凝膠電泳技術(shù)

第五章分子生物學(xué)

研究法重組DNA技術(shù)發(fā)展史上的重大事件

1869FMiescher首次從萊茵河鮭魚精子中分離DNA。1944O.T.Avery證實(shí)DNA是遺傳物質(zhì)。1952A.D.Hershey和M.Chase再次證實(shí)和噬菌體的遺傳物質(zhì)是DNA。

1953J.D.Watson和F.H.C.Crick提出DNA分子結(jié)構(gòu)的雙螺旋模型。M.Wilkins用X-射線衍射法證實(shí)了這一結(jié)構(gòu)。1957A.Kornberg從大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了DNA聚合酶I。1958Meselson和Stahl提出了DNA的半保留復(fù)制模型。1959-1960S.Ochoa發(fā)現(xiàn)RNA聚合酶和mRNA，并證明mRNA決定了蛋白質(zhì)分子中的氨基酸序列。1961Nirenberg破譯了第一相遺傳密碼；Jacob和Monod提出了調(diào)節(jié)基因表達(dá)的操縱子模型。1964Yanofsky和Brenner等人證明，多肽鏈上的氨基酸序列與該基因中的核苷酸序列存在著共線性關(guān)系。1965Holley完成了酵母丙氨酸t(yī)RNA的全序列測(cè)定；科學(xué)家證明細(xì)菌的抗藥性通常由"質(zhì)粒"DNA所決定。

1966Nirenberg，Ochoa、Khorana、Crick等人破譯了全部遺傳密碼。1970Smith，Wilcox和Kelley分離了第一種限制性核酸內(nèi)切酶。Temin和Baltimore從RNA腫瘤病毒中發(fā)現(xiàn)反轉(zhuǎn)錄酶。1972-1973Boyer，Berg等人發(fā)展了DNA重組技術(shù)，于72年獲得第一個(gè)重組DNA分子，73年完成第一例細(xì)菌基因克隆。1975-1977Sanger與Maxam、Gilbert等人發(fā)明了DNA序列測(cè)定技術(shù)。1977年完成了全長5387bp的噬菌體φ174基因組測(cè)定。1978首次在大腸桿菌中生產(chǎn)由人工合成基因表達(dá)的人腦激素和人胰島素。1980美國聯(lián)邦最高法院裁定微生物基因工程可以專利化。1981Palmiter和Brinster獲得轉(zhuǎn)基因小鼠；Spradling和Rubin得到轉(zhuǎn)基因果蠅。1982美、英批準(zhǔn)使用第一例基因工程藥物--胰島素；Sanger等人完成了入噬菌體48,502bp全序列測(cè)定。1983獲得第一例轉(zhuǎn)基因植物。1984斯坦福大學(xué)獲得關(guān)于重組DNA的專利。1988Watson出任“人類基因組計(jì)劃”首席科學(xué)家1989DuPont公司獲得轉(zhuǎn)腫瘤基因小鼠--Oncomouse

1992歐共體35個(gè)實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合完成酵母第三染色體全序列測(cè)定(315kb)1994第一批基因工程西紅柿在美國上市。1996完成了酵母基因組(1.25×107bp)全序列測(cè)定。1997英國愛丁堡羅斯林研究所獲得克隆羊。DNA提取方法

選材真核生物基因組DNA非常龐大，含有大量重復(fù)序列，使分離相應(yīng)靶基因很困難。從不同的生物材料中提取DNA用于研究DNA分子在生命代謝中的作用，由于DNA分子在生物體內(nèi)的分布及含量不同，要選擇適當(dāng)?shù)牟牧咸崛NA。

動(dòng)植物中，小牛胸腺、動(dòng)物肝臟、魚類精子、植物種子的胚中都含有豐富的DNA。cDNA不含重復(fù)序列，通過特異探針篩選cDNA文庫，可以較快地分離到相關(guān)基因。微生物中，谷氨酸菌體含7%~10%，面包酵母含4%，啤酒酵母含6%，大腸肝菌含9%~10%。從各種材料中提取DNA方法不同，分離提取的難易程度也不同。

