乙型肝炎病毒核苷-酸類似物耐藥的檢測課件

乙型肝炎病毒核苷-酸類似物耐藥的檢測乙型肝炎病毒核苷(酸)類似物耐藥的監(jiān)測

乙型肝炎病毒核苷-酸類似物耐藥的檢測一、HBV耐藥的有關(guān)定義二、各種耐藥檢測技術(shù)的評價(jià)三、需要重視的幾個(gè)問題乙型肝炎病毒核苷-酸類似物耐藥的檢測一、HBV耐藥的有關(guān)定義

病毒學(xué)突破（virologicbreakthrough）病毒反跳（viralrebound）生化學(xué)突破（biochemicalbreakthrough）HBV基因型耐藥（genotypicresistance）HBV表型耐藥（phenotypicresistance）臨床耐藥（clinicalresistance）乙型肝炎病毒核苷-酸類似物耐藥的檢測HBV耐藥的有關(guān)定義

病毒學(xué)突破（virologicbreakthrough）指在核苷類藥物治療過程中，患者的血清HBVDNA水平一度被抑制，但在繼續(xù)治療中血清HBVDNA水平與最低值相比上升或超過1個(gè)log10（10倍）。乙型肝炎病毒核苷-酸類似物耐藥的檢測HBV耐藥的有關(guān)定義

病毒反跳（viralrebound）指核苷類藥物治療過程中患者的血清HBVDNA水平一度被抑制，但在繼續(xù)治療中血清HBVDNA升高至＞2×104IU/mL或高于治療前水平。

乙型肝炎病毒核苷-酸類似物耐藥的檢測HBV耐藥的有關(guān)定義

生化學(xué)突破（biochemicalbreakthrough）指在核苷類藥物治療過程中血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）水平一度復(fù)常，但在繼續(xù)治療中血清ALT水平又再次升高。肝臟生活指標(biāo)很多，但是在此僅指ALT。乙型肝炎病毒核苷-酸類似物耐藥的檢測HBV耐藥的有關(guān)定義

HBV基因型耐藥（genotypicresistance）指HBV基因組中的某些位點(diǎn)發(fā)生改變，導(dǎo)致這種藥物對HBV的抑制作用下降或消失。這種HBV基因變異與HBV的耐藥性有直接因果關(guān)系，通過這些變異位點(diǎn)的檢測可判斷HBV有無耐藥性。乙型肝炎病毒核苷-酸類似物耐藥的檢測HBV耐藥的有關(guān)定義

HBV表型耐藥（phenotypicresistance）通過體外細(xì)胞培養(yǎng)方法，直接測定HBV對某種藥物的敏感性，或者在體外直接測定HBV聚合酶的活性，敏感性的降低或酶活性的下降均表明有耐藥，即表型耐藥。通常以IC50來評估

IC50＜5倍:敏感

IC50在5～10倍:部分耐藥

IC50

＞10倍:耐藥乙型肝炎病毒核苷-酸類似物耐藥的檢測HBV耐藥的有關(guān)定義

臨床耐藥（clinicalresistance）指臨床出現(xiàn)病毒復(fù)制不能被抑制，或HBV復(fù)制一度被抑制后又出現(xiàn)HBVDNA反跳，同時(shí)伴有ALT升高，或肝炎復(fù)發(fā)的其他臨床證據(jù)。乙型肝炎病毒核苷-酸類似物耐藥的檢測二、各種耐藥檢測技術(shù)及評價(jià)病毒學(xué)反跳或突破的監(jiān)測HBV基因型耐藥監(jiān)測HBV表型耐藥檢測臨床耐藥監(jiān)測乙型肝炎病毒核苷-酸類似物耐藥的檢測病毒學(xué)反跳或突破的監(jiān)測基于對血清HBVDNA載量的動(dòng)態(tài)監(jiān)測需重視以下三點(diǎn)：

