第七章 微生物的生長與控制課件

第七章微生物的生長與控制1第七章微生物的生長與控制生長——微生物細(xì)胞吸收營養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)行新陳代謝，當(dāng)同化作用>異化作用時，生命個體的重量和體積不斷增大的過程。繁殖——生命個體生長到一定階段，通過特定方式產(chǎn)生新的生命個體，即引起生命個體數(shù)量增加的生物學(xué)過程。發(fā)育——從生長到繁殖，是生物的構(gòu)造和機(jī)能從簡單到復(fù)雜、從量變到質(zhì)變的發(fā)展變化過程，這一過程稱為發(fā)育。個體生長——微生物細(xì)胞個體吸收營養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)行新陳代謝，原生質(zhì)與細(xì)胞組分的增加為個體生長。群體生長——群體中個體數(shù)目的增加?？梢杂弥亓?、體積、密度或濃度來衡量。（由于微生物的個體極小，所以常用群體生長來反映個體生長的狀況）個體生長個體繁殖群體生長群體生長=個體生長+個體繁殖生長與繁殖的概念2第七章微生物的生長與控制第一節(jié)微生物純培養(yǎng)分離及生長測定方法3第七章微生物的生長與控制一、獲得純培養(yǎng)的方法純培養(yǎng)(pureculture)——微生物學(xué)中把從一個細(xì)胞或一群相同的細(xì)胞經(jīng)過培養(yǎng)繁殖而得到的后代,稱純培養(yǎng).4第七章微生物的生長與控制首先將待分離的樣品進(jìn)行連續(xù)稀釋,目的是得到高度稀釋的效果,使一支試管中分配不到一個微生物.如果經(jīng)過稀釋后的大多數(shù)試管中沒有微生物生長,那么有微生物生長的試管得到的培養(yǎng)物可能就是由一個微生物個體繁殖而來的純培養(yǎng)物.這種方法適合于細(xì)胞較大的微生物.①液體稀釋法5第七章微生物的生長與控制②平板劃線分離法（StreakPlate）特點(diǎn)：快速、方便。