低等生物，如從病毒中提取DNA比較容易，多數(shù)病毒DNA分子量較小，提取時(shí)易保持其結(jié)構(gòu)完整性。細(xì)菌及高等動(dòng)植物中提取DNA難度大一些。細(xì)菌DNA分子量較大，，因此易被機(jī)械張力剪斷。細(xì)菌DNA，除核DNA外，還有質(zhì)粒DNA等。

1、核酸的理化性質(zhì)RNA和核苷酸的純品都呈白色粉末或結(jié)晶，DNA則為白色類似石棉樣的纖維狀物。除肌苷酸、鳥苷酸具有鮮味外，核酸和核苷酸大都呈酸味。DNA、RNA和核苷酸都是極性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有機(jī)溶劑，它們的鈉鹽比游離酸易溶于水，RNA鈉鹽在水中溶解度可達(dá)40g/L。DNA在水中為10g/L，呈黏性膠體溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。天然狀態(tài)的DNA是以脫氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于細(xì)胞核中。要從細(xì)胞中提取DNA時(shí)，先把DNP抽提出來，再把Pro除去，再除去細(xì)胞中的糖，RNA及無機(jī)離子等，從中分離DNA。DNP和RNP在鹽溶液中的溶解度受鹽濃度的影響不同DNP在低濃度鹽溶液中，幾乎不溶解，如在0.14mol/L的氯化鈉溶解度最低，僅為在水中溶解度的1%，隨著鹽濃度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化鈉中的溶解度很大，比純水高2倍。RNP在鹽溶液中的溶解度受鹽濃度的影響較小，在0.14mol/L氯化鈉中溶解度較大。因此，在提取時(shí)，常用此法分離這兩種核蛋白。2.細(xì)胞的破碎細(xì)菌有堅(jiān)硬的細(xì)胞壁，首先要破碎經(jīng)胞。方法有三種：①機(jī)械方法：超聲波處理法、研磨法、勻漿法；②化學(xué)試劑法：用SDS處理細(xì)胞；

③酶解法：加入溶菌酶或蝸牛酶，都可使細(xì)胞壁破碎。高等動(dòng)物DNA提取的兩個(gè)困難①破碎細(xì)胞難:從處死動(dòng)物、取組織器官到破碎細(xì)胞費(fèi)時(shí)長。在此期間DNA可能會(huì)被DNase降解，而動(dòng)物組織，特別是肌肉組織很難破碎，即使是較易破碎的肝、腎組織也往往使用組織勻漿器，易造成DNA斷裂。

②分子量大，一般比細(xì)菌的大2—3個(gè)數(shù)量級(jí)，比病毒的大4—5個(gè)數(shù)量。對(duì)不同生物材料，要根據(jù)具體情況選擇適當(dāng)?shù)姆蛛x提取方法。

3.DNA提取的幾種方法(1)濃鹽法

利用RNP和DNP在電解溶液中溶解度不同，將二者分離，常用的方法是用1M氯化鈉抽提，得到的DNP粘液與氯仿一起搖蕩，再離心除去蛋白質(zhì)，此時(shí)蛋白質(zhì)停留在水相及氯仿相中間，而DNA位于上層水相中，用2倍體積90%乙醇可將DNA鈉鹽沉淀出來。

以稀鹽酸溶液提取DNA時(shí)，加入適量去污劑，如SDS可有助于蛋白質(zhì)與DNA的分離。在提取過程中為抑制組織中的DNase對(duì)DNA的降解作用，在氯化鈉溶液中加入檸檬酸鈉作為金屬離子的烙合劑。通常用0.15MNacl，0.015M檸檬鈉，并稱SSC溶液，提取DNA.兩種方法比較，后種方法使核酸降解可能少一些。

（2）陰離子去污劑法:

