pH漸變條件下多酶分步連續(xù)酶解工藝制備鱘魚硫酸軟骨素與膠原蛋白肽

艸艸艸艸艸艸艸艸生物技術(shù)進(jìn)展生物技術(shù)進(jìn)展2023年第13卷第6期934~939CurrentBiotechnologyISSN2095?2341艸艸艸艸艸艸艸艸艸艸艸艸pH漸變條件下多酶分步連續(xù)酶解工藝制備鱘魚硫酸軟骨素與膠原蛋白肽王珍瑜1，陸文超1，鐘康榮2，關(guān)永健2，汪真2，陳超1*1.清華大學(xué)化學(xué)系，北京100084；2.貴州千鱘生物科技有限公司，貴州黔東南苗族侗族自治州556300摘要：pH漸變條件下采用堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶分步連續(xù)酶解鱘魚軟骨，同時(shí)制備鱘魚硫酸軟骨素和膠原蛋白肽。分別通過溫度、酶解時(shí)間、酶用量3個(gè)單因素實(shí)驗(yàn)，研究其對(duì)連續(xù)酶解效果的影響。綜合分析得出最佳條酶用量為50U·g-1底物；菠蘿蛋白酶的酶解溫度為50℃,酶解時(shí)間為2h，酶用量為30U·g-1底物。該工藝條件下制備的鱘魚硫酸軟骨素提取率為85%，純度93%，膠原蛋白肽的提取率為82%，純度為90%。研究建立的pH漸變條件下多酶分步連續(xù)酶解工藝，產(chǎn)率與純度較國內(nèi)現(xiàn)有生產(chǎn)方法均有提高，且堿液使用量減少，避免了有機(jī)溶劑的引入，從而可以降低生產(chǎn)成本，減輕環(huán)境污染負(fù)擔(dān)。中圖分類號(hào)：Q556，TQ925+.2文獻(xiàn)標(biāo)byMulti-enzymeStep-by-stepEnzymaticHydrolysisUndertheConditionofpHGradientWANGZhenyu1，LUWenchao1，ZHONGKangrong2，GUANYongjian2，WANGZhen2，CHENChao1*dosagewas100U·g-1andenzymedosagewas30U·g-1基金項(xiàng)目：清華大學(xué)國強(qiáng)研究院項(xiàng)目。 王珍瑜，等：pH漸變條件下多酶分步連續(xù)酶解工藝制備鱘魚硫酸軟骨素與膠原蛋白肽935鱘魚，又名鱘龍，隸屬于硬骨魚綱輻鰭亞綱硬鱗總目鱘形目，是地球上最原始和最古老的軟骨魚種之一，也是淡水魚中壽命最長、個(gè)體最大的魚類［1］。近年來，我國開展了鱘魚養(yǎng)殖，目前，我國已成為世界鱘魚養(yǎng)殖第一大國，其中史氏鱘頭、脊索、鰭中軟骨占魚體質(zhì)量的10％左右。軟骨中含有豐富的硫酸軟骨素和膠原蛋白，具有很高的營養(yǎng)價(jià)值和較強(qiáng)的保健功能，素有“鯊魚性粘多糖，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，主要以與蛋白質(zhì)結(jié)合的蛋白聚糖形式存在［4-5］。硫酸軟骨素作為一種天然的活性成分在醫(yī)藥領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景［6-7探索并開發(fā)硫酸軟骨素具有重要的經(jīng)濟(jì)與社會(huì)價(jià)值［8-10］。波法、乙酸抽提法和酶解法等［11-12］。常用的硫酸軟骨素提取方法一般需要使用大量的堿液和有機(jī)溶劑，提取率相對(duì)也比較低。Ⅱ型膠原蛋白是鱘魚軟骨中的主要蛋白，其由3個(gè)分子量約為110kD的α鏈組成。鱘魚軟骨中的膠原蛋白也具有一定的營養(yǎng)價(jià)值，但由于其分子量太大且具有三螺旋結(jié)構(gòu)，不易被快速消化吸收，其功效與價(jià)值很難被化吸收率會(huì)得到明顯提高［13］。近年來，研究者也加大了對(duì)膠原蛋白肽的提取、分離、純化工藝的研究［14-16進(jìn)而對(duì)其生理作用進(jìn)行探究［17-18］。