第10章 動物基因工程課件

動物基因工程（AnimalGeneticEngineering）第十章第10章動物基因工程主要內容第一節(jié)目的基因的獲取第二節(jié)基因體外重組第三節(jié)轉基因第四節(jié)基因敲除與基因診斷第五節(jié)動物克隆技術第10章動物基因工程動物基因工程，原稱遺傳工程，是應用DNA重組技術，按照人們的意愿，在基因水平上改變生物遺傳性，創(chuàng)造新生物物種，通過工程化為人類提供有用產品及服務的技術；或指應用現(xiàn)代化的生物科學和遺傳學技術，對動物基因進行操縱或改造的科學工程?；蚬こ痰暮诵募夹g是DNA的重組技術，還包括基因的表達技術，基因的突變技術，基因的導入技術等。什么是動物基因工程？第10章動物基因工程基因工程一般分為4個步驟：一是取得符合人們要求的DNA片段，這種DNA片段被稱為“目的基因”；二是將目的基因與質?；虿《綝NA連接成重組DNA；三是把重組DNA引人某種細胞；四是把目的基因能表達的受體細胞挑選出來?；蚬こ痰幕静僮鞯?0章動物基因工程第一節(jié)目的基因獲取第10章動物基因工程1基因組DNA及總RNA的提取

動物DNA的來源（核DNA、線粒體DNA、質粒DNA）1.血液、毛發(fā)、皮屑（口腔上皮細胞）、精液、化石及耳朵等活體組織；2.固定和包埋的組織標本：脫蠟、蛋白酶K消化

RNA來源：新鮮組織或細胞第10章動物基因工程DNA提取方法：常規(guī)苯酚-氯仿方法、試劑盒方法---；RNA提?。核闷髅蠛驮噭┍匦杞?jīng)高溫滅菌或DEPC處理GenomeDNATotalRNA第10章動物基因工程2基因文庫基因文庫(Genelibrary)包括cDNA文庫(cDNAlibrary)和基因組文庫(Genomelibrary)。

文庫:cDNA是指以mRNA為模板,經(jīng)反轉錄酶催化合成DNA，則此DNA序列與mRNA互補，稱為互補DNA或cDNA。RT-PCR：反轉錄PCR（ReverseTranscriptionPCR）第10章動物基因工程cDNA文庫：提取出組織細胞的全部mRNA，在體外反轉錄成cDNA，與適當?shù)妮d體常用噬菌體或質粒載體連接后轉化受體菌，則每個細菌含有一段cDNA，并能繁殖擴增，這樣包含著細胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合稱為該組織細胞的cDNA文庫。實際為不包含內含子的基因組文庫。cDNA文庫(cDNAlibrary)第10章動物基因工程基因組文庫（GenomicDNALibrary）從生物組織細胞提取出全部DNA，用物理方法或酶法將DNA降解成預期大小的片段，然后將這些片段與適當?shù)妮d體連接，轉入受體細菌或細胞，這樣每一個細胞接受了含有一個基因組DNA片段與載體連接的重組DNA分子，而且可以繁殖擴增，許多細胞一起組成一個含有基因組各DNA片段克隆的集合體，就稱為基因組DNA文庫。如果這個文庫足夠大，能包含該生物基因組DNA全部的序列，就是該生物完整的基因組文庫，能從這文庫中釣取該生物的全部基因或DNA序列。第10章動物基因工程文庫構建第10章動物基因工程3PCR

*PCR，即聚合酶鏈式反應或多聚酶鏈反應（PolymeraseChainReaction）,

是一種對特定的DNA片段在體外進行快速擴增的新方法。

*由1985年穆里斯（K.Mullis）發(fā)明，他也因此獲得了1993年的諾貝爾化學獎。第10章動物基因工程PCR的原理：體外DNA復制。包括高溫變性、低溫退火和中溫延伸過程。第10章動物基因工程PCR反應五要素

引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

TaqDNA聚合酶1）來自水生棲熱菌Thermusaquaticus；2）良好的耐熱性；3）Mg2+依賴性；4）無校正功能PCR反應條件優(yōu)化：引物設計：第10章動物基因工程PCR的類型㈠巢式PCR㈦原位PCR㈡多重PCR㈧定量PCR㈢不對稱PCR㈨差異顯示PCR㈣共享引物PCR㈩重組PCR㈤錨定PCR(十一)RT-PCR㈥彩色PCR

(十二)RAPD----------

第10章動物基因工程多重PCR:是指在一個單一反應中同時擴增多個序列的反應過程，能夠節(jié)省時間和精力。定量PCR技術是指以外參或內參為標準,通過對PCR終產物的分析或PCR過程的監(jiān)測,進行PCR起始模板量的定量。用于擴增已知一端序列的目的DNA

