口腔疾病分子生物學(xué)（口腔生物學(xué)課件）

口腔疾病分子生物學(xué)分子生物學(xué)研究的主要方法分子克隆的材料與方法分子克隆的主要步驟特異核酸的檢測(cè)目的及要求熟悉分子生物學(xué)的基本實(shí)驗(yàn)掌握與基因有關(guān)的基本概念，尤其是重組DNA技術(shù)的概念和步驟分子克隆技術(shù)DNA分子的無性繁殖技術(shù)建立依賴于幾種因子的發(fā)現(xiàn)與運(yùn)用限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶、質(zhì)粒（一）限制性內(nèi)切酶是一類能識(shí)別雙鏈DNA分子中特異核苷酸序列的DNA水解酶。三種限速酶Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型Ⅱ型限制性內(nèi)切酶具有以下幾個(gè)特征特定的識(shí)別序列，4~6個(gè)堿基對(duì)在識(shí)別序列內(nèi)固定位置切割，切割后5’–端磷酸基因，

3’-端羥基基團(tuán)切割后形成粘性或平齊末端（二）DNA連接酶質(zhì)粒細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立于染色體外的環(huán)狀DNA，能自我復(fù)制其上基因可借助宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄、翻譯系統(tǒng)得以表達(dá)分子2000~50000bpTpGEM

-TVector(3003bp)AmprlacZoriXmnI1994ScaI1875NaeI2695ApaIAatIISphIBstZINcoISacIIT7SpeINotIBstZIPstISaLINdeISacIBstXINsiISP6T1start14202631374655626273758294103112126

pGEM-Tvectormap構(gòu)建質(zhì)粒的特點(diǎn)Ori區(qū)：復(fù)制起點(diǎn)Par區(qū)：保證質(zhì)粒均勻分布于子細(xì)胞多克隆區(qū)：人為構(gòu)建，便于克隆操作。含有多個(gè)單一限制性內(nèi)切酶酶切點(diǎn)。選擇因子：含特定基因，如耐抗生素基因，使克隆后便于挑選(四)噬菌體概念是侵染細(xì)菌、螺旋體、真菌等的病毒。結(jié)構(gòu)溫和噬菌體和毒性噬菌體噬菌斑是分子生物學(xué)中重要的DNA載體目前廣泛使用的噬菌體有

λ-噬菌體，M13噬菌體，（五）轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)化是指受體菌捕獲和表達(dá)質(zhì)粒載體DNA分子的生命過程。細(xì)菌種屬及細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的差異，轉(zhuǎn)化條件和過程均不一樣。感受態(tài)必須存在。即使同一菌屬中，各菌株達(dá)到感受態(tài)的的條件和時(shí)機(jī)也存在差別。氯化鈣處理大腸桿菌以提高細(xì)胞膜的通透性。轉(zhuǎn)染專指受體菌捕獲和表達(dá)噬菌體DNA分子的過程。轉(zhuǎn)導(dǎo)利用噬菌體顆粒為媒介，將外源DNA轉(zhuǎn)移至受菌體并得到表達(dá)的生命過程。分子克隆的主要步驟1.基因文庫的建立2.目的基因的篩選3.目的基因的分析分子克隆常用技術(shù)DNA電泳：可分離不同分子量的DNA基因轉(zhuǎn)移核酸雜交聚合酶鏈反應(yīng)PCR

Ladder1234567891011121314Ladder對(duì)臨床菌株的第二次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜分析