本研究在pH漸變條件下用多酶連續(xù)分步酶解工藝，采用單因素試驗(yàn)法考察了酶用量、酶解時(shí)間、酶解溫度3個(gè)因素對(duì)酶解效果的影響。酶解后利用超濾分離即可得到純度較高的硫酸軟骨素和膠原蛋白肽，期望為今后用鱘魚軟骨生產(chǎn)硫酸軟骨素和膠原蛋白肽提供了工藝依據(jù)。1材料與方法供；木瓜蛋白酶240U·mg-1、堿性蛋白酶100U·mg-1、菠蘿蛋白酶100U·mg-1均購自南寧東恒華道生物科技有限責(zé)任公司；硫酸軟骨素標(biāo)準(zhǔn)品購自上海阿拉丁生化科技有限公司；鹽酸氨基葡萄糖對(duì)照品購自Sigma公司；對(duì)二甲氨基苯甲醛、乙酰丙島津LC-16液相色譜儀；PL203型電子天平（梅特勒-托利儀器（上海）有限公司島津UV-2600i紫外分光光度計(jì)；TYM-8電熱恒溫水浴鍋（中國濟(jì)南天宇專用設(shè)備有限公司高速粉碎機(jī)（TP-1000C-8，寧波新芝生物科技股份有限公司臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（TGL-16M，長沙易達(dá)儀器有限公司真空冷凍干燥機(jī)（FD-5，上海能共實(shí)業(yè)有限公司）。骨上殘留的肌肉、脂肪和其他結(jié)締組織，用絞碎，放入水中攪拌，然后過篩清洗，以除1.2.2酶解法提取硫酸軟骨素與膠原蛋白肽鱘魚軟骨稱重，加軟骨5倍重量的去離子水，用膠體至25℃,加碳酸鈉調(diào)pH至8.5。先加入堿性蛋白酶，控溫酶解一段時(shí)間（按單因素實(shí)驗(yàn)梯度設(shè)置進(jìn)單因素實(shí)驗(yàn)梯度設(shè)置進(jìn)行然后加入菠蘿蛋白酶，控溫酶解一段時(shí)間（按單因素實(shí)驗(yàn)梯度設(shè)置進(jìn)的中空纖維膜超濾，截留部分冷凍干燥后得到鱘魚硫酸軟骨素，透過液冷凍干燥后得到膠原蛋白式中，Y為提取率，C1為產(chǎn)物中目標(biāo)物的含為原料質(zhì)量。1.2.3單因素實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)條件和梯度范圍對(duì)酶解溫度、酶解時(shí)間和酶用量分別進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，堿55、60℃);堿性蛋白酶酶解時(shí)間選取6個(gè)水平·g-1木瓜蛋白酶936生物技術(shù)進(jìn)展CurrentBiotechnology93670、80U·g-1菠蘿蛋白酶酶解溫度選取6個(gè)水平);菠蘿蛋白酶酶解時(shí)間·g-11.2.4硫酸軟骨素含量檢測硫酸軟骨素含量參照GB/T20365-2006硫酸軟骨素和鹽酸氨基葡萄糖含量的測定方法并采用液相色譜法進(jìn)行含量測定。色譜柱：C18（250mm×4.6nm，5μm流動(dòng)等度洗脫，流速0.8mL·min-1，檢測波長為192nm，柱溫為30℃,進(jìn)樣量為10μL。1.2.5膠原蛋白肽含量檢測膠原蛋白肽含量檢測參照GB/T5009.5-2003中的方法測定。蛋白質(zhì)的換算系數(shù)為6.25。稱取充分混勻的固體試樣0.2~2.0g（約當(dāng)于30~40mg氮精確至0.001g，至消化管中，再加入0.4g硫酸銅、6g硫酸鉀及20mL硫酸于消化爐進(jìn)行消化。當(dāng)消化爐溫度達(dá)到420℃之后，繼續(xù)消化1h，此時(shí)消化管中的液體呈綠色透明狀，取出冷卻后加入50mL水，于自動(dòng)凱氏定氮儀（使用前加入氫氧化鈉溶液，鹽酸或硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液以及含有混合指示劑A或B的硼酸溶液）上實(shí)現(xiàn)自動(dòng)1.2.6蛋白分子量范圍檢測蛋白分子量范圍檢測按GB31645-2018附錄A方法檢測。色譜柱：TSKgelG2000SWXL（300mm×7.8nm流動(dòng)相：乙度洗脫，流速0.5mL·min-1，檢測波長為1220nm，柱溫為30℃,進(jìn)樣量為10μL。