用SDS或二甲苯酸鈉等去污劑使蛋白質(zhì)變性，可以直接從生物材料中提取DNA，由于細(xì)胞中DNA與蛋白質(zhì)之間常借靜電引力或配位鍵結(jié)合，陰離子去污劑能夠破壞這種價(jià)鍵，所以常用陰離子去污劑提取DNA。

（3）苯酚抽提法:苯酚作為蛋白變性劑，同時(shí)抑制了DNase的降解作用。用苯酚處理勻漿液時(shí)，由于蛋白與DNA聯(lián)結(jié)鍵已斷，蛋白分子表面又含有很多極性基團(tuán)與苯酚相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。離心分層后取出水層，利用核酸不溶于醇的性質(zhì)，用乙醇沉淀DNA。此時(shí)DNA是十分粘稠的物質(zhì)，可用玻璃慢慢繞成一團(tuán)，取出。此法的特點(diǎn)是使提取的DNA保持天然狀態(tài)。

RNA的提取

細(xì)胞總RNA一個(gè)細(xì)胞總RNA包括mRNA,rRNA,tRNA和snRNA，80～85％rRNA，15～20％tRNA和snRNA。它們具有確定的大小和核苷酸序列。mRNA占總RNA的1～5％。rRNA電泳產(chǎn)生3條特征性條帶28S，18S和5S，用來鑒定RNA純度和完整性。由于mRNA代表了基因表達(dá)的水平，因此mRNA的分離、定量和檢測(cè)極為重要。RNA和無RNA酶的環(huán)境

應(yīng)用RNA對(duì)細(xì)胞和分子生物學(xué)的各個(gè)方面進(jìn)行研究非常普遍。RNA存在于從簡(jiǎn)單的逆轉(zhuǎn)錄病毒到哺乳動(dòng)物細(xì)胞的所有的生命形式之中。由于當(dāng)前沒有一種方法能夠直接擴(kuò)增RNA，因此，RNA的分離通常是決定實(shí)驗(yàn)結(jié)果質(zhì)量的第一步，也是關(guān)鍵的一步。

提取RNA過程中防止RNA酶的污染所采取的步驟處理RNA樣品時(shí)必需仔細(xì)小心，其程度取決于樣品的用途和來源。由于RNA酶存在于所有的生物中并且能夠抵抗諸如煮沸這樣的物理破壞，因此建立一個(gè)無RNA酶的環(huán)境對(duì)于制備優(yōu)質(zhì)RNA很重要。方案：

1）工作區(qū)域應(yīng)與進(jìn)行普通微生物實(shí)驗(yàn)的區(qū)域分離，特別是那些用于細(xì)菌接種、培養(yǎng)基和試劑配制的區(qū)域，那些培養(yǎng)基和試劑用于從細(xì)菌和動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行DNA的制備和操作，這些區(qū)域富含RNA酶。

2）如有可能，使用標(biāo)有“無RNA酶”的商品試管、吸頭、溶液和水。通常新的無菌處理過的塑料試管和吸管無RNA酶。

3）雙蒸水(ddH2O)和溶液應(yīng)該用RNA酶的抑制劑DEPC(焦碳酸二乙酯)進(jìn)行處理：每100mL溶液或水中加入0.1mLDEPC原液，放在搖床上充分混勻并在37℃下作用數(shù)小時(shí)。然后將溶液高壓滅菌15min使DEPC失活。4)用分子級(jí)的試劑和DEPC處理過的水配制的溶液通常沒有RNA酶。5)分離RNA以前，將一些實(shí)驗(yàn)室玻璃制品置于烤箱在300℃烘烤4h以滅活核酶。如有可能，將其他設(shè)備也滅菌處理。從組織中提取RNA則要注意：

