第10章 動物基因工程課件

動物基因工程（AnimalGeneticEngineering）第十章第10章動物基因工程主要內(nèi)容第一節(jié)目的基因的獲取第二節(jié)基因體外重組第三節(jié)轉(zhuǎn)基因第四節(jié)基因敲除與基因診斷第五節(jié)動物克隆技術(shù)第10章動物基因工程動物基因工程，原稱遺傳工程，是應(yīng)用DNA重組技術(shù)，按照人們的意愿，在基因水平上改變生物遺傳性，創(chuàng)造新生物物種，通過工程化為人類提供有用產(chǎn)品及服務(wù)的技術(shù)；或指應(yīng)用現(xiàn)代化的生物科學(xué)和遺傳學(xué)技術(shù)，對動物基因進(jìn)行操縱或改造的科學(xué)工程。基因工程的核心技術(shù)是DNA的重組技術(shù)，還包括基因的表達(dá)技術(shù)，基因的突變技術(shù)，基因的導(dǎo)入技術(shù)等。什么是動物基因工程？第10章動物基因工程基因工程一般分為4個步驟：一是取得符合人們要求的DNA片段，這種DNA片段被稱為“目的基因”；二是將目的基因與質(zhì)?；虿《綝NA連接成重組DNA；三是把重組DNA引人某種細(xì)胞；四是把目的基因能表達(dá)的受體細(xì)胞挑選出來?；蚬こ痰幕静僮鞯?0章動物基因工程第一節(jié)目的基因獲取第10章動物基因工程1基因組DNA及總RNA的提取

動物DNA的來源（核DNA、線粒體DNA、質(zhì)粒DNA）1.血液、毛發(fā)、皮屑（口腔上皮細(xì)胞）、精液、化石及耳朵等活體組織；2.固定和包埋的組織標(biāo)本：脫蠟、蛋白酶K消化

RNA來源：新鮮組織或細(xì)胞第10章動物基因工程DNA提取方法：常規(guī)苯酚-氯仿方法、試劑盒方法---；RNA提?。核闷髅蠛驮噭┍匦杞?jīng)高溫滅菌或DEPC處理GenomeDNATotalRNA第10章動物基因工程2基因文庫基因文庫(Genelibrary)包括cDNA文庫(cDNAlibrary)和基因組文庫(Genomelibrary)。

文庫:cDNA是指以mRNA為模板,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶催化合成DNA，則此DNA序列與mRNA互補，稱為互補DNA或cDNA。RT-PCR：反轉(zhuǎn)錄PCR（ReverseTranscriptionPCR）第10章動物基因工程cDNA文庫：提取出組織細(xì)胞的全部mRNA，在體外反轉(zhuǎn)錄成cDNA，與適當(dāng)?shù)妮d體常用噬菌體或質(zhì)粒載體連接后轉(zhuǎn)化受體菌，則每個細(xì)菌含有一段cDNA，并能繁殖擴(kuò)增，這樣包含著細(xì)胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合稱為該組織細(xì)胞的cDNA文庫。實際為不包含內(nèi)含子的基因組文庫。cDNA文庫(cDNAlibrary)第10章動物基因工程基因組文庫（GenomicDNALibrary）從生物組織細(xì)胞提取出全部DNA，用物理方法或酶法將DNA降解成預(yù)期大小的片段，然后將這些片段與適當(dāng)?shù)妮d體連接，轉(zhuǎn)入受體細(xì)菌或細(xì)胞，這樣每一個細(xì)胞接受了含有一個基因組DNA片段與載體連接的重組DNA分子，而且可以繁殖擴(kuò)增，許多細(xì)胞一起組成一個含有基因組各DNA片段克隆的集合體，就稱為基因組DNA文庫。如果這個文庫足夠大，能包含該生物基因組DNA全部的序列，就是該生物完整的基因組文庫，能從這文庫中釣取該生物的全部基因或DNA序列。第10章動物基因工程文庫構(gòu)建第10章動物基因工程3PCR

*PCR，即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或多聚酶鏈反應(yīng)（PolymeraseChainReaction）,

是一種對特定的DNA片段在體外進(jìn)行快速擴(kuò)增的新方法。

*由1985年穆里斯（K.Mullis）發(fā)明，他也因此獲得了1993年的諾貝爾化學(xué)獎。第10章動物基因工程PCR的原理：體外DNA復(fù)制。包括高溫變性、低溫退火和中溫延伸過程。第10章動物基因工程PCR反應(yīng)五要素

