yǎng)基，也可發(fā)酵生產(chǎn)。23③原液檢定濃度測定、鏡檢、血清學(xué)試驗、無菌試驗、特異性毒性試驗、效價測定。④原液保存2~8℃，有效期3年⑤配合稀釋及分裝按原液中具有1、2和3型菌株的配比混合，也可制成百白破三聯(lián)疫苗（百日咳、白喉、破傷風(fēng)）24弱毒菌種多系凍干品，由中國藥品生物制品檢定所或中國獸藥監(jiān)察所傳代、鑒定、保存與分發(fā)，少數(shù)由國家指定單位鑒定、保存與供給。菌種使用前應(yīng)按規(guī)程規(guī)定進(jìn)行復(fù)壯、挑選，并作形態(tài)、特性、抗原性和免疫原性鑒定，符合標(biāo)準(zhǔn)后方可用于制苗。將檢定合格的菌種接種子于規(guī)定的培養(yǎng)基，按規(guī)定的條件增殖培養(yǎng)，經(jīng)純粹檢查及有關(guān)的檢查合格者即可作為種子液。種子液通常在0～4

C可保存2個月，在保存期內(nèi)可作為菌苗生產(chǎn)的批量種子使用。第三節(jié)細(xì)菌減毒活疫苗

一、生產(chǎn)工藝與檢定（一）菌種與種子25按1%～3%量將種子液接種于培養(yǎng)基，然后依不同菌苗要求進(jìn)行培養(yǎng)。如豬丹毒弱毒菌須在在深層通氣培養(yǎng)中加入適當(dāng)植物油作消泡劑，通入過濾除菌的熱空氣進(jìn)行培養(yǎng)制造菌液如人用炭疽活疫苗、卡介苗經(jīng)固體表面培養(yǎng)完成后須按規(guī)定要求將菌苔洗下制成菌液菌液于0～4

C暗處保存，待抽樣經(jīng)純粹、活菌數(shù)等檢查合格后使用。（二）菌液培養(yǎng)26

經(jīng)檢驗合格的菌液，按規(guī)定比例加入保護(hù)劑配苗，充分搖勻后隨即進(jìn)行分裝，分裝量必須準(zhǔn)確。分裝好的菌苗迅速送入凍干柜進(jìn)行預(yù)凍、真空干燥，凍于完畢后立即加塞、抽空、封口，移入冷庫保存，并由質(zhì)檢部門抽樣檢驗。

（四）配苗與凍干

為提高某些弱毒菌苗的免疫效果，可進(jìn)行濃縮，以提高單位活菌數(shù)，常用的依縮方法有吸附劑吸附沉降法、離心沉降法等，如于豬丹毒菌液內(nèi)加入0.2%～0.25%羧甲基纖維素(CMC)進(jìn)行濃縮，也可用離心沉淀濃縮。濃縮菌液應(yīng)抽樣作純粹、活菌數(shù)等檢查。（三）濃縮27流程圖1——細(xì)菌疫苗制造工藝流程蛋白質(zhì)、肉浸液等原料培養(yǎng)基細(xì)菌分離菌種弱毒菌種配置、滅菌鑒定減毒檢驗配制滅菌檢驗配制滅菌原料佐劑滅活菌液配苗、乳化滅活疫苗培養(yǎng)菌苗原液配苗活疫苗保護(hù)劑菌液分裝、凍干分裝滅活原料活化種子2829二、常用細(xì)菌減毒活疫苗

炭疽疫苗

結(jié)核疫苗

鼠疫疫苗1、炭疽疫苗1）概述：定義：由炭疽桿菌引起的人畜共患的一種急性傳染病。特點(diǎn)：潛伏期3-5d。臨床表現(xiàn)為皮膚、肺部、腦膜和腸道等處的急性感染。臨床分型：①體表感染型②消化道感染型③呼吸道感染型30