2結(jié)果與分析2.1堿性蛋白酶酶解條件的單因素實(shí)驗(yàn)分析2.1.1酶解溫度對(duì)酶解效果的影響在堿性蛋白酶用量為200U·g-1底物，酶解時(shí)間為6h，以酶解后的蛋白分子量范圍為指標(biāo)，考察酶解溫度對(duì)酶解效果的影響，結(jié)果如圖1所示。升高溫度有利于酶解，當(dāng)溫度為45℃時(shí)酶解效果最好，溫度繼續(xù)增加對(duì)酶解效果的改善有限，因此，綜合考慮選取酶解溫度45℃進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。2.1.2酶解時(shí)間對(duì)酶解效果的影響在堿性蛋白酶用量為200U·g-1底物，酶解溫度為45℃,以酶解后的蛋白分子量范圍為指標(biāo)，考察酶解時(shí)間對(duì)酶解效果的影響，結(jié)果如圖2所示。當(dāng)酶解時(shí)間超分子量小于10000Da蛋白占比/%圖1酶解溫度對(duì)堿性蛋白酶酶解效果的影響圖2酶解時(shí)間對(duì)堿性蛋白酶酶解效果的影響2.1.3酶用量對(duì)酶解效果的影響在酶解溫度為45℃,酶解時(shí)間為2h，以酶解后的蛋白分子量分布為指標(biāo)，考察堿性蛋白酶用量對(duì)酶解效果的影響，其結(jié)果如圖3所示。酶用量在100U·g-1以下時(shí)，隨著酶用量的增大，酶解效果逐漸提高，之后分子量小于10000Da蛋白占比/%4005010015酶用量/(U·g)圖3酶用量對(duì)堿性蛋白酶酶解效果的影響 王珍瑜，等：pH漸變條件下多酶分步連續(xù)酶解工藝制備鱘魚硫酸軟骨素與膠原蛋白肽937再增大酶用量對(duì)酶解效果影響很小。綜合考慮，選擇酶用量為100U·g-1作為最佳酶用量條件。2.2木瓜蛋白酶酶解條件的單因素實(shí)驗(yàn)分析以堿性蛋白酶酶解后（酶用量100U·g-1底物，通過改變酶解溫度、酶解時(shí)間和酶用量3個(gè)單因素來研究木瓜蛋白酶酶解條件對(duì)酶解效果的影響。2.2.1酶解溫度對(duì)酶解效果的影響在木瓜蛋白酶用量為50U·g-1底物，酶解時(shí)間為6h，以酶解后的蛋白分子量分布為指標(biāo)，考察酶解溫度對(duì)酶解效果的影響，其結(jié)果如圖4所示。隨著溫度的增加，酶解效率呈先增大后減小的趨勢，當(dāng)溫度達(dá)到進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。分子量小于10000Da蛋白占比/%圖4酶解溫度對(duì)木瓜蛋白酶酶解效果的影響2.2.2酶解時(shí)間對(duì)酶解效果的影響在木瓜蛋白酶用量為50U·g-1底物，酶解溫度為50℃,以酶解后的蛋白分子量分布為指標(biāo)，考察酶解時(shí)間對(duì)酶解效果的影響，其結(jié)果如圖5所示。當(dāng)酶解時(shí)間為2h比達(dá)到79%，隨著時(shí)間的增加，結(jié)果在79%上下浮2.2.3酶用量對(duì)酶解效果的影響在酶解溫度為50℃,酶解時(shí)間為2h，以酶解后的蛋白分子量分布為指標(biāo)，考察木瓜蛋白酶用量對(duì)酶解效果的影響，結(jié)果如圖6所示。當(dāng)酶用量達(dá)到50U·g-1，再增加酶的用量對(duì)酶解效果的提高很小，因此選擇酶用量為50U·g-1作為最佳酶用量條件。分子量小于10000Da蛋白占比/%858580757065602030405060708090酶用量/(U·g)圖6酶用量對(duì)木瓜蛋白酶酶解效果的影響2.3菠蘿蛋白酶酶解條件對(duì)酶解效果的影響以堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解后（堿性蛋白酶用量100U·g-1底物，酶解時(shí)間2h，酶解溫度45℃;木瓜蛋白酶用量50U·g-1底物，酶解時(shí)間2h，酶解溫度50℃)的液體為原料，分別通過改變酶解溫度、酶解時(shí)間和酶用量3個(gè)單因素來研究菠蘿蛋白酶酶解條件對(duì)酶解效果的影響。