動(dòng)物器官的解剖器械存放組織塊的玻璃器皿凍存組織塊所用的器皿組織器官的沖洗液人汗含有RNA酶，故在所有步驟中均應(yīng)戴手套并經(jīng)常更換。記住我們的周圍環(huán)境含有大量的微生物和氣霧，它們來自吸液操作或來自我們自己的呼吸。這些可能造成RNA酶的污染一些組織像脾臟可能比其它組織含有更多的RNA酶。細(xì)菌比哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有更多的RNA酶。因此從這些細(xì)胞中制備RNA應(yīng)采取更嚴(yán)格的預(yù)防措施。分離后的RNA通過瓊脂糖凝膠電泳再經(jīng)溴化乙錠染色后便可檢查其是否完整。rRNA(18s和28s)條帶模糊可能表明由RNA酶引起的RNA的降解。

一步法分離RNATripurereagent是一種用于RNA分離的商品溶液。它更便于使用并且結(jié)果更加可靠。對(duì)于來源有限的樣品，推薦使用這種試劑。這種試劑能從同一樣品中同時(shí)分離RNA,DNA,蛋白質(zhì)。

方案．用lmL

Tripure／50－100mg(組織)勻漿組織樣品。對(duì)于細(xì)胞、每10cm2面積(貼壁的單層細(xì)胞)或每106個(gè)細(xì)胞(細(xì)胞沉淀)使用1mL。將樣品轉(zhuǎn)至1.5mLEP管中。(-70℃可保存1月)

室溫下放置樣品5min。每1mLTripure中加入0.2mL氯仿并搖動(dòng)15s，置于室溫下2—15min。RNA分子敏感又脆弱難以擴(kuò)增，為了研究mRNA的信息，常將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再擴(kuò)增為雙鏈，并插入到自我復(fù)制的載體上。一個(gè)高質(zhì)量的cDNA文庫代表了生物體某一器官或組織mRNA中所含有的全部或絕大部分遺傳信息。Trizol法抽提總RNA（異硫氰酸胍－苯酚抽提法）Trizol可迅速破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使存在于細(xì)胞質(zhì)及核內(nèi)的RNA釋放出來，并使核糖體蛋白與RNA分子分離，還能保證RNA的完整性。提取首先用液氮研磨材料，加入Trizol液，進(jìn)一步破碎細(xì)胞；加入氯仿抽提，離心，分離水相和有機(jī)相，收集含有RNA的水相，異丙醇沉淀，獲得較純的總RNA。硅膠膜純化柱法將含有目的RNA的細(xì)胞破碎液通過該硅膠柱時(shí)，RNA吸附在硅膠膜上，從而與其他成分分開，在低鹽濃度下可從硅膠膜上直接洗脫RNA，方法簡(jiǎn)單、純度高。RNA純度、濃度檢測(cè)RNA呈單鏈狀態(tài)，易形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，也易降解，因此RNA電泳是在變性條件下進(jìn)行的，可用甲醛、加熱或尿素變性。電泳后如果rRNA大小完整且28SrRNA和18SrRNA亮度接近2:1，mRNA分布均勻，則RNA質(zhì)量好。RNA的檢測(cè)：

將樣品稀釋液于三處波長處讀取OD值。記錄OD值，通過計(jì)算確定RNA濃度或純度。公式如下對(duì)于ssDNA：[ssDNA]＝33×(OD260-OD310)×稀釋倍數(shù)

對(duì)于dsDNA：[dsDNA]＝50×(OD260—OD310)×稀釋倍數(shù)對(duì)于ssRNA：[ssRNA]＝40×(OD260一OD310)×稀釋倍數(shù)以上濃度單位為ug／mL.注意事項(xiàng)