1.HBVDNA載量檢測手段的敏感性

2.檢測技術(shù)的可靠性和穩(wěn)定性

3.監(jiān)測的間隔時(shí)間乙型肝炎病毒核苷-酸類似物耐藥的檢測HBV基因型耐藥監(jiān)測時(shí)機(jī)非必須不主張常規(guī)、廣泛應(yīng)用乙型肝炎病毒核苷-酸類似物耐藥的檢測基因型耐藥相關(guān)變異的命名乙型肝炎病毒核苷-酸類似物耐藥的檢測基因型耐藥相關(guān)變異

在HBV多聚酶序列中的位置乙型肝炎病毒核苷-酸類似物耐藥的檢測HBV基因型耐藥的主要技術(shù)堿基序列分析法直接測序克隆測序聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)及限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)(PCR-RFLP)反向雜交分析技術(shù)（INNO—LiPA）基因芯片技術(shù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)探針定點(diǎn)突變PCR技術(shù)引物末端堿基定點(diǎn)突變擴(kuò)增技術(shù)熔解曲線法基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOFMS)乙型肝炎病毒核苷-酸類似物耐藥的檢測直接測序法末端終止法化學(xué)裂解法DNA測序自動(dòng)化使用特異性引物與單鏈模板DNA退火，在DNA聚合酶作用下進(jìn)行延伸反應(yīng)，用ddNTP終止，用PAGE區(qū)分長度僅相差1個(gè)核苷酸的ssDNA，從而完成測序的方法。用化學(xué)試劑在A、G、C、T處特定的裂解DNA片段，產(chǎn)生一簇各種長度的短鏈，經(jīng)過PAGE放射自顯影可直讀DNA順序。類似末端終止法，所不同的是用熒光染料標(biāo)記，計(jì)算機(jī)自動(dòng)讀出。優(yōu)點(diǎn)簡便、迅速、應(yīng)用廣泛。不需酶促反應(yīng)，可以對寡核苷酸測序。①簡便、快速、準(zhǔn)確可靠。②安全、無放射性污染。③模板用量大大減少。④測序能力增強(qiáng)。乙型肝炎病毒核苷-酸類似物耐藥的檢測HBVYMDD變異直接測序結(jié)果圖譜乙型肝炎病毒核苷-酸類似物耐藥的檢測直接DNA測序的局限性1.

設(shè)備貴、技術(shù)高、耗材、費(fèi)時(shí)。2.必須有充足目的基因片段。3.突變株比例小于20%時(shí)，由于競爭抑制作用不能被擴(kuò)增。直接測序法檢測HBVYMDD變異1.JPG乙型肝炎病毒核苷-酸類似物耐藥的檢測克隆測序法乙型肝炎病毒核苷-酸類似物耐藥的檢測克隆測序法優(yōu)點(diǎn)：

1.有助于發(fā)現(xiàn)混合株并可大致確定不同序列毒株之間的相對比。

2.提高了檢測的靈敏度。局限性：

1.技術(shù)難度較高。

2.檢測周期更長。

3.檢測的費(fèi)用大大增加。乙型肝炎病毒核苷-酸類似物耐藥的檢測

堿基變異可能導(dǎo)致：①原有位點(diǎn)消失②產(chǎn)生新的位點(diǎn)③識(shí)別位點(diǎn)移位

利用錯(cuò)配引物使PCR產(chǎn)物中產(chǎn)生特異的酶切位點(diǎn)結(jié)果:酶切片段長、短變化和多、少變化聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)及限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)(PCR-RFLP)乙型肝炎病毒核苷-酸類似物耐藥的檢測限制性內(nèi)切核酸酶的作用它們能識(shí)別DNA的特異序列，并在識(shí)別序列內(nèi)或其旁切割雙鏈DNA。如：NdeI限制酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)：CA