分區(qū)劃線（適用于濃度較大的樣品）

連續(xù)劃線（適用于濃度較小的樣品）Aninoculatingloopisusedtothinoutorganismsonthesurfaceoftheagar.6第七章微生物的生長與控制連續(xù)劃線劃線分離后平板上顯示的菌落照片7第七章微生物的生長與控制③傾注平板法（PourPlate）1ml1ml1ml1ml1ml1ml9ml9ml9ml9ml8第七章微生物的生長與控制④平板涂布分離法（SpreadPlate）簡單易行，但易造成機(jī)械損傷Liquidspecimenisspreadonthesurfaceofsolidagarwithasterilebentglassrod.9第七章微生物的生長與控制⑤選擇性培養(yǎng)分離法為了從混雜的微生物群體中分離出某種微生物，可以根據(jù)該微生物的特點(diǎn)，包括營養(yǎng)、生理、生長條件等，采用選擇培養(yǎng)的方法進(jìn)行分離。＊利用選擇培養(yǎng)基進(jìn)行直接分離＊富集培養(yǎng)10第七章微生物的生長與控制⑥單細(xì)胞（單孢子）分離法采用顯微分離法從混雜群體中直接分離單個細(xì)胞或單個個體進(jìn)行培養(yǎng)以獲得純培養(yǎng)的方法。該方法要在顯微鏡下進(jìn)行。毛細(xì)管法：用毛細(xì)管提取微生物個體，適合于較大微生物。顯微操作儀：用顯微針、鉤、環(huán)等挑取單個細(xì)胞或孢子以獲得純培養(yǎng)。小液滴法：將經(jīng)過適當(dāng)稀釋后的樣品制成小液滴，在顯微鏡下選取只含一個細(xì)胞的液滴來進(jìn)行純培養(yǎng)物的分離。11第七章微生物的生長與控制二、微生物純培養(yǎng)生長的測定方法描述不同種類、不同生長狀態(tài)的微生物生長情況，需選用不同的測定指標(biāo)。（一）微生物細(xì)胞數(shù)目的檢測法直接法（血球計數(shù)板）間接法（活菌計數(shù)法、膜過濾法）（二）微生物生長量和生理指標(biāo)測定法直接法(干重法，堆體積法)間接法（比濁法，碳、氮含量法，其它生理指標(biāo)）12第七章微生物的生長與控制1.血球計數(shù)板法13第七章微生物的生長與控制原理：將1cm2×0.1mm的薄層空間劃分為400小格，從中均勻分布地選取80或100小格，計數(shù)其中的細(xì)胞數(shù)目，換算成單位體積中的細(xì)胞數(shù)。適用范圍：個體較大細(xì)胞或顆粒，如血球、酵母菌等。不適用于細(xì)菌等個體較小的細(xì)胞，因?yàn)椋?）細(xì)菌細(xì)胞太小，不易沉降；（2）在油鏡下看不清網(wǎng)格線，超出油鏡工作距離。特點(diǎn)：快速，準(zhǔn)確，對酵母菌可同時測定出芽率，或在菌懸液中加入少量美藍(lán)可以區(qū)分死活細(xì)胞。1.血球計數(shù)板法14第七章微生物的生長與控制3.平板菌落計數(shù)法15第七章微生物的生長與控制2.平板菌落計數(shù)法★技術(shù)要求：樣品充分混勻，操作熟練快速（15~20min完成操作），嚴(yán)格無菌操作；★注意事項(xiàng)：每一支吸管只能用于一個稀釋度，樣品混勻處理，傾注平板時的培養(yǎng)基溫度；★適用范圍：中溫、好氧和兼性厭氧、能在營養(yǎng)瓊脂上生長的微生物，★誤差：多次稀釋造成的誤差是主要來源，其次還有由于樣品內(nèi)菌體分布不均勻、以及不當(dāng)操作16第七章微生物的生長與控制4.液體稀釋法10n10n-210n-117第七章微生物的生長與控制4.薄膜過濾計數(shù)法常用該法測定含菌量較少的空氣和水中的微生物數(shù)目。將定量的樣品通過薄膜（硝化纖維素薄膜、醋酸纖維薄膜）過濾，菌體被阻留在濾膜上，取下濾膜進(jìn)行培養(yǎng)，然后計算菌落數(shù)，可求出樣品中所含菌數(shù)。18第七章微生物的生長與控制5.干重法將一定量的菌液中的菌體通過離心或過濾分離出來,然后烘干(干燥溫度可采用105℃、100℃或80℃)、稱重。一般干重為濕重的10%—20%，而一個細(xì)菌細(xì)胞一般重約10-12—10-13g。該法適合菌濃較高的樣品。舉例：大腸桿菌一個細(xì)胞一般重約10–12~10–13g，液體培養(yǎng)物中細(xì)胞濃度達(dá)到2×109個/ml時，100ml培養(yǎng)物可得10~90mg干重的細(xì)胞。19第七章微生物的生長與控制6.比濁法原理是在一定范圍內(nèi)，菌懸液中的細(xì)胞濃度與混濁度成正比，即與光密度成正比，菌數(shù)越多，光密度越大。因此，借助于分光光度計，在一定波長下測定菌懸液的光密度，就可反應(yīng)出菌液的濃度。特點(diǎn)：快速、簡便；但易受干擾。20第七章微生物的生長與控制7.生理指標(biāo)法測含氮量蛋白質(zhì)是細(xì)胞的主要物質(zhì)，含量穩(wěn)定，而氮是蛋白質(zhì)的主要成分，通過測含氮量就可推知微生物的濃度。一般細(xì)菌含氮量為干重的12.5%，酵母菌為7.5%，霉菌為6.0%，根據(jù)一定體積培養(yǎng)液中的含氮量再乘以6.25，就可測得粗蛋白的含量。其他方法含碳、磷、DNA、RNA、耗氧量、消耗底物量、產(chǎn)二氧化碳、產(chǎn)酸、產(chǎn)熱、粘度等，都可用于生長量的測定。21第七章微生物的生長與控制第二節(jié)微生物的生長規(guī)律22第七章微生物的生長與控制由于微生物細(xì)胞極其微小，研究其個體生長存在著技術(shù)上的困難。同步生長的概念：一個細(xì)胞群體中各個細(xì)胞都在同一時間進(jìn)行分裂的狀態(tài)，稱為同步生長（synchronousgrowth），進(jìn)行同步分裂的細(xì)胞稱為同步細(xì)胞。同步細(xì)胞群體在任何一時刻都處在細(xì)胞周期的同一相，彼此間形態(tài)、生化特征都很一致，因而是細(xì)胞學(xué)、生理學(xué)和生物化學(xué)等研究的良好材料。一、微生物的個體生長和同步生長23第七章微生物的生長與控制二、微生物的群體生長☆無分支單細(xì)胞微生物主要包括細(xì)菌和酵母菌，其群體生長是以群體中細(xì)胞數(shù)量的增加來表示的，☆由一個細(xì)胞分裂成為兩個細(xì)胞的時間間隔稱為世代，一個世代所需的時間就是代時（Ｇenerationtime,G），代時也就是群體細(xì)胞數(shù)目擴(kuò)大一倍所需時間，有時也稱為倍增時間?！钣覉D表示的是一個細(xì)胞經(jīng)過若干代分裂后的情況。右圖可見，每經(jīng)過一個代時，細(xì)胞數(shù)目就增加一倍，呈指數(shù)增加，因而被稱為指數(shù)生長，這就是單細(xì)胞群體生長的特征。1.無分支單細(xì)胞微生物的群體生長特征24第七章微生物的生長與控制★指數(shù)生長可以用下式表示：