1)OD310值是背景，若鹽濃度較高，OD310值也高。

2)OD260／OD280對(duì)DNA而言其值大約為1.8。

3)OD260／OD280。對(duì)RNA而言其值大約為2.0。小結(jié)所有可能與RNA接觸的器材均得用DEPC處理。操作過程中應(yīng)帶口罩，手套。DEPC有致癌之可能，盡量避免接觸皮膚提取的RNA應(yīng)盡早逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA.mRNA的純化纖維素柱色譜法真核細(xì)胞mRNA具有5’端帽子結(jié)構(gòu)—m7G和3’端的polyA尾巴，因此用寡聚（dT）－纖維素柱色譜法獲得高純度mRNA。利用mRNA3’端含有polyA的特點(diǎn)，當(dāng)RNA流經(jīng)寡聚dT柱時(shí)，在高鹽液作用下，mRNA特異結(jié)合在柱上，再用低鹽溶液或蒸餾水洗脫mRNA。經(jīng)過兩次柱子后可得到較高純度mRNA。PolyA－TTractmRNA分離系統(tǒng)將生物素標(biāo)記的寡聚dT引物與細(xì)胞總RNA溫育，加入與微磁球相連的抗生物素蛋白以結(jié)合polyAmRNA，通過磁場(chǎng)吸附作用將polyAmRNA從總RNA中分離。cDNA的合成合成過程包括第一和第二鏈cDNA的合成。第一鏈cDNA的合成是以mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，由反轉(zhuǎn)錄酶催化，該酶合成DNA時(shí)需要引物引導(dǎo)，常用的引物是oligo

dT。Oligo

dT引物一般包含12～20個(gè)dTTP，后面加一個(gè)連接引物（通常為酶切位點(diǎn)）以便于克隆構(gòu)建。在cDNA合成的過程中，應(yīng)選用活性較高的的反轉(zhuǎn)錄酶及甲基化dCTP，cDNA兩端應(yīng)加上不同內(nèi)切酶識(shí)別接頭，保證cDNA雙鏈的方向性。反應(yīng)體系中一般加入甲基化dCTP，保證新合成的cDNA鏈被甲基化修飾，以防止構(gòu)建克隆時(shí)被限制性內(nèi)切酶切割。第二鏈cDNA的合成是以第一鏈為模板，由DNA聚合酶催化。常用RNAaseH切割mRNA－cDNA雜合鏈中的mRNA序列，所產(chǎn)生的小片段為引物合成第二鏈cDNA，在通過DNA連接酶連成完整DNA鏈。再加入含有另一個(gè)酶切位點(diǎn)的黏性接頭（如EcoR1），與cDNA連接后用Xho1酶切，使cDNA雙鏈5’端和3’端分別具有不同黏性末端，保證它與載體相連的方向性。cDNA文庫的構(gòu)建載體由于cDNA的長度一般在0.5~8kb，常用的質(zhì)粒載體和噬菌體載體都能滿足要求。cDNA文庫的載體要根據(jù)該文庫的用途選擇。Uni-zapXR載體：是一種λ噬菌體載體，具備噬菌體的高效性和質(zhì)粒載體系統(tǒng)可利用藍(lán)白斑篩選的便利，可容納0～10kbDNA片段。該載體內(nèi)部含有pBluescript載體的全部序列，重組后可通過體內(nèi)剪切反應(yīng)cDNA插入片段轉(zhuǎn)移到質(zhì)粒系統(tǒng)中進(jìn)行篩選、克隆和序列分析。包裝含有cDNA插入片段的重組噬菌體只有經(jīng)過體外蛋白外殼包裝反應(yīng)，才能成為有侵染和復(fù)制能力的成熟噬菌體。包裝反應(yīng)的條件要求很精確，DNA和蛋白的濃度。兩者體積比、反應(yīng)溫度及時(shí)間對(duì)包裝效果都有很大影響，而包裝反應(yīng)結(jié)果的好壞對(duì)重組噬菌體的侵染能力有重要影響。侵染用經(jīng)包裝的噬菌體感染大腸桿菌培養(yǎng)物后涂布在瓊脂平板上，會(huì)產(chǎn)生成千上萬個(gè)獨(dú)立噬菌斑，每個(gè)噬菌斑由一個(gè)重組噬菌體分子形成。一個(gè)比較完整的cDNA文庫常包含大于5×105的獨(dú)立克隆。一旦獲得含有某種組織器官cDNA信息的噬菌體文庫，就可用于篩選目的基因、大規(guī)模測(cè)序、基因芯片雜交等功能基因組學(xué)研究?；蛭膸斓暮Y選基因文庫的篩選是指通過某種特殊方法從基因文庫中鑒定出含有所需重組DNA分子的特定克隆的過程。方法包括：核酸雜交法、PCR篩選法和免疫篩選法等。1、核酸雜交法用放射性標(biāo)記的特異DNA探針適用于高密度的菌落雜交篩選。將一張圓形硝酸纖維素膜放在一個(gè)裝有瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿表面，將待篩選菌落從其生長的平板上轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，進(jìn)行適當(dāng)溫育。同時(shí)保留原來的菌落平板作對(duì)照。取出已經(jīng)長有菌落的膜，用堿液處理，使菌落發(fā)生裂解，DNA隨之變性。接著用蛋白酶k處理硝酸纖維素膜去除蛋白，形成菌落DNA印跡。80℃烘烤濾膜，將DNA固定在膜上。將濾膜與放射性標(biāo)記的DNA或RNA探針雜交，通過放射自顯影顯示雜交結(jié)果。在X線片上顯黑色斑點(diǎn)的就是實(shí)驗(yàn)中尋找的目的克隆，可以通過對(duì)應(yīng)于平板上的位置找到相應(yīng)克隆。2、PCR篩選法當(dāng)已知足夠的序列信息并獲得基因特異性引物，可采用此技術(shù)。要從一個(gè)基因組DNA文庫篩選目的基因，首先將整個(gè)文庫（質(zhì)粒形式或細(xì)菌形式均可）保存在多孔培養(yǎng)板上，用設(shè)計(jì)好的目的基因探針對(duì)每個(gè)孔進(jìn)行PCR篩選，鑒定出陽性的孔，把每個(gè)陽性孔中的克隆再稀釋到次級(jí)多孔板中進(jìn)行PCR篩選。重復(fù)以上程序，直到鑒定出與目的基因?qū)?yīng)的單個(gè)克隆為止?；蚪MDNA文庫(genomicDNAlibrary)cDNA文庫(cDNAlibrary)