引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

TaqDNA聚合酶1）來自水生棲熱菌Thermusaquaticus；2）良好的耐熱性；3）Mg2+依賴性；4）無校正功能PCR反應(yīng)條件優(yōu)化：引物設(shè)計：第10章動物基因工程PCR的類型㈠巢式PCR㈦原位PCR㈡多重PCR㈧定量PCR㈢不對稱PCR㈨差異顯示PCR㈣共享引物PCR㈩重組PCR㈤錨定PCR(十一)RT-PCR㈥彩色PCR

(十二)RAPD----------

第10章動物基因工程多重PCR:是指在一個單一反應(yīng)中同時擴(kuò)增多個序列的反應(yīng)過程，能夠節(jié)省時間和精力。定量PCR技術(shù)是指以外參或內(nèi)參為標(biāo)準(zhǔn),通過對PCR終產(chǎn)物的分析或PCR過程的監(jiān)測,進(jìn)行PCR起始模板量的定量。用于擴(kuò)增已知一端序列的目的DNA

錨定PCR：使用一條錨定引物就一條特異性引物擴(kuò)增已知一端序列的目的DNA。

基本概念第10章動物基因工程巢式PCR：利用兩套PCR引物對進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)組成，在第一輪擴(kuò)增中，外引物用以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物，此產(chǎn)物在在內(nèi)引物的存在下進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。差別顯示ＰＣＲ：是根據(jù)絕大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA3’端具有的多聚腺苷酸尾（polyA）結(jié)構(gòu)，因此可用含oligo（dT）的寡聚核苷酸為引物將不同的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA?；靖拍畹?0章動物基因工程4基因克隆

基因克隆（gene

cloning）：或分子克隆,又稱為重組ＤＮＡ技術(shù)，是應(yīng)用酶學(xué)方法，在體外將不同來源的DNA分子通過酶切、連接等操作重新組裝成雜合分子，并使之在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增，形成大量的子代DNA分子的過程。克?。╟lone）：指含有單一的DNA重組體的無性繁殖系，或指將DNA重組體引入宿主細(xì)胞建立無性繁殖系的過程(cloning)。

基因克隆步驟：1)

獲得待克隆的DNA片段（基因）；2)目的基因與載體在體外連接；３)重組DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞；４)篩選、鑒定陽性重組子；５)重組子的擴(kuò)增與／或表達(dá)。第10章動物基因工程5核酸分子鑒定

1、PCR結(jié)合測序：2、核酸雜交技術(shù)（基于堿基互補配對）Southern雜交Northern雜交原位雜交第10章動物基因工程序列測定Sanger等（1977）發(fā)明的雙脫氧鏈末端終止法。第10章動物基因工程*

是southern于1975年創(chuàng)建用以鑒定DNA中某一特定的基因片段的技術(shù)，也稱為Southern印跡（SouthernBlot）。*通過標(biāo)記的探針DNA與靶DNA結(jié)合，檢測目的基因的存在及大小。Southern雜交第10章動物基因工程Northern雜交*也稱為Northern印跡（NorthernBlot），用以檢測某一特定的RNA（通常是mRNA）片段的存在及表達(dá)量。*因與DNA的雜交（Southern雜交）相對應(yīng)，故被趣稱為Northern雜交。第10章動物基因工程原位雜交*細(xì)胞或染色體的原位雜交，用于基因定位。

*細(xì)菌菌落的原位雜交：篩選陽性克隆。第10章動物基因工程Western(印跡)雜交*蛋白質(zhì)水平上的雜交技術(shù)，又稱為免疫印跡，即檢測蛋白質(zhì)與標(biāo)記的特定蛋白抗體結(jié)合，經(jīng)放射自顯影顯示條帶，根據(jù)條帶密度確定蛋白質(zhì)表達(dá)量。*與DNA、RNA水平上的Southern雜交、Northern雜交相對應(yīng)，稱為Western雜交。*常結(jié)合Northern印跡技術(shù)，檢測基因表達(dá)調(diào)控。第10章動物基因工程第二節(jié)

基因體外重組技術(shù)第10章動物基因工程1重組質(zhì)粒構(gòu)建載體是指攜帶靶DNA片段進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的工具。質(zhì)粒是指一種存在于細(xì)胞內(nèi)能獨立復(fù)制的染色體外的DNA。