b=B×2nB,b和t可由試驗(yàn)獲得，n可通過上式計算得出，將等式兩側(cè)取對數(shù)重排后得：lgb=lgB+nlg2

式中：B

為起始細(xì)胞數(shù)目，

b

為指數(shù)生長某個時刻t時的細(xì)胞數(shù)目，

n

為世代數(shù)n==指數(shù)生長25第七章微生物的生長與控制例如：一培養(yǎng)液中微生物數(shù)目由開始的12，000（B），經(jīng)4h（

t）后增加到49，000，000（b），這樣，n＝(lg4.9×107－lg1.2×104）÷0.301＝12★借助于n和t，還可以計算出不同培養(yǎng)條件下的代時G，

G＝t/n在本例中，G＝4×60/12＝20min∴該種微生物的代時為20分鐘。在4小時內(nèi)共繁殖了12代。26第七章微生物的生長與控制2.無分支單細(xì)胞微生物的群體生長曲線☆以細(xì)菌為例介紹無分支單細(xì)胞微生物群體生長規(guī)律，其結(jié)論也基本適用于酵母菌?！钌L曲線代表了細(xì)菌在新的環(huán)境中從開始生長、分裂直至死亡的整個動態(tài)變化過程。☆每種細(xì)菌都有各自的典型生長曲線，但它們的生長過程卻有著共同的規(guī)律性。一般可以將生長曲線劃分為四個時期。27第七章微生物的生長與控制將少量單細(xì)胞的純培養(yǎng)，接種到一恒定容積的新鮮液體培養(yǎng)基中，在適宜條件下培養(yǎng)，每隔一定時間取樣，測菌細(xì)胞數(shù)目。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，以細(xì)菌增長數(shù)目的對數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制所得的曲線。生長曲線的制作28第七章微生物的生長與控制典型的生長曲線

（Growthcurve）延滯期對數(shù)期穩(wěn)定期衰亡期時期的劃分：按照生長速率常數(shù)（growthraceconstant）不同29第七章微生物的生長與控制其它名稱：停滯期、調(diào)整期、適應(yīng)期1.現(xiàn)象：活菌數(shù)沒增加，曲線平行于橫軸。2.特點(diǎn)：生長速率常數(shù)=0細(xì)胞形態(tài)變大或增長細(xì)胞內(nèi)RNA特別是rRNA含量增高，原生質(zhì)嗜堿性增強(qiáng)合成代謝活躍（核糖體、酶類、ATP合成加快），易產(chǎn)生誘導(dǎo)酶對外界不良條件敏感，（如氯化鈉濃度、溫度、抗生素等化學(xué)藥物）3.原因：適應(yīng)新的環(huán)境條件，合成新的酶，積累必要的中間產(chǎn)物①.延滯期（lagphase）30第七章微生物的生長與控制◆菌種：繁殖速度較快的菌種的延遲期一般較短；◆接種物菌齡：用對數(shù)生長期的菌種接種時，其延遲期較短，甚至檢查不到延遲期；◆接種量：一般來說，接種量增大可縮短甚至消除延遲期（發(fā)酵工業(yè)上一般采用1/10的接種量）；◆培養(yǎng)基成分：

在營養(yǎng)成分豐富的天然培養(yǎng)基上生長的延滯期比在合成培養(yǎng)基上生長時短；

接種后培養(yǎng)基成分有較大變化時，會使延滯期加長，所以發(fā)酵工業(yè)上盡量使發(fā)酵培養(yǎng)基的成分與種子培養(yǎng)基接近?！镉绊懷舆t期長短的因素：31第七章微生物的生長與控制認(rèn)識延遲期的特點(diǎn)及形成原因?qū)?shí)踐的指導(dǎo)意義：◆在發(fā)酵工業(yè)上需設(shè)法盡量縮短延遲期；采取的縮短lagphase的措施有：①增加接種量；（群體優(yōu)勢----適應(yīng)性增強(qiáng)）②采用對數(shù)生長期的健壯菌種；③調(diào)整培養(yǎng)基的成分，在種子基中加入發(fā)酵培養(yǎng)基的某些成分。④選用繁殖快的菌種◆在食品工業(yè)上，盡量在此期進(jìn)行消毒或滅菌32第七章微生物的生長與控制②.對數(shù)期（logarithmicphase）其他名稱：指數(shù)期現(xiàn)象：細(xì)胞數(shù)目以幾何級數(shù)增加，其對數(shù)與時間呈直線關(guān)系。