基因文庫(genelibrary)是指一個(gè)包含了某一生物體全部DNA序列的克隆群體?；蚪MDNA文庫疾病相關(guān)基因的克隆與鑒定

CloningandIdentificationofDiseaseRelativeGenes克隆疾病相關(guān)基因的策略（一）功能性克隆(functionalcloning)（二）定位克隆(positionalcloning)（三）非定位候選基因克隆策略(position-independentcandidategeneapproaches)（四）定位候選基因克隆策略(positionalcandidategeneapproaches)定義

從對(duì)一種致病基因的功能出發(fā)，克隆該致病基因。（一）功能性克隆應(yīng)用

生化機(jī)制已明確、基因表達(dá)產(chǎn)物較易得到的遺傳性疾病?？寺》绞?/p>

①利用特異性抗體篩選表達(dá)型cDNA文庫；②根據(jù)已知的部分氨基酸序列合成寡核苷酸作探針，篩選cDNA文庫。（二）定位克隆定義從一種致病基因的染色體定位出發(fā)逐步縮小范圍，最后克隆該基因。系統(tǒng)的定位克隆工作①

遺傳學(xué)分析(確定致病基因染色體定位)交換分析、連鎖不平衡分析②分子生物學(xué)分析染色體異常(缺失、易位等)分析、基因文庫的篩選與基因克?。ㄈ┓嵌ㄎ缓蜻x基因克隆策略由于基因組作圖的完成和分子病理學(xué)的發(fā)展，人們可以不依靠染色體定位，直接根據(jù)病理學(xué)變化和對(duì)各種基因產(chǎn)物功能的了解，預(yù)測(cè)出候選致病基因。（四）定位候選基因克隆策略當(dāng)致病基因的染色體定位確認(rèn)后，人們可以利用因特網(wǎng)上的基因網(wǎng)站所提供基因序列數(shù)據(jù)，鑒定出候選致病基因。一、核酸的凝膠電泳