Lane1~7:臨床菌株S.sobrinus;Lane8~14:臨床菌株S.mutans.(Kb)2.01.00.250.10.750.5MW核酸雜交原理：在一定條件下（溫度、pH值等）DNA雙股螺旋可解開并分離在一定條件下，兩股游離的互補(bǔ)的核苷酸可自行配對(duì)形成雙股SouthernBlot電泳、轉(zhuǎn)移、雜交確定分子量斑點(diǎn)雜交目標(biāo)序列的存在目標(biāo)序列的量PCR與齲病相關(guān)微生物的定量檢測(cè)方法細(xì)菌形態(tài)生化反應(yīng)免疫反應(yīng)分子生物學(xué)方法----分子探針雜交----RFLP----PCR唾液在與齲病相關(guān)微生物檢測(cè)中的應(yīng)用在人類口腔中檢出率很高茸毛鏈球菌可能比變形鏈球菌與齲損活躍性之間的關(guān)系更密切變形鏈球菌和茸毛鏈球菌唾液在與齲病相關(guān)微生物檢測(cè)中的應(yīng)用抽提細(xì)菌染色體DNA(Igarashietal.1996)----細(xì)菌----唾液PCR反應(yīng)過程第一次PCR反應(yīng)

預(yù)變性:94℃4min

變性:94℃1min

退火:51℃1min30cycles

延伸:72℃2min

最后延伸:72℃5min

第二次PCR反應(yīng)唾液在與齲病相關(guān)微生物檢測(cè)中的應(yīng)用套式PCR(NestedPCR)5′

3′

TemplateOuterprimer2Outerprimer1ThefirstPCR5′

3′

Interprimer2Interprimer1NexttemplateThesecondPCR5′

3′

本套式PCR的引物是分別根據(jù)變形鏈球菌gtfB基因和茸毛鏈球菌gtfI基因設(shè)計(jì)的內(nèi)、外兩套引物（outerprimer,interprimer）gtfBgeneofS.mutansOuterprimerthp4Outerprimerthp3ThefirstPCRInterprimerthp8Interprimerthp7Outerprimerthp6gtfIgeneofS.sobrinusOuterprimerthp5ThefirstPCRInterprimerthp10Interprimerthp9ThesecondPCRThesecondPCR

Ladder123456第一次PCR的靈敏度

變形鏈球菌S.mutansIngbritt的數(shù)量

Lane1:108CFU;Lane2:107CFU;Lane3:106CFU;Lane4:105CFUMW(Kb)2.00.750.51.00.25

2.0

0.5

Ladder1234561.00.750.25MW(Kb)第二次PCR的靈敏度

變形鏈球菌S.mutansIngbritt的數(shù)量

Lane1:104CFU,Lane2:103CFU

Ladder1234567891011121314Ladder對(duì)臨床菌株的第二次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜分析

Lane1~7:臨床菌株S.sobrinus;Lane8~14:臨床菌株S.mutans.(Kb)2.01.00.250.10.750.5MW

abcdefghLadder12345678選擇外引物行第一次PCR后擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜分析以變鏈菌組(MutansStreptococci)染色體DNA為模板

Lane1:S.cricetusAHT;2.S.rattusBHT;3.S.mutansIngbritt;4.S.sobrinusOMZ176;5.S.mutansLM-7;6.S.mutansOMZ175;7.S.sobrinus6715;8.S.downeiMfe28.

MW(Kb)2.01.0

0.250.10.750.5

abcdefghLadder12345678選擇內(nèi)引物行第二次PCR后擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜分析

Lane1:S.cricetusAHT;2.S.rattusBHT;3.S.mutansIngbritt;4.S.sobrinusOMZ176;5.S.mutansLM-7:6.S.mutansOMZ175;7.S.sobrinus6715;8.S.downeiMfe28.Marker:DL2,000Ladder

