T-ZNZ 244-2024 動物源性產品中羊源性成分檢測數字PCR 法

ICS67.120.10CCSB45T/ZNZ浙江省農產品質量安全學會發(fā)布IT/ZNZ244—2024本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。本文件由浙江省農產品質量安全學會提出并歸口。本文件起草單位：浙江省農業(yè)科學院、天津市農業(yè)科學院、邁克生物股份有限公司。本文件主要起草人：陳笑蕓、紀藝、趙新、付軍、彭城、王曉雪、汪小福、徐俊鋒。IT/ZNZ244—20241T/ZNZ244—2024動物源性產品中羊源性成分檢測數字PCR法本文件描述了使用數字PCR檢測方法測定動物源性產品中山羊、綿羊等DNA成分的原理、試劑與材料、儀器和設備、試驗步驟、結果分析與表述、定量限和檢出限。本文件適用于肉及其加工品、動物源性飼料中山羊、綿羊等DNA成分的數字PCR定性和定量檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。農業(yè)部2406號公告-7-2016轉基因動物及其產品成分檢測DNA提取和純化3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1數字PCRdigitalPCR一種核酸絕對定量的PCR技術。將PCR體系分配成大量微反應體系進行PCR擴增，擴增后對微反應體系進行熒光信號閱讀，通過陽性率和泊松分布計算獲得樣品中靶序列拷貝數濃度。4原理本文件針對羊種屬特異序列設計選取特異性引物和探針進行數字PCR擴增，根據熒光閾值判斷每個微反應體系的擴增結果，依據微反應體系的陰、陽性率和泊松分布公式計算得到數字PCR反應體系中的羊種屬特異性基因拷貝數濃度。5試劑與材料除非另有說明，所有試驗用試劑均為分析純，水為無DNase/RNase超純水。5.1基因組DNA提取或動物成分相關DNA提取試劑盒按照農業(yè)部2406號公告-7-2016中4執(zhí)行或采用等效的動物成分DNA提取試劑盒。5.2數字PCR反應試劑盒2T/ZNZ244—2024按照不同的數字PCR平臺的說明書選取其推薦的數字PCR反應試劑盒。5.3羊種屬特異性序列引物/探針（鋅指解旋酶基因，HELZ基因）HELZ-F:5′-AGGTTGCGCCATGCTGTAG-3′HELZ-R:5′-CAGGACTTCTAATTTCGCCAGTAAC-3′HELZ-P:5′-AGGAGGAATCCCCATCATCACGGC-3′6儀器和設備6.1數字PCR系統(tǒng)：包括微反應體系發(fā)生器或其他具有同樣功能的儀器、PCR擴增儀（變溫速率≤2℃/s，孔間溫度差異<1.0℃)和微反應體系熒光檢測儀或其他具有同樣功能儀器的系統(tǒng)。6.2生物安全柜或超凈工作臺。6.3核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計。6.4電子天平：感量0.1g。6.5離心機：離心力12000g。6.6微量移液器。6.7渦旋震蕩儀。7試驗步驟7.1試樣制備7.1.1對樣品進行前處理處理后將樣品分成三等份，包括待檢樣品、復檢樣品和留存樣品。7.1.2固體樣品依次用70%乙醇和雙蒸水沖洗2次~3次后，置于50mL離心管或密封袋中，-20℃以下凍存。7.1.3半固體和液體樣品混勻后直接分裝到50mL離心管或密封袋中，-20℃以下凍存。7.2DNA模板制備7.2.1試劑盒按照農業(yè)部2406號公告-7-2016中6.3執(zhí)行或等效采用DNA提取試劑盒提取DNA。7.2.2DNA濃度和純度的測定遵照農業(yè)部2406號公告-7-2016中6.4規(guī)定執(zhí)行。7.3數字PCR擴增3T/ZNZ244—20247.3.1對照以含有羊源性成分的樣品作為陽性對照（建議優(yōu)先選用有證標準樣品或有證標準物質以不含有羊源性成分的樣品作為陰性對照，用等體積無菌水代替模板DNA作為空白對照。同時進行對照和試樣的數字PCR反應，試樣設置6次重復，對羊源性特異基因進行擴增，以定量值的均值作為最終結果。各對照PCR反應體系中，除模板外，反應體系和反應條件與7.3.2和7.3.3相同。7.3.2數字PCR反應體系對樣本進行PCR反應。數字PCR反應中的羊種屬特異性基因按表1在PCR反應管中加入反應試劑，渦旋混勻。表1羊種屬特異性基因數字PCR反應體系—10μmol/LHELZ-F10μmol/LHELZ-R10μmol/LHELZ-P注2：推薦市面上現售的數字PCR平臺進行試驗，并針對市面上現售的不同數字PCR平臺，依據說明書調整反應7.3.3反應程序1min98℃,10min；4℃保存。不同PCR反應平臺可根據說明書對熱啟動步驟程序進行修改，但不能對熱循環(huán)（擴增程序）進行修改。擴增結束后讀取熒光信號，用于后續(xù)數據分析。8結果分析與表述8.1質量控制數字PCR擴增結果，陰性對照組和空白對照組均未檢出陽性微滴，陽性對照有明顯陽性微滴，且核酸拷貝數濃度大于6copies/μL，則試驗成立。8.2閾值設定數字PCR結果中，陰性微滴和陽性微滴明顯分開，閾值設在陰性微滴和陽性微滴分開的區(qū)域。8.3拷貝數計算數字PCR儀運行后經軟件計算得出每個試樣羊種屬特異性基因拷貝數濃度。每份試樣6個重復，4T/ZNZ244—2024共6個數據的相對標準偏差不超過25%時，將6個檢測結果的平均值作為樣品的檢測結果，單位為拷8.4檢測結果表述陰性對照、陽性對照和空白對照檢測結果符合8.1要求的情況下，分析試樣結果：——試樣檢測出HELZ基因陽性微滴，且核酸拷貝數濃度≥6copies/μL，則判定為陽性。表述為“樣品中檢出羊源性成分，檢出XXcopies/μL”?！魳悠分袡z測出HELZ基因陽性微滴，且核酸拷貝數濃度＜6copies/μL，則需復檢。若復檢結果仍檢測出陽性微滴，則判定為陽性，否則判定為陰性。若陽性表述為“樣品中檢出羊源性成分”，若陰性表述為“樣品中未檢出羊源性成分”?！魳悠分形礄z測出HELZ基因陽性微滴，則判定為陰性。表述為“樣品中未檢出羊源性成分”。9定量限和檢出限定量限為11copies/μL；檢出限為6copies/μL（指在數字P