2）炭疽菌的病原學(xué)①革蘭氏陽性，個體最大的桿菌之一，呈竹節(jié)狀，無鞭毛，在機(jī)體內(nèi)或特殊培養(yǎng)條件下能形成莢膜。②營養(yǎng)要求不嚴(yán)，需氧，最適溫度34~37℃炭疽桿菌的營養(yǎng)細(xì)胞抵抗力不強(qiáng)，芽孢抵抗力強(qiáng)，過氧乙酸、高錳酸鉀、和甲醛對芽孢的殺滅力較強(qiáng)。31③抗原菌體抗原：多糖組分，耐熱性強(qiáng)。莢膜抗原：由質(zhì)粒決定，可以抵抗細(xì)胞的吞噬作用，引起感染，對動物沒有免疫保護(hù)力，不能作為疫苗。毒素抗原：水腫因子（EF）；致死因子（LF）；保護(hù)性抗原（PA）；單獨(dú)組分無毒性，成對結(jié)合才能獲得毒素活性。323）炭疽疫苗（1）目前人用炭疽疫苗①減毒活疫苗②鋁膠培養(yǎng)上清液疫苗（2）炭疽疫苗的生產(chǎn)工藝與檢定①生產(chǎn)用菌株人、獸用的炭疽活疫苗生產(chǎn)均采用無莢膜具毒素（cap-tox+）菌株，我國采用的的A16R菌種均由藥品生物制品檢定所分發(fā)。33②培養(yǎng)及收獲生產(chǎn)用培養(yǎng)基采用牛肉汁瓊脂或其他批準(zhǔn)培養(yǎng)基③半成品配置及分裝用滅菌的50%甘油將原液稀釋成每ml含菌數(shù)4×109④成品檢定鑒別試驗、外觀、純菌試驗、特異性毒性試驗活菌數(shù)測定、濃度測定、效力測定34⑤疫苗規(guī)格及有效期安瓿瓶裝，10人份含菌2×109，2~8℃避光保存運(yùn)輸，有效期兩年。（3）目前人用炭疽疫苗的缺點(diǎn)①毒力不穩(wěn)定②采用劃痕接種，免疫效果不均一③副反應(yīng)較大④免疫保護(hù)力持續(xù)時間比較短352、結(jié)核疫苗病原菌為結(jié)核桿菌，能引起人畜共患結(jié)核?。?）流行概況全世界約1/3人口感染；每年約1600萬人患病，其中300多萬人死于結(jié)核病。中國治療難題：①發(fā)現(xiàn)率低；②無法接受正規(guī)治療或沒錢治療；③耐藥性36（2）傳染與傳播方式主要由呼吸道傳染，少數(shù)由消化道和皮膚粘膜的損傷處侵入。傳播方式：①飛沫傳染②痰液傳染③食物傳染④接觸傳染37（3）結(jié)核桿菌的潛伏和復(fù)燃結(jié)核桿菌類脂質(zhì)等成分能對抗溶酶體中酶的破壞作用，使細(xì)菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)繁殖，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞裂解死亡，病狀擴(kuò)散至鄰近淋巴結(jié)，形成原發(fā)感染灶，當(dāng)機(jī)體抗感染力較強(qiáng)時，淋巴結(jié)病灶逐漸纖維化和鈣化，此時病灶內(nèi)的結(jié)核桿菌處于休眠期，并潛伏下來，幾年或十幾年后，結(jié)合桿菌可以重新復(fù)燃，引起成年人肺結(jié)核。38（4）結(jié)合桿菌抗藥性伴隨著結(jié)核病回升的另外一個問題是抗藥性的產(chǎn)生，多重抗藥性的發(fā)生率也越來越高，研制和開發(fā)有效的結(jié)合新疫苗勢在必行。392）結(jié)核桿菌的病原學(xué)①革蘭氏陽性，含分枝酸，具有抗酸性，胞壁含大量脂質(zhì)，有較強(qiáng)的抵抗力②滅菌方法③具有免疫佐劑活性403）結(jié)核疫苗——卡介苗的生產(chǎn)工藝與檢定卡介苗（BCG）是牛型結(jié)合桿菌經(jīng)培養(yǎng)后，收集菌體，加入穩(wěn)定劑凍干后制成的，用于預(yù)防結(jié)核?、倬N卡介菌D2PB302菌株②培養(yǎng)和收集生產(chǎn)用培養(yǎng)基采用蘇通馬鈴薯培養(yǎng)基、膽汁馬鈴薯培樣基或液體蘇通培養(yǎng)基，搜集菌膜壓干，低溫研磨，加入穩(wěn)定劑，制成原液。41③半成品配置及凍干用特定的保護(hù)劑稀釋成半成品，無菌分裝到安瓿瓶內(nèi)④成品檢定鑒別試驗、外觀、溶解時間、水分、純菌試驗、無有毒分枝桿菌試驗、活菌計數(shù)、效力測定⑤疫苗規(guī)格及有效期10人份含卡介菌0.4~0.6mg，2~8℃避光保存運(yùn)輸，有效期一年。