2.3.1酶解溫度對(duì)酶解效果的影響在菠蘿蛋白酶用量為30U·g-1底物，酶解時(shí)間為6h，以酶解后的蛋白分子量分布為指標(biāo)，考察酶解溫度對(duì)酶解效果的影響，其結(jié)果如圖7所示。隨著溫度的增加，酶解效率呈先增大后減小的趨勢，當(dāng)溫度達(dá)到8585807570656001234567時(shí)間/h圖5酶解時(shí)間對(duì)木瓜蛋白酶酶解效果的影響分子量小于10000Da蛋白占比/%圖7酶解溫度對(duì)菠蘿蛋白酶酶解效果的影響938生物技術(shù)進(jìn)展CurrentBiotechnology9382.3.2酶解時(shí)間對(duì)酶解效果的影響在菠蘿蛋白酶用量為30U·g-1底物，酶解溫度為50℃,以酶解后的蛋白分子量分布為指標(biāo)，考察酶解時(shí)間對(duì)酶解效果的影響，結(jié)果如圖8所示。隨著酶解時(shí)間的延長，酶解效果總體上呈升高的趨勢，考慮到2h與6h時(shí)的效果僅相差2%，綜合考慮后選擇酶解時(shí)間為2h進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。分子量小于10000Da蛋白占比/%90908886848280時(shí)間/h圖8酶解時(shí)間對(duì)菠蘿蛋白酶酶解效果的影響2.3.3酶用量對(duì)酶解效果的影響在酶解溫度為50℃,酶解時(shí)間為2h，以酶解后的蛋白分子量分布為指標(biāo)，考察菠蘿蛋白酶用量對(duì)酶解效果的影響，結(jié)果如圖9所示。當(dāng)酶用量為30U·g-1時(shí)，酶解效果最好，分子量小于10000Da的蛋白占比達(dá)到89%，隨著酶用量的增加，酶解效果變化不明顯，因此，選擇酶用量以30U·g-1作為最佳條件。分子量小于10000Da蛋白占比/%酶用量/(U·g)圖9酶用量對(duì)菠蘿蛋白酶酶解效果的影響綜合考慮單因素實(shí)驗(yàn)得到的最佳工藝參數(shù)及操作的可行性，確定連續(xù)分步酶解工藝制備硫酸軟骨素與膠原蛋白肽的最佳工藝參數(shù)為：堿性蛋白酶用量為100U·g-1底物，酶解溫度45℃,酶解時(shí)間2h；木瓜蛋白酶用量為50U·g-1底物，酶解溫度50℃,酶解時(shí)間2h；菠蘿蛋白酶用量為30U·g-1底物，酶解溫度50℃,酶解時(shí)間2h。最佳條件下制備的鱘魚硫酸軟骨素的提取率為85%，純度93%，膠原蛋白肽的提取率為82%，純度為90%。3討論本研究以養(yǎng)殖鱘魚軟骨為原料，用pH漸變條件下多酶連續(xù)分步酶解工藝，可實(shí)現(xiàn)同時(shí)制備高純度的鱘魚硫酸軟骨素與膠原蛋白肽。最佳條件下制備的鱘魚硫酸軟骨素的提取率為85%，純度93%，膠原蛋白肽的提取率為82%，純度為90%。鱘魚軟骨中含有豐富的硫酸軟骨素和膠原蛋白，具有很高的應(yīng)用價(jià)值。傳統(tǒng)方法提取硫酸軟骨素一般需采用大量的堿液和有機(jī)溶劑，提取率相對(duì)較低。因此，對(duì)現(xiàn)有方法進(jìn)行改良十分必要。周暢等［19］利用響應(yīng)面方法優(yōu)化鰩魚硫酸軟骨素提純工藝，結(jié)果表明，最優(yōu)提取工藝為堿液濃度骨素提取率為43.32%。與之相比，本文制備的鱘魚硫酸軟骨素的提取率為85%，純度93%，本工藝大大提高了硫酸軟骨素的提取率。胡藝等［20］通過酸溶-胃蛋白酶從鱘魚軟骨中提取的膠原蛋白，相對(duì)于加入NaOH浸泡去除非膠原成分、滅酶活以及加入冰醋酸透析，本文則減少了堿液使用量、且不需要有機(jī)溶劑的參與。綜上，本試驗(yàn)為鱘魚養(yǎng)殖及其副產(chǎn)物的加工提供了一條新的路徑，與現(xiàn)有生產(chǎn)工藝相比，操作簡單，減少了堿液使用量且不需要有機(jī)溶劑