錨定PCR：使用一條錨定引物就一條特異性引物擴增已知一端序列的目的DNA。

基本概念第10章動物基因工程巢式PCR：利用兩套PCR引物對進行兩輪PCR擴增反應組成，在第一輪擴增中，外引物用以產生擴增產物，此產物在在內引物的存在下進行第二輪擴增。差別顯示ＰＣＲ：是根據(jù)絕大多數(shù)真核細胞mRNA3’端具有的多聚腺苷酸尾（polyA）結構，因此可用含oligo（dT）的寡聚核苷酸為引物將不同的mRNA反轉錄成cDNA?；靖拍畹?0章動物基因工程4基因克隆

基因克?。╣ene

cloning）：或分子克隆,又稱為重組ＤＮＡ技術，是應用酶學方法，在體外將不同來源的DNA分子通過酶切、連接等操作重新組裝成雜合分子，并使之在適當?shù)乃拗骷毎羞M行擴增，形成大量的子代DNA分子的過程。克?。╟lone）：指含有單一的DNA重組體的無性繁殖系，或指將DNA重組體引入宿主細胞建立無性繁殖系的過程(cloning)。

基因克隆步驟：1)

獲得待克隆的DNA片段（基因）；2)目的基因與載體在體外連接；３)重組DNA分子導入宿主細胞；４)篩選、鑒定陽性重組子；５)重組子的擴增與／或表達。第10章動物基因工程5核酸分子鑒定

1、PCR結合測序：2、核酸雜交技術（基于堿基互補配對）Southern雜交Northern雜交原位雜交第10章動物基因工程序列測定Sanger等（1977）發(fā)明的雙脫氧鏈末端終止法。第10章動物基因工程*

是southern于1975年創(chuàng)建用以鑒定DNA中某一特定的基因片段的技術，也稱為Southern印跡（SouthernBlot）。*通過標記的探針DNA與靶DNA結合，檢測目的基因的存在及大小。Southern雜交第10章動物基因工程Northern雜交*也稱為Northern印跡（NorthernBlot），用以檢測某一特定的RNA（通常是mRNA）片段的存在及表達量。*因與DNA的雜交（Southern雜交）相對應，故被趣稱為Northern雜交。第10章動物基因工程原位雜交*細胞或染色體的原位雜交，用于基因定位。

*細菌菌落的原位雜交：篩選陽性克隆。第10章動物基因工程Western(印跡)雜交*蛋白質水平上的雜交技術，又稱為免疫印跡，即檢測蛋白質與標記的特定蛋白抗體結合，經(jīng)放射自顯影顯示條帶，根據(jù)條帶密度確定蛋白質表達量。*與DNA、RNA水平上的Southern雜交、Northern雜交相對應，稱為Western雜交。*常結合Northern印跡技術，檢測基因表達調控。第10章動物基因工程第二節(jié)

基因體外重組技術第10章動物基因工程1重組質粒構建載體是指攜帶靶DNA片段進入宿主細胞進行擴增和表達的工具。質粒是指一種存在于細胞內能獨立復制的染色體外的DNA。

第10章動物基因工程1)質粒圖譜登記號：0052

2)質粒名稱：pBudCE4.1

3)來源：Invitrogen

4)用途：真核表達載體

5)詳細資料

6)是否可以共享

7)聯(lián)系方式：PM

第10章動物基因工程重組質粒的構建過程第10章動物基因工程2重組基因的鑒定抗性篩選法：能否生長；藍色和白色菌落，其中白色菌落可能含重組質粒。

PCR：雙酶切：第10章動物基因工程3體外表達*在原核生物中的表達：細菌、酵母第10章動物基因工程*在真核生物細胞中的表達：人工培養(yǎng)肝細胞、上皮細胞人工培養(yǎng)的人成骨細胞人成骨細胞內的pEGFP蛋白表達

第10章動物基因工程第三節(jié)

轉基因技術（Transgenictechnology）第10章動物基因工程1轉基因與轉基因動物轉基因超級鼠1982年，英國的《自然》雜志發(fā)表了一篇文章：有兩個美國實驗小組利用轉基因技術，將大鼠生長激素重組基因導入到小鼠受精卵中,培育出具快速生長效應的“轉基因超級鼠”。轉基因鼠比與它同胎所生的小鼠生長速度快2～3倍，體積大一倍。第10章動物基因工程概念轉基因：1）將人工分離和修飾過的基因導入到生物體基因組中，由于導入基因的表達，引起生物體的性狀的可遺傳的修飾，稱之為轉基因技術。2）轉基因技術就是指利用分子生物學技術，將某些生物的基因轉移到其它物種中，改造生物的遺傳物質，使遺傳物質得到改造的生物在性狀、營養(yǎng)和消費品質等方面向人類需要的目標轉變。轉基因動物：所謂轉基因動物就是指以實驗方法將外源基因導入動物染色體基因組內穩(wěn)定整合并能遺傳給后代的一類動物。第10章動物基因工程轉基因的方法