42（4）新型結(jié)核疫苗的研究方向①以BCG為載體的基因工程結(jié)核疫苗②營養(yǎng)缺陷型結(jié)核減毒活疫苗（牛型/人型）③結(jié)核亞單位疫苗④結(jié)核DNA疫苗3、鼠疫疫苗（1）概述：鼠疫是由鼠疫桿菌引起的自然疫源性烈性傳染病。主要以“鼠→蚤→人”為主要傳播方式。43（2）鼠疫桿菌的病原學(xué)①鼠疫桿菌屬腸桿菌科，耶爾森氏菌屬。革蘭染色陰性短小桿菌。有莢膜，無鞭毛，無芽胞。②抗原和免疫原性44（3）鼠疫疫苗的生產(chǎn)工藝與檢定①菌種：采用鼠疫桿菌弱毒菌株EV株②培養(yǎng)及收獲：培養(yǎng)基：厚金格爾瓊脂培養(yǎng)基（pH6.8~7.2）肉眼檢查及純菌試驗合格方可收獲。③半成品配制及凍干細(xì)菌比濁標(biāo)準(zhǔn)調(diào)整原液濃度，加凍干保護(hù)劑，分裝。④成品檢定：鑒別試驗、理化實驗、純菌試驗、特異性毒性試驗、活菌數(shù)測定、濃度測定、菌形檢查、效力測定⑤疫苗規(guī)格及效期10人份含菌8×109，2~8℃避光保存運(yùn)輸，有效期一年。45第四節(jié)類毒素疫苗一、概述類毒素是一種主動免疫制劑，用于細(xì)菌毒素性疾病的預(yù)防。461.有關(guān)毒素的幾個概念①細(xì)菌毒素：致病細(xì)菌產(chǎn)生的特異性毒性物質(zhì)②外毒素：細(xì)菌在生長過程中產(chǎn)生，可擴(kuò)散或自溶后釋放到菌體外③內(nèi)毒素：菌體細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)成分，生存時不釋放，死亡后釋放至外界④類毒素：外毒素經(jīng)處理后去除毒性但仍保留免疫原性472.細(xì)菌外毒素的特性1）毒性強(qiáng)2）親組織性3）抗原性4）雙組分結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)483.類毒素的生產(chǎn)1）產(chǎn)毒人工培養(yǎng)產(chǎn)毒細(xì)菌獲得毒素①菌種產(chǎn)毒力強(qiáng)、穩(wěn)定②產(chǎn)毒培養(yǎng)基49培養(yǎng)基應(yīng)符合下面幾個方面的要求（1）能提供產(chǎn)毒必要的成分（2）能調(diào)節(jié)影響產(chǎn)毒諸因素的平衡（3）能緩解對產(chǎn)毒有害物質(zhì)的作用（4）能保護(hù)已經(jīng)產(chǎn)生的毒素（5）不能含有對人有害或引起過敏反應(yīng)的物質(zhì)50③培養(yǎng)方法根據(jù)菌種的特性與具體的實驗來決定2）脫毒影響因素：溫度、pH、甲醛濃度、毒素3）精制適用于規(guī)?；a(chǎn)，條件溫和，避免對抗原的損傷514.毒性逆轉(zhuǎn)及其相關(guān)因素毒素類毒化后仍有毒性逆轉(zhuǎn)的可能，與毒性逆轉(zhuǎn)有關(guān)的因素有：①稀釋②脫毒條件③小分子物質(zhì)的影響52二、常用細(xì)菌類毒素疫苗1.白喉類毒素1）概述由白喉桿菌引起的急性呼吸道傳染病，產(chǎn)生外毒素引起局部炎癥及組織壞死532）白喉桿菌的病原學(xué)（1）形態(tài)及生活習(xí)性：革蘭氏陽性棒狀桿菌，需氧或兼性厭氧，抵抗力較弱（2）分型：重型、中間型、輕型，流行中的多為輕型，引起的癥狀最輕（3）白喉毒素（Diphtheriatoxin）的分子結(jié)構(gòu)及致病機(jī)制543）白喉類毒素的生產(chǎn)工藝與檢定（1）生產(chǎn)工藝①菌株：PW8或由其篩選得到②產(chǎn)毒培養(yǎng)基：氮源、能源、生長因子、無機(jī)離子③培養(yǎng)：嚴(yán)格控制雜菌污染④精制：硫酸銨、活性炭分段鹽析法或其他適宜方法⑤脫毒：甲醛脫毒后進(jìn)行脫毒檢查⑥吸附精制白喉類毒素：以Al（OH）3吸附劑為免疫佐劑55（2）白喉類毒素的檢定①鑒別試驗②外觀③化學(xué)檢定④安全試驗⑤保護(hù)力試驗562.破傷風(fēng)類毒素1）概