MW(Kb)2.00.750.51.00.250.1

Ladder12345MW1.0(Kb)0.750.50.250.1

Ladder12345MW2.0(Kb)1.00.250.10.750.5ABLane1.chromosomalDNAfromS.mutansIngbritt;2.chromosomalDNAfromS.sobrinus6715;3.salivasamplefromsubjectA;4.salivasamplefromsubjectB;5.salivasamplefromsubjectC.利用PCR直接從唾液樣本中檢測(cè)變形鏈球菌S.mutans和茸毛鏈球菌S.sobrinus(圖A)利用外引物(圖B)利用內(nèi)引物結(jié)論套式PCR能快速在人類唾液中同時(shí)檢測(cè)變形鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌。該檢測(cè)方法有望運(yùn)用于臨床檢測(cè),對(duì)揭示兩種細(xì)菌與齲病發(fā)生關(guān)系的研究具有一定價(jià)值?？谇患膊》肿由飳W(xué)生命的主要遺傳物質(zhì)-DNADNA的復(fù)制基因表達(dá)中心法則基因表達(dá)的調(diào)節(jié)目的及要求

掌握：生命的主要遺傳物質(zhì)；DNA的復(fù)制；基因表達(dá)及其調(diào)節(jié)；中心法則。Mid-19thCentury

Mendel’sLawsofInheritance(孟德爾的遺傳法則)

1869Nuclein(核素)DeoxyribonucleicAcid-DNA(脫氧核糖核酸)ProteinRibonucleicAcid-RNA(核糖核酸)

FriedrichMiescher,1844-18951910

TheChromosomeTheory

(染色體學(xué)說)ThomasHuntMorgan,1866-1945ChromosomeGenesDNAProteinRNA???1944GenesOswaldAvery,1877-1955DNA一、生命的主要遺傳物質(zhì)----DNA（一）對(duì)遺傳物質(zhì)的認(rèn)識(shí)什么是遺傳物質(zhì)？蛋白質(zhì)20種氨基酸DNA四種堿基轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果說明……核酸的組成、分布及基本化學(xué)結(jié)構(gòu)1.高分子化合物；2.單體為核苷酸，其包括：一個(gè)磷酸分子、一個(gè)糖分子、一個(gè)堿基;3.根據(jù)核苷酸的組成又分為DNA和RNA；4.DNA與RNA的分布；5.四種堿基：A、C、G、T/UDNA與RNA的區(qū)別DNARNA糖脫氧核糖核糖堿基腺嘌呤胞嘧啶鳥嘌呤胸腺嘧啶腺嘌呤胞嘧啶鳥嘌呤尿嘧啶結(jié)構(gòu)雙鏈單鏈DNA結(jié)構(gòu)的推衍Chargaff’rules:T+C=A+G A=T G=CWatson和Crick推導(dǎo)出：

DNA是兩條鏈組成，相互平行的雙螺旋結(jié)構(gòu)DNA復(fù)制的特點(diǎn)新合成的子代DNA與親代DNA完全一樣，保證了遺傳的穩(wěn)定性。DNA的復(fù)制1.復(fù)制子：一個(gè)單獨(dú)的DNA復(fù)制單位。每一個(gè)復(fù)制子都含有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)序列，又稱復(fù)制原點(diǎn)，也常含有一個(gè)末端序列，復(fù)制的過程在此終止。復(fù)制是在起始階段控制的，一旦開始復(fù)制，就會(huì)繼續(xù)進(jìn)行下去，直到復(fù)制完成2.參與DNA復(fù)制中的酶和蛋白因子DNA多聚酶種類DNA多聚酶Ⅲ是DNA復(fù)制的主要合成酶。合成DNA還需要下列因素：DNA的前體材料，四種脫氧核苷三磷酸Mg離子的存在一小段DNA或RNA分子的3’-OH一個(gè)DNA模板DNA多聚酶的另一個(gè)重要特征是具有3’→5’方向的內(nèi)切酶功能。DNA復(fù)制的方式半保留復(fù)制半不連續(xù)復(fù)制由于DNA多聚酶只能從5’→3’方向合成DNA，因而半保留復(fù)制不能完全解釋。引導(dǎo)鏈：5’→3’方向的DNA合成滯后鏈：3’→5’方向，岡崎片段基因編碼蛋白質(zhì)或RNA等具有特定功能產(chǎn)物的遺傳信息的基本單位，是染色體或基因組的一段DNA序列(對(duì)以RNA作為遺傳信息載體的RNA病毒而言則是RNA序列)。包括編碼序列(外顯子)、編碼區(qū)前后對(duì)于基因表達(dá)具有調(diào)控功能的序列和單個(gè)編碼序列間的間隔序列(內(nèi)含子)。