核酸凝膠電泳是分子克隆核心技術(shù)之一，用于分離、鑒定和純化DNA或RNA片段；

優(yōu)點(diǎn)：（1）便于分離;（2）便于檢測(cè);（3）便于回收。將某種分子放到特定的電場(chǎng)中，它就會(huì)以一定的速度向適當(dāng)?shù)碾姌O移動(dòng)。某物質(zhì)在電場(chǎng)作用下的遷移速度叫作電泳的速率，它與電場(chǎng)強(qiáng)度成正比，與該分子所攜帶的凈電荷數(shù)成正比，而與分子的磨擦系數(shù)成反比（分子大小、極性、介質(zhì)的粘度系數(shù)等）。（一）核酸電泳原理在生理?xiàng)l件下，核酸分子中的磷酸基團(tuán)是離子化的，所以，DNA和RNA實(shí)際上呈多聚陰離子狀態(tài)（Polyanions）。將DNA、RNA放到電場(chǎng)中，它就會(huì)由負(fù)極→正極移動(dòng)。由于在電泳中往往使用無反應(yīng)活性的穩(wěn)定的支持介質(zhì)，電泳遷移率（或遷移速度）與分子的摩擦系數(shù)成反比。而摩擦系數(shù)是分子大小、介質(zhì)粘度等的函數(shù)。在同一凝膠中、一定電場(chǎng)強(qiáng)度下、分離出不同分子量大小或相同分子量但構(gòu)型有差異的核酸分子。在凝膠電泳中，一般加入溴化乙錠（ethidiumbromide，EB）染色，此時(shí)，核酸分子在紫外光下發(fā)出熒光，肉眼能看到約50ngDNA所形成的條帶。AgaroseGelElectrophoresis+_SampleWell25ng1kbladder0.8%AgaroseAgaroseGelElectrophoresisEtBrDetectionLimit:~5-10ngDNA124SeparationRangeVs.%AgaroseLowGeling

Agarose4-6 0.02-0.4

1DNA分子的大小

雙鏈DNA分子遷移的速率與其堿基對(duì)數(shù)的常用對(duì)數(shù)近似成反比；

2瓊脂糖濃度濃度越低，相同核酸分子遷移越快；

3DNA的構(gòu)象

一般同一分子：超螺旋環(huán)狀＞線狀＞切口環(huán)狀。

4凝膠和電泳緩沖液中的溴化乙錠

溴化乙錠（EB）插入雙鏈DNA造成其負(fù)電荷減少、剛性和長度增加。（二）DNA的遷移速率決定因素

5所用的電壓低電壓時(shí)DNA片段遷移率與所用的電壓成正比。

6瓊脂糖種類常見的有兩種：標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖和低熔點(diǎn)瓊脂糖；（三）常用電泳緩沖液比較

1）TAE的緩沖容量最低，如長時(shí)間電泳會(huì)被消耗，此時(shí)凝膠的陽極一側(cè)將發(fā)生酸性化；2）TBE和TPE比TAE花費(fèi)稍貴，但有高得多的緩沖容量；3）雙鏈線狀DNA片段在TAE中比在TBE或TPE中遷移快10%；4）對(duì)于高分子質(zhì)量的DNA，TAE的分辨率略高于TBE或TPE，對(duì)于低分子質(zhì)量的DNA，TAE要差些。超螺旋DNA在TAE中的電泳分辨率要好于TBE。（四）凝膠載樣緩沖液載樣緩沖液：臨上樣到凝膠加樣孔之前與待電泳的樣品相混合的一種緩沖液。載樣緩沖液有三個(gè)作用：1）增加樣品密度保證DNA沉入加樣孔內(nèi)；2）使樣品帶有顏色便于簡(jiǎn)化上樣過程；3）其中的染料在電場(chǎng)中以可以預(yù)測(cè)的泳動(dòng)速率向陽極遷移。6×凝膠載樣緩沖液類型6×緩沖液貯存溫度I0.25%溴酚藍(lán)4℃0.25%二甲苯氰FF40%(m/V)蔗糖水溶液II0.25%溴酚藍(lán)室溫0.25%二甲苯氰FF15%Ficoll(Type400)水溶液III0.25%溴酚藍(lán)4℃0.25%二甲苯氰FF30%甘油水溶液IV0.25%溴酚藍(lán)4℃40%(m/V)蔗糖水溶液1、穩(wěn)定電壓首先將電壓的準(zhǔn)確數(shù)值輸進(jìn)去，其它電流或功率值要高于正常工作值，否則電壓不能恒定。例如：恒定電壓為200V預(yù)設(shè)電流(100mA,工作電流+30mA)通常1V電壓≈0.35mA工作電流，200V電壓預(yù)計(jì)工作電流為70mA，電流再向上加30mA=100mA預(yù)設(shè)功率值（20W）：用電壓值除以10倍即200V÷10≈20W實(shí)際工作電功率=工作電壓（V）×工作電流（A）