TATGGTATACNlaIll限制酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)：CATGNNNGTACNNN乙型肝炎病毒核苷-酸類似物耐藥的檢測PCR-RFLP檢測HBVYMDD變異PCR錯(cuò)配引物設(shè)計(jì)乙型肝炎病毒核苷-酸類似物耐藥的檢測PCR-RFLP檢測HBVYMDD變異乙型肝炎病毒核苷-酸類似物耐藥的檢測PCR-RFLP檢測HBVYMDD變異乙型肝炎病毒核苷-酸類似物耐藥的檢測PCR-RFLP技術(shù)的評價(jià)優(yōu)點(diǎn)：簡單、廣泛易開展。缺點(diǎn)：

1.限制性內(nèi)切酶種類有限。

2.錯(cuò)配引物將導(dǎo)致退火溫度降低、非特異條帶增多。

3.引物非完全匹配，可能導(dǎo)致擴(kuò)增效率降低、檢測敏感的下降。

乙型肝炎病毒核苷-酸類似物耐藥的檢測反向雜交分析技術(shù)（INNO—LiPA）乙型肝炎病毒核苷-酸類似物耐藥的檢測INNO—LiPA診斷HBVYMDD變異乙型肝炎病毒核苷-酸類似物耐藥的檢測DNA芯片技術(shù)BiologicalSampleAnalyzedataScannermicroarray“Hybridize”arrayerMicroarrayfabricationSamplepreparationMolecularhybridizationDetectionandanalysis乙型肝炎病毒核苷-酸類似物耐藥的檢測DNA芯片技術(shù)診斷HBVYMDD變異DetectionofYMDDMotifMutantsbyOligonucleotideChipsinLamivudine-UntreatedPatientswithChronicHepatitisBVirusInfection。JKoreanMedSci2004;19:541-546.乙型肝炎病毒核苷-酸類似物耐藥的檢測DNA芯片技術(shù)

優(yōu)點(diǎn)局限性大通量技術(shù)和設(shè)備的要求高快速檢測成本高靈敏度高可平行檢測

乙型肝炎病毒核苷-酸類似物耐藥的檢測實(shí)時(shí)熒光定量PCR在基因變異中的應(yīng)用探針定點(diǎn)突變PCR技術(shù)Taqman-MGB探針引物末端堿基定點(diǎn)突變擴(kuò)增技術(shù)高分辨熔解曲線法乙型肝炎病毒核苷-酸類似物耐藥的檢測Taqman-MGB探針定點(diǎn)突變PCR技術(shù)乙型肝炎病毒核苷-酸類似物耐藥的檢測Taqman-MGB探針技術(shù)檢測YMDD變異HBVDNA>105copies/mlW:M=1:1HBVDNA>105copies/mlW:M=10:1HBVDNA<105copies/mlW:M=10:1：W：M乙型肝炎病毒核苷-酸類似物耐藥的檢測探針定點(diǎn)突變PCR技術(shù)

優(yōu)點(diǎn)不足

靈敏度高需要相對較貴的熒光PCR儀特異性好需要多條熒光探針，成本高費(fèi)時(shí)短影響因素多，存在一定誤判乙型肝炎病毒核苷-酸類似物耐藥的檢測引物末端堿基定點(diǎn)突變擴(kuò)增技術(shù)乙型肝炎病毒核苷-酸類似物耐藥的檢測引物末端堿基定點(diǎn)突變擴(kuò)增技術(shù)

檢測YMDD變異乙型肝炎病毒核苷-酸類似物耐藥的檢測熔解曲線法檢測YMDD變異特異性探針，其Tm值不同溶解曲線分析乙型肝炎病毒核苷-酸類似物耐藥的檢測基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOFMS)原理乙型肝炎病毒核苷-酸類似物耐藥的檢測MALDI-TOFMS檢測