基因的表達(dá)1.DNA的遺傳信息是通過蛋白質(zhì)的合成，再由蛋白質(zhì)發(fā)揮各自特定功能的表達(dá)。2.DNA的堿基順序決定蛋白質(zhì)的氨基酸順序。3.蛋白質(zhì)的合成是通過RNA來完成。RNA（單鏈）信使RNA（mRNA)核糖體RNA（rRNA)轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNA)RNA的生物合成——轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄:在RNA多聚酶作用下，以DNA為模板合成RNA的過程。由RNA多聚酶合成從DNA上特定起始序列（啟動(dòng)子）開始，至終止信號(hào)結(jié)束內(nèi)含子與外顯子轉(zhuǎn)錄的模板和方向：有意義鏈：模板鏈（3’→5’DNA鏈）反義鏈：非模板鏈2.RNA多聚酶與啟動(dòng)子

啟動(dòng)子：能特異性地與RNA多聚酶結(jié)合，引發(fā)RNA合成。從DNA上特定起始序列（啟動(dòng)子）開始，至終止信號(hào)結(jié)束3.轉(zhuǎn)錄的起始與延伸4.內(nèi)含子和外顯子的概念原核生物：基因是連續(xù)的DNA片段真核生物：基因由若干個(gè)不連續(xù)的DNA片段組成的。內(nèi)含子：插入序列，它是位于基因的內(nèi)部，能夠被轉(zhuǎn)錄的一段DNA。但在轉(zhuǎn)錄后，與之相應(yīng)的那部分轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在拼接中被去掉了。外顯子：基因中與成熟的mRNA相對(duì)應(yīng)的DNA片段，它不僅包括蛋白質(zhì)編碼的部分，而且包括5’和3’末端不翻譯的前導(dǎo)序列和尾隨序列。釉原蛋白基因表達(dá)示意圖遺傳密碼的性質(zhì)所有的密碼都是由三個(gè)連續(xù)的核苷酸組成，相鄰的兩個(gè)密碼之間沒有間隔的核苷酸存在3個(gè)終止密碼子UAA,UGA,UAG，起始密碼子：AUG密碼子具有兼并性通用性蛋白質(zhì)的生物合成——翻譯蛋白質(zhì)的生物合成——翻譯蛋白質(zhì)合成過程Ⅰ.氨基酸活化Ⅱ.蛋白質(zhì)合成的起始AUG→甲?；琢虬彼幔╢Met)III.肽鏈的延伸IV.蛋白質(zhì)合成的終止終止碼UAA、UGA、UAG蛋白質(zhì)的生物合成——翻譯新生多肽的加工Ⅰ.fMet水解Ⅱ.磷酸化、糖基化、甲基化修飾Ⅲ.信號(hào)肽蛋白質(zhì)向細(xì)胞外分泌基因表達(dá)DNA→RNA→蛋白質(zhì)豐富的生命現(xiàn)象中心法則DNA

RNA蛋白質(zhì)

子代結(jié)構(gòu)蛋白、酶等生物多樣化

轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄翻譯DNA復(fù)制基因表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)體的每一個(gè)細(xì)胞都有一套完全相同的基因共同表達(dá)的基因：維持細(xì)胞基本結(jié)構(gòu)、功能特異性表達(dá)的基因：