=200V×0.03A=6W（五）電泳儀參數(shù)設(shè)定操作方法電泳儀參數(shù)設(shè)定操作方法2、穩(wěn)定電流首先將電流的準(zhǔn)確數(shù)值輸進(jìn)去，其它電壓或功率值要高于正常工作值，否則電流不能恒定。3、恒定功率首先將功率的準(zhǔn)確數(shù)字輸進(jìn)去，其它電壓電流值要高于正常工作值,否則功率不能恒定。例如，恒功率10—30W時(shí)電流150mA電壓1000V40W以上時(shí)電流200mA(或設(shè)最高值400mA)電壓1500V設(shè)定好各項(xiàng)恒定值后，一按啟動(dòng)鍵，實(shí)際電流，電壓，電功率值顯示出來，黑色光標(biāo)閃爍處為恒定的數(shù)值。注:五型電泳儀恒壓之前,先要把電流的指針開到最大,反之恒流時(shí),要把電壓指針開到最大.（六）瓊脂糖凝膠中DNA的檢測(cè)通過染色,紫外燈下檢測(cè)。

主要有溴化乙錠（ethidiumbromide,EB）染色法和SYBRGold染色法。電泳照片使用EB染色注意事項(xiàng)（1）EB被認(rèn)為是一種強(qiáng)致癌物質(zhì)（2）EB可用來檢測(cè)單鏈或雙鏈核酸（3）EB使用時(shí)的配制、貯存及使用

EB常用水配制成10mg/ml的貯存液，于室溫保存在棕色瓶或用鋁箔包裹的瓶中，使用終濃度為0.5μg/ml（4）當(dāng)要知道DNA片段準(zhǔn)確大小時(shí)，凝膠應(yīng)在無EB情況下電泳，電泳結(jié)束后再用EB染色。凝膠SYBRGold的染色SYBRGold是一種新型極敏感染料的商品名稱。其與DNA結(jié)合的親和力高，并且結(jié)合后，能夠極大增強(qiáng)熒光信號(hào)。GoldViewTMDNA染料（溴化乙錠的替代品）

GoldView

是一種可代替溴化乙錠（EB）的新型DNA染料，使用方法與之完全相同，在100ml瓊脂糖溶液中加入5ulGoldView即可。在紫外燈下雙鏈DNA呈現(xiàn)綠色熒光，而單鏈DNA呈現(xiàn)紅色熒光。λDNA（EcolⅠ,HindⅢ雙酶切）用無毒染料(GoldViewTMDNA)所做的實(shí)驗(yàn)結(jié)果GoldView無毒熒光染料實(shí)驗(yàn)結(jié)果RAPD—PCR擴(kuò)增用制膠器灌膠，插梳子上樣凝膠中DNA的成像可以用透射或入射紫外光對(duì)EB染色的凝膠成像，圖像可以直接輸出到計(jì)算機(jī)觀察。二、聚丙烯酰胺凝膠電泳

polyacrylamidegelelectrophoresis

PAGE在TEMED(四甲基乙二胺)催化過硫酸銨還原產(chǎn)生的自由基的存在下，