特點(diǎn)：生長速率常數(shù)最大，即代時最短細(xì)胞進(jìn)行平衡生長，菌體大小、形態(tài)、生理特征等比較一致代謝最旺盛細(xì)胞對理化因素較敏感影響因素：菌種營養(yǎng)成分營養(yǎng)物濃度﹡培養(yǎng)溫度33第七章微生物的生長與控制應(yīng)用意義：①由于此時期的菌種比較健壯，生產(chǎn)上用作接種的最佳菌齡；②發(fā)酵工業(yè)上盡量延長該期，以達(dá)到較高的菌體密度③食品工業(yè)上盡量使有害微生物不能進(jìn)入此期④是生理代謝及遺傳研究或進(jìn)行染色、形態(tài)觀察等的良好材料。34第七章微生物的生長與控制營養(yǎng)物濃度與對數(shù)期生長速率和產(chǎn)量作用方式：影響微生物的生長速率和總生長量生長限制因子：凡是處于較低濃度范圍內(nèi)，可影響生長速率和菌體產(chǎn)量的營養(yǎng)物就稱生長限制因子8.0mg/ml6.0mg/ml4.0mg/ml2.0mg/ml1.0mg/ml0.5mg/ml0.2mg/ml0.1mg/ml只最大收獲量受影響生長速度和最大收獲量受影響時間細(xì)胞數(shù)或菌體量35第七章微生物的生長與控制③.穩(wěn)定期（stationaryphase）又稱：恒定期或最高生長期特點(diǎn)：①新增殖的細(xì)胞數(shù)與老細(xì)胞的死亡數(shù)幾乎相等，微生物的生長速率處于動態(tài)平衡，培養(yǎng)物中的細(xì)胞數(shù)目達(dá)到最高值。②細(xì)胞分裂速度下降，開始積累內(nèi)含物，產(chǎn)芽孢的細(xì)菌開始產(chǎn)芽孢。③此時期的微生物開始合成次生代謝產(chǎn)物，對于發(fā)酵生產(chǎn)來說，一般在穩(wěn)定期的后期產(chǎn)物積累達(dá)到高峰，是最佳的收獲時期。產(chǎn)生原因：

營養(yǎng)物尤其是生長限制因子的耗盡

有害代謝廢物的積累（酸、醇、毒素等）

物化條件不合適;36第七章微生物的生長與控制應(yīng)用意義：1）發(fā)酵生產(chǎn)形成的重要時期（抗生素、氨基酸等），生產(chǎn)上應(yīng)盡量延長此期，提高產(chǎn)量，措施如下：補(bǔ)充營養(yǎng)物質(zhì)（補(bǔ)料）

調(diào)pH

調(diào)整溫度

2）穩(wěn)定期細(xì)胞數(shù)目及產(chǎn)物積累達(dá)到最高。生長產(chǎn)量常數(shù)（Y，或生長得率，growthyield）：概念：表示微生物對基質(zhì)利用效率的高低

Y=菌體干重/消耗營養(yǎng)物質(zhì)的濃度

根據(jù)產(chǎn)量常數(shù)可確定微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的需要量如：Y=0.5，表示要得到5g菌體，需某營養(yǎng)物（葡萄糖）10g。Y=x–x0C0

–C=x–x0C037第七章微生物的生長與控制④.衰亡期（declinephase）特點(diǎn)：①細(xì)胞死亡數(shù)增加，死亡數(shù)大大超過新增殖的細(xì)胞數(shù)，群體中的活菌數(shù)目急劇下降，出現(xiàn)“負(fù)生長”。②細(xì)胞內(nèi)顆粒更明顯，細(xì)胞出現(xiàn)多形態(tài)、畸形或衰退形，芽孢開始釋放。③因菌體本身產(chǎn)生的酶及代謝產(chǎn)物的作用，使菌體死亡、自溶等，發(fā)生自溶的菌生長曲線表現(xiàn)為向下跌落的趨勢。衰亡期比其他各時期時間長，它的長短也與菌種和環(huán)境條件有關(guān)。產(chǎn)生原因：生長條件的進(jìn)一步惡化，使細(xì)胞內(nèi)的分解代謝大大超過合成代謝，繼而導(dǎo)致菌體的死亡38第七章微生物的生長與控制原理：當(dāng)微生物在單批培養(yǎng)方式下生長達(dá)到對數(shù)期后期時，一方面以一定