紅細(xì)胞產(chǎn)生血紅蛋白B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體、成牙本質(zhì)細(xì)胞分泌牙本質(zhì)蛋白基因表達(dá)調(diào)控的原因動(dòng)力細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞間，或細(xì)胞與外界環(huán)境間關(guān)系的變化調(diào)節(jié)基因，結(jié)構(gòu)基因基因表達(dá)調(diào)節(jié)的方式啟動(dòng)子強(qiáng)啟動(dòng)子與RNA多聚酶有較強(qiáng)的結(jié)合能力，轉(zhuǎn)錄水平較高；弱啟動(dòng)子則反之。調(diào)節(jié)蛋白的作用—負(fù)調(diào)控：乳糖操縱子—正調(diào)控：阿拉伯糖縱子乳糖操縱子學(xué)說Britten-Davidson模型里頓-戴維遜（Britten-Davidson）協(xié)同調(diào)節(jié)模型1969年提出，1973年補(bǔ)充，1979年修改。該模型認(rèn)為在個(gè)體發(fā)育期，許多基因被協(xié)同調(diào)控，而重復(fù)序列在調(diào)控中具有重要的作用。設(shè)想不連鎖基因發(fā)生協(xié)同誘導(dǎo)是通過結(jié)構(gòu)基因以外的三個(gè)遺傳因子參與作用。

牙發(fā)生的分子機(jī)制原發(fā)性上皮帶發(fā)生前庭板（vestibularlamina）

牙板（dentallamina）

外胚間葉

成釉器＋牙乳頭＋牙囊＝釉質(zhì)牙本質(zhì)牙髓牙骨質(zhì)、牙周膜牙槽骨早期牙發(fā)育上皮間充質(zhì)相互作用中homeoboxgene和生長因子的表達(dá)(http://honeybee.helsinki.fi/toothexp)PrimaryepithelialbandEctomesenchymeIncisorCanineMolarMsx-1andMsx-2Msx-1,Msx-2,Dlx-2Barx-1andDlx-2

Msx-1Msx-2Dlx-2Barx-1根據(jù)小鼠下頜牙槽嵴區(qū)間充質(zhì)基因表達(dá)所推斷的人牙模式發(fā)生的相關(guān)調(diào)控基因一、釉質(zhì)形成的分子機(jī)制（一）釉質(zhì)的發(fā)育分期成釉器發(fā)育到鐘狀期后，牙體組織便進(jìn)入形成階段。這時(shí)，在將來的牙尖部位依次發(fā)生如下變化：①前成秞細(xì)胞的分化②前成牙本質(zhì)細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化③牙本質(zhì)的形成④成秞細(xì)胞的分化⑤釉質(zhì)的形成牙本質(zhì)開始形成時(shí)，介于成牙本質(zhì)細(xì)胞和成秞細(xì)胞間的基板開始破裂，一旦牙本質(zhì)發(fā)生礦化，成秞細(xì)胞就開始并分泌釉基質(zhì)。釉質(zhì)的發(fā)生與成熟可分為釉質(zhì)分泌期——形態(tài)發(fā)生釉質(zhì)成熟期——釉質(zhì)礦化啟動(dòng)礦化牙本質(zhì)涎磷蛋白、釉叢蛋白結(jié)合礦化離子釉原蛋白、釉蛋白控制晶體生長速度釉原蛋白、釉蛋白、成釉蛋白決定釉柱結(jié)構(gòu)成釉蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)釉叢蛋白控制分泌有機(jī)基質(zhì)的降解產(chǎn)物保護(hù)礦化相

釉原蛋白、釉蛋白釉質(zhì)蛋白與釉質(zhì)發(fā)育各階段種類基因特點(diǎn)致病釉原蛋白AMEL（牙特有）分子量小含量最多釉質(zhì)發(fā)育不全釉蛋白ENAM（牙特有）最早分泌釉質(zhì)發(fā)育不全成釉蛋白AMBN可在成釉細(xì)胞瘤表達(dá)釉從蛋白TUFT表達(dá)短暫釉質(zhì)礦化結(jié)構(gòu)起作用蛋白水解酶MMP20KLLK4釉原蛋白加工酶降解釉質(zhì)蛋白釉質(zhì)