第10章動物基因工程1)質(zhì)粒圖譜登記號：0052

2)質(zhì)粒名稱：pBudCE4.1

3)來源：Invitrogen

4)用途：真核表達(dá)載體

5)詳細(xì)資料

6)是否可以共享

7)聯(lián)系方式：PM

第10章動物基因工程重組質(zhì)粒的構(gòu)建過程第10章動物基因工程2重組基因的鑒定抗性篩選法：能否生長；藍(lán)色和白色菌落，其中白色菌落可能含重組質(zhì)粒。

PCR：雙酶切：第10章動物基因工程3體外表達(dá)*在原核生物中的表達(dá)：細(xì)菌、酵母第10章動物基因工程*在真核生物細(xì)胞中的表達(dá)：人工培養(yǎng)肝細(xì)胞、上皮細(xì)胞人工培養(yǎng)的人成骨細(xì)胞人成骨細(xì)胞內(nèi)的pEGFP蛋白表達(dá)

第10章動物基因工程第三節(jié)

轉(zhuǎn)基因技術(shù)（Transgenictechnology）第10章動物基因工程1轉(zhuǎn)基因與轉(zhuǎn)基因動物轉(zhuǎn)基因超級鼠1982年，英國的《自然》雜志發(fā)表了一篇文章：有兩個美國實驗小組利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將大鼠生長激素重組基因?qū)氲叫∈笫芫阎?培育出具快速生長效應(yīng)的“轉(zhuǎn)基因超級鼠”。轉(zhuǎn)基因鼠比與它同胎所生的小鼠生長速度快2～3倍，體積大一倍。第10章動物基因工程概念轉(zhuǎn)基因：1）將人工分離和修飾過的基因?qū)氲缴矬w基因組中，由于導(dǎo)入基因的表達(dá)，引起生物體的性狀的可遺傳的修飾，稱之為轉(zhuǎn)基因技術(shù)。2）轉(zhuǎn)基因技術(shù)就是指利用分子生物學(xué)技術(shù)，將某些生物的基因轉(zhuǎn)移到其它物種中，改造生物的遺傳物質(zhì)，使遺傳物質(zhì)得到改造的生物在性狀、營養(yǎng)和消費品質(zhì)等方面向人類需要的目標(biāo)轉(zhuǎn)變。轉(zhuǎn)基因動物：所謂轉(zhuǎn)基因動物就是指以實驗方法將外源基因?qū)雱游锶旧w基因組內(nèi)穩(wěn)定整合并能遺傳給后代的一類動物。第10章動物基因工程轉(zhuǎn)基因的方法

1、顯微注射法：將DNA注射到胚胎的細(xì)胞核內(nèi)，再把注射過DNA的胚胎移植到動物體內(nèi)，使之發(fā)育成正常的幼仔。

2、體細(xì)胞核移植方法：先在體外培養(yǎng)的體細(xì)胞中進(jìn)行基因?qū)氩⒑Y選。然后將帶轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞移植到去掉細(xì)胞核的卵細(xì)胞中，生產(chǎn)重構(gòu)胚胎。第10章動物基因工程3．逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法：最早用來得到轉(zhuǎn)基因小鼠的方法，利用逆轉(zhuǎn)錄載體將遺傳信息以RNA分子的形式，在逆轉(zhuǎn)錄整合酶和逆轉(zhuǎn)錄基因組末端的特異性核酸序列的作用下，反轉(zhuǎn)錄并整合到宿主基因組中去，最終得到轉(zhuǎn)基因小鼠。4．胚胎干細(xì)胞法：將轉(zhuǎn)染的胚胎干細(xì)胞注射入受體囊胚腔，可參與嵌合體的形成，將來出生的動物的生殖系統(tǒng)就有可能整合上外源基因，通過雜交繁育得到純合目的基因的個體，即為轉(zhuǎn)基因動物。轉(zhuǎn)基因的方法第10章動物基因工程

