第八章分子生物學研究方法下模板

一、原位雜交技術

原位雜交（Insituhybridization,ISH)

是用標記的DNA或RNA為探針，經(jīng)放射自顯影或非放射檢測體系，在組織、細胞、間期核及染色體上對核酸進行定位和相對定量研究的一種手段。通?？煞譃镽NA原位雜交和染色體原位雜交。第八章分子生物學研究方法(下)11/2/20241RNA原位雜交：

用放射性或非放射性標記的特異性探針與被固定的組織切片反應，若細胞中存在與探針互補的mRNA分子，兩者雜交產(chǎn)生雙鏈RNA，就可通過檢測放射性標記或經(jīng)酶促免疫顯色，對該基因的表達產(chǎn)物在細胞水平上做出定性定量分析。11/2/2024211/2/20243染色體原位雜交技術是DNA探針與染色體上的DNA雜交，并在染色體上直接進行檢測的分子標記技術。目前發(fā)展最快的是熒光素標記的原位DNA雜交技術，即熒光原位雜交技術（fluorescenceinsituhybridization,簡稱FISH技術），是利用與熒光素分子偶聯(lián)的單克隆抗體與抗原標記的探針分子特異性的結合來檢測DNA序列在染色體上的位置。染色體原位雜交11/2/20244染色體專一位點探針11/2/2024511/2/202461、酵母單雜交法轉錄因子cDNA酵母轉錄激活域酵母細胞表達載體導入轉錄因子表達順式作用元件啟動子報告基因報告基因是否表達？二、蛋白質及RNA相互作用技術11/2/202472、酵母雙雜交系統(tǒng)轉錄激活因子DNA結合結構域轉錄激活結構域(bindingdomain,BD)(Activationdomain,AD)11/2/20248

將編碼已知蛋白的DNA序列連接到能夠表達轉錄因子DNA結構域的載體上，使之表達融合蛋白。靶蛋白DNA結合蛋白報告基因啟動子DNA結合蛋白誘餌11/2/20249編碼轉錄激活域的DNA待篩選cDNA文庫片段獵物

獵物與誘餌共同在酵母細胞中表達，假如獵物載體中表達的蛋白有與靶蛋白作用的蛋白，這時轉錄因子的結構域與激活域就會靠攏，激活報告基因表達。

總之，通過判斷報告基因是否表達，來分離與已知蛋白作用的新基因。10三、RNA干擾技術(RNAinterference，RNAi)

RNA干擾(RNAinterference，RNAi)技術利用雙鏈小RNA高效、特異性降解細胞內同源mRNA，從而阻斷體內靶基因表達，使細胞出現(xiàn)靶基因缺失的表型。11/2/202411放大作用DICER：核酸酶RNA誘導的沉默復合體（RNAinduciblesilentcomplex：

RISC)阻斷靶基因表達11/2/202412RNAi的生物學功能：

RNAi的本質是一種由RNA介導的序列特異性的獲得性免疫反應，是一種原始的基因組對抗外來基因表達的保護機制，是生物體在基因組水平上的免疫系統(tǒng)。11/2/202413線蟲體內的RNAi

線蟲中RNAi效應的檢測（左面）兩條線蟲表現(xiàn)為綠色熒光蛋白（GFP）表達類型品系，該品系含有一個普遍性表達的GFP報告基因重組質粒（帶有核內定位信號位點）。（右面）喂食表達爭對GFP的dsRNA的細菌后，整個蟲體的GFP信號消失。11/2/202414四、

基因芯片及數(shù)據(jù)分析

DNA芯片(DNAchip)，又稱DNA微列陣(DNAmicroarray)，是指通過微電子、微加工技術在平方厘米大小的固體介質表面構建的微型分析系統(tǒng)，以實現(xiàn)對組織細胞中DNA、蛋白質和其他生物成分的快速、高效、敏感的處理與分析。1、基因芯片技術原理11/2/202415基因芯片的制作原理11/2/2024162、基因芯片的主要制作過程:1、經(jīng)大規(guī)模PCR擴增獲得獨立cDNA插入片段；2、用機械手將PCR產(chǎn)物點到玻璃片了，變性固定；3、分別從不同組織或器官中分離mRNA，反轉錄生成cDNA；4、分別用兩種不同的熒光染料標記兩種cDNA；5、將標記后的cDNA與點好的芯片進行雜交；6、激光掃描芯片雜交結果，計算機處理；7、分析雜交數(shù)據(jù)。11/2/202417按基因芯片點陣的制備方法，基因芯片可以分為：原位合成芯片（syntheticgenechip）適用于寡核苷酸。根據(jù)預先設計的點陣序列在每個位點通過有機合成的方式直接聚合得到所要求的探針分子。DNA微陣列芯片（DNAmicroarray）多用于大片段DNA，有時也用于寡核苷酸，甚至mRNA。將合成好的探針、cDNA、基因組通過特定的高速點樣機器人直接點在芯片上。11/2/202418根據(jù)基因芯片的用途可分為:基因表達分析芯片基因多態(tài)性分析芯片疾病診斷芯片發(fā)現(xiàn)新基因疾病診斷11/2/2024193、基因芯片數(shù)據(jù)分析11/2/2024201、凝膠滯緩實驗電泳遷移率變動實驗（electrophoreticmobilityshiftassay,EMSA)又叫凝膠阻滯試驗(gelretardationassay)，是在體外研究DNA與蛋白質相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術。它具有簡單、快捷等優(yōu)點，也是當前被選作分離純化特定DNA結合蛋白質的一種典型的實驗方法。

原理：DNA與蛋白的結合導致了電泳時遷移率的降低。五、其他分子生物學技術11/2/202421凝膠阻滯實驗的基本原理圖放射性標記的DNA由于同一種細胞蛋白質B結合，于是在凝膠電泳中移動速度變慢，在放射自顯影中呈現(xiàn)滯后的條帶ACB放射自顯影****凝膠電泳放射性標記的DNA細胞蛋白質提取物蛋白質與DNA結合******BDNA-蛋白質結合物電泳遷移緩慢滯后帶表明DNA與蛋白質結合用來判斷是否存在與該DNA結合的蛋白。222、噬菌體展示技術噬菌體展示技術的原理：將編碼“誘餌”的DNA片段插入到噬菌體基因組，并使之與噬菌體外殼蛋白編碼基因融合。該重組噬菌體侵染宿主細菌后，復制形成大量帶有外殼蛋白的