HBVYMDD變異的原理酶切分子量.JPG乙型肝炎病毒核苷-酸類似物耐藥的檢測基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOFMS)優(yōu)點(diǎn)：高靈敏度、準(zhǔn)確度、分辨率能發(fā)現(xiàn)相對比例小于1%的變異株。局限性：設(shè)備昂貴，目前國內(nèi)難以用于臨床檢測。乙型肝炎病毒核苷-酸類似物耐藥的檢測HBV耐藥不同檢測技術(shù)的比較AdvancesinMolecularDiagnosisofHBVInfectionandDrugResistance。Int.J.Med.Sci.20052(1)：8-161Sensitivityherereferstothelowestlevel(%)atwhichanassaycandetectmixturesofmutantandwild-typevirus.2Informationcontentisconsideredasameasureofatest’sabilitytoprovidebroad,relevantinformationaboutpossiblenewmutations.3Updateabilityassessestheeaseatwhichatestcanbedaptedtoincorporatethedetectionofanewmutation.na,notapplicable.nd,notdetermined.乙型肝炎病毒核苷-酸類似物耐藥的檢測HBV表型耐藥檢測有兩種途徑：1.細(xì)胞外HBV聚合酶活性分析。2.細(xì)胞藥物敏感性實(shí)驗(yàn)。乙型肝炎病毒核苷-酸類似物耐藥的檢測細(xì)胞外HBV聚合酶活性分析目前常用的研究HBV聚合酶活性模型是將HBV基因組插入桿狀病毒載體，繼而轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞而表達(dá)HBV顆粒，應(yīng)用親和層析法純化HBV顆粒后，在細(xì)胞外評價(jià)藥物對聚合酶活性的影響。乙型肝炎病毒核苷-酸類似物耐藥的檢測細(xì)胞外HBV聚合酶活性分析乙型肝炎病毒核苷-酸類似物耐藥的檢測細(xì)胞藥物敏感性實(shí)驗(yàn)該方法類似于細(xì)菌藥物敏感試驗(yàn)。目前多采用病毒載體將含有被檢測的含HBV變異位點(diǎn)的全基因組導(dǎo)入肝細(xì)胞源性細(xì)胞株，然后將各種濃度的核苷類藥物加入培養(yǎng)液，經(jīng)過一定時(shí)間培養(yǎng)后檢測細(xì)胞上清中的HBVDNA含量。

乙型肝炎病毒核苷-酸類似物耐藥的檢測細(xì)胞藥物敏感性實(shí)驗(yàn)乙型肝炎病毒核苷-酸類似物耐藥的檢測細(xì)胞藥物敏感性實(shí)驗(yàn)該技術(shù)在操作上非常繁瑣，目前僅限于研究之需，主要用于藥物開發(fā)研究，尚不能用于常規(guī)臨床分析。乙型肝炎病毒核苷-酸類似物耐藥的檢測臨床耐藥監(jiān)測YMDD變異前后病毒載量和ALT的變化乙型肝炎病毒核苷-酸類似物耐藥的檢測HBVMDD變異與病毒學(xué)突破乙型肝炎病毒核苷-酸類似物耐藥的檢測判斷臨床耐藥時(shí)的建議1.結(jié)合核苷類藥物的應(yīng)用史、起始病毒載量、是否合并其他肝病等。2.注意甄別依從性不良。3.結(jié)合基因變異位點(diǎn)。乙型肝炎病毒核苷-酸類似物耐藥的檢測三、需要重視的幾個(gè)問題慎重對待天然耐藥的結(jié)論。不要過分依基因型耐藥檢測技術(shù)。正確對待基因分型技術(shù)。

乙型肝炎病毒核苷-酸類似物耐藥的檢測YMDD自然變異的幾組數(shù)據(jù)AkarsuM等采用InnoLipa法檢測71例未經(jīng)抗病毒的成年慢性乙肝攜帶者，結(jié)果有13例檢測到Y(jié)MDD變異株。LeeCZ等采用引物末端堿基定點(diǎn)突變