轉(zhuǎn)基因動物的應(yīng)用前景

1、研究基因的結(jié)構(gòu)與功能，了解動物生命現(xiàn)象的內(nèi)在本質(zhì)。2、建立多種疾病的動物模型，研究發(fā)病機理及治療方法。3、改善動物生產(chǎn)性能，提高動物育種效率。4、作為醫(yī)用或食用蛋白的生物反應(yīng)器?？梢酝ㄟ^家畜乳腺分泌大量安全、高效、廉價的人體藥用蛋白。第10章動物基因工程四個主要國家轉(zhuǎn)基因作物種植面積占全球９９％。美國占６６％，達(dá)３９００萬公頃，轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)量也居世界第一，美國種植的７５％的大豆、３４％的棉花和７１％的玉米都是轉(zhuǎn)基因作物。阿根廷占２３％，達(dá)１３５０萬公頃。加拿大占６％，達(dá)３５０萬公頃。中國第四位，占４％，達(dá)２１０萬公頃。歐盟國家總面積不到２０萬公頃，０.３％左右。

四個轉(zhuǎn)基因作物種植大國2002年數(shù)據(jù)第10章動物基因工程存在問題

1、食品安全問題：1）未知的可能副作用？2）外源基因在人體內(nèi)表達(dá)？2、技術(shù)問題：1）成本；2）成功率；3）基因組的有效整合、穩(wěn)定遺傳；第10章動物基因工程

什么是生物反應(yīng)器？生物反應(yīng)器是指利用轉(zhuǎn)基因活體動物的某種能夠高效表達(dá)外源蛋白的器官或組織來進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)活性功能蛋白的技術(shù)，這些蛋白一般是藥用蛋白或營養(yǎng)保健蛋白。第10章動物基因工程用于表達(dá)的生物反應(yīng)器包括動物血液、泌尿系統(tǒng)、精囊腺、乳腺等，還包括禽蛋和昆蟲（例如家蠶）個體等。其中動物乳腺生物反應(yīng)器是目前國際上唯一證明可以達(dá)到商業(yè)化生產(chǎn)水平的生物反應(yīng)器。據(jù)預(yù)測，2010年世界上動物乳腺生物反應(yīng)器的年產(chǎn)值將達(dá)到500億美元以上。生物反應(yīng)器的種類及應(yīng)用第10章動物基因工程第四節(jié)

基因敲除與基因治療(GeneKnockout&GeneTherapy)第10章動物基因工程

什么是基因敲除技術(shù)？基因敲除（geneknockout）是80年代初出現(xiàn)的一項新的基因工程技術(shù)。采用同源重組的方法,用體外合成的無效基因或突變基因取代相應(yīng)正?；?再應(yīng)用轉(zhuǎn)基因方法孵育出轉(zhuǎn)基因動物,即為基因敲除動物。第10章動物基因工程示例第10章動物基因工程第10章動物基因工程

基因敲除技術(shù)的應(yīng)用1、研究基因調(diào)控和基因功能；2、建立人類疾病的轉(zhuǎn)基因動物模型，為醫(yī)學(xué)研究提供材料；3、改造動物基因型，鑒定新基因和/或其新功能，研究發(fā)育生物學(xué)；4、治療遺傳病，即基因治療。5、改造生物、培育新的生物品種。第10章動物基因工程基因治療與基因疫苗基因治療(genetherapy)

是指將人的正?；蚧蛴兄委熥饔玫幕蛲ㄟ^一定方式導(dǎo)入人體靶細(xì)胞以糾正基因的缺陷或者發(fā)揮治療作用（也包括剔除或抑制某些導(dǎo)致疾病的基因），從而達(dá)到治療疾病目的的生物醫(yī)學(xué)新技術(shù)?；蛞呙缰傅氖荄NA疫苗，即將編碼外源性抗原的基因插入載體，然后導(dǎo)入人或動物體內(nèi)，讓其在宿主細(xì)胞中表達(dá)抗原蛋白，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。第10章動物基因工程傳統(tǒng)的基因治療指目的基因?qū)氚屑?xì)胞后與宿主細(xì)胞的基因組發(fā)生整合，成為宿主細(xì)胞遺傳物質(zhì)的一部分，目的基因的表達(dá)產(chǎn)物起到對疾病的治療作用。目的基因不與宿主細(xì)胞基因組發(fā)生整合，暫時表達(dá)產(chǎn)物發(fā)揮治療作用的基因治療方法叫做基因療法(genetherapeutics)。廣義的基因治療還應(yīng)包括基因調(diào)控，如利用RNAi技術(shù)抑制基因表達(dá)。基因治療的途徑第10章動物基因工程第五節(jié)

動物克隆技術(shù)(AnimalCloningTechnology)第10章動物基因工程

CreatingDolly！1997年2月22日，英國“Nature”