1、顯微注射法：將DNA注射到胚胎的細胞核內，再把注射過DNA的胚胎移植到動物體內，使之發(fā)育成正常的幼仔。

2、體細胞核移植方法：先在體外培養(yǎng)的體細胞中進行基因導入并篩選。然后將帶轉基因體細胞移植到去掉細胞核的卵細胞中，生產重構胚胎。第10章動物基因工程3．逆轉錄病毒感染法：最早用來得到轉基因小鼠的方法，利用逆轉錄載體將遺傳信息以RNA分子的形式，在逆轉錄整合酶和逆轉錄基因組末端的特異性核酸序列的作用下，反轉錄并整合到宿主基因組中去，最終得到轉基因小鼠。4．胚胎干細胞法：將轉染的胚胎干細胞注射入受體囊胚腔，可參與嵌合體的形成，將來出生的動物的生殖系統(tǒng)就有可能整合上外源基因，通過雜交繁育得到純合目的基因的個體，即為轉基因動物。轉基因的方法第10章動物基因工程

轉基因動物的應用前景

1、研究基因的結構與功能，了解動物生命現(xiàn)象的內在本質。2、建立多種疾病的動物模型，研究發(fā)病機理及治療方法。3、改善動物生產性能，提高動物育種效率。4、作為醫(yī)用或食用蛋白的生物反應器。可以通過家畜乳腺分泌大量安全、高效、廉價的人體藥用蛋白。第10章動物基因工程四個主要國家轉基因作物種植面積占全球９９％。美國占６６％，達３９００萬公頃，轉基因作物產量也居世界第一，美國種植的７５％的大豆、３４％的棉花和７１％的玉米都是轉基因作物。阿根廷占２３％，達１３５０萬公頃。加拿大占６％，達３５０萬公頃。中國第四位，占４％，達２１０萬公頃。歐盟國家總面積不到２０萬公頃，０.３％左右。

四個轉基因作物種植大國2002年數(shù)據(jù)第10章動物基因工程存在問題

1、食品安全問題：1）未知的可能副作用？2）外源基因在人體內表達？2、技術問題：1）成本；2）成功率；3）基因組的有效整合、穩(wěn)定遺傳；第10章動物基因工程

什么是生物反應器？生物反應器是指利用轉基因活體動物的某種能夠高效表達外源蛋白的器官或組織來進行工業(yè)化生產活性功能蛋白的技術，這些蛋白一般是藥用蛋白或營養(yǎng)保健蛋白。第10章動物基因工程用于表達的生物反應器包括動物血液、泌尿系統(tǒng)、精囊腺、乳腺等，還包括禽蛋和昆蟲（例如家蠶）個體等。其中動物乳腺生物反應器是目前國際上唯一證明可以達到商業(yè)化生產水平的生物反應器。據(jù)預測，2010年世界上動物乳腺生物反應器的年產值將達到500億美元以上。生物反應器的種類及應用第10章動物基因工程第四節(jié)

基因敲除與基因治療(GeneKnockout&GeneTherapy)第10章動物基因工程

什么是基因敲除技術？基因敲除（geneknockout）是80年代初出現(xiàn)的一項新的基因工程技術。采用同源重組的方法,用體外合成的無效基因或突變基因取代相應正?；?再應用轉基因方法孵育出轉基因動物,即為基因敲除動物。第10章動物基因工程示例第10章動物基因工程第10章動物基因工程

基因敲除技術的應用1、研究基因調控和基因功能；2、建立人類疾病的轉基因動物模型，為醫(yī)學研究提供材料；3、改造動物基因型，鑒定新基因和/或其新功能，研究發(fā)育生物學；4、治療遺傳病，即基因治療。5、改造生物、培育新的生物品種。第10章動物基因工程基因治療與基因疫苗基因治療(genetherapy)

是指將人的正常基因或有治療作用的基因通過一定方式導入人體靶細胞以糾正基因的缺陷或者發(fā)揮治療作用（也包括剔除或抑制某些導致疾病的基因），從而達到治療疾病目的的生物醫(yī)學新技術?；蛞呙缰傅氖荄NA疫苗，即將編碼外源性抗原的基因插入載體，然后導入人或動物體內，讓其在宿主細胞中表達抗原蛋白，誘導機體產生免疫應答。第10章動物基因工程傳統(tǒng)的基因治療指目的基因導入靶細胞后與宿主細胞的基因組發(fā)生整合，成為宿主細胞遺傳物質的一部分，目的基因的表達產物起到對疾病的治療作用。目的基因不與宿主細胞基因組發(fā)生整合，暫時表達產物發(fā)揮治療作用的基因治療方法叫做基因療法(genetherapeutics)。廣義的基因治療還應包括基因調控，如利用RNAi技術抑制基因表達?；蛑委煹耐緩降?0章動物基因工程第五節(jié)

動物克隆技術(AnimalCloningTechnology)第10章動物基因工程

CreatingDolly！1997年2月22日，英國“Nature”