AbMole-抑制劑、細(xì)胞因子、人源單抗在腫瘤類器官中的極致應(yīng)用

AbMole——抑制劑、細(xì)胞因子、人源單抗在腫瘤類器官中的極致應(yīng)用惡性腫瘤作為一種復(fù)雜且多變的疾病，一直是科學(xué)家們熱衷研究和極力想攻克的重大難題。近年來，腫瘤類器官技術(shù)的出現(xiàn)，為癌癥的研究開辟了一條全新的道路，讓我們能夠更深入地了解腫瘤的生長機(jī)制，并為個性化治療提供了可能。腫瘤類器官技術(shù)簡介癌癥并不是一種單因素的疾病，在不同個體之間（瘤間）甚至同一個體內(nèi)部（瘤內(nèi)）都存在異質(zhì)性。通過實(shí)驗測試腫瘤對抗癌化合物的敏感性，以尋求適合每個個體的療法就成為了目前腫瘤研究的熱點(diǎn)之一。已有的一些技術(shù)，例如腫瘤細(xì)胞系的二維培養(yǎng)、來自患者腫瘤的異種移植等方法，但往往由于造模效率不高、難以復(fù)制體內(nèi)異質(zhì)性、基因組欠穩(wěn)定、培養(yǎng)周期較長等原因，導(dǎo)致臨床轉(zhuǎn)化率較低。腫瘤類器官是一種從腫瘤組織中提取的癌細(xì)胞三維培養(yǎng)物，在基因組和功能方面與原始細(xì)胞相似，是在器官水平上對原代組織的病理特征進(jìn)行模擬，可用于腫瘤生物學(xué)的研究和藥物敏感性篩選。腫瘤類器官的培養(yǎng)腫瘤類器官的一般培養(yǎng)流程如圖1所示，首先是獲得腫瘤組織。隨后用胰酶、膠原酶和DNA酶消化并用培養(yǎng)基重懸以獲得單細(xì)胞懸液，不同腫瘤的消化時間長短是不同的。為去除未消化的細(xì)胞，還需要用特定孔徑的細(xì)胞篩過濾懸液。接著轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的基底膜提取物（BME）中，隨后將BME與腫瘤細(xì)胞的混合物滴在預(yù)熱的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)板底部，將培養(yǎng)板置于37℃培養(yǎng)箱中使BME凝固。在培養(yǎng)過程中常采用DMEM/F12作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，因其含有較為豐富的營養(yǎng)因子，廣泛用于增殖培養(yǎng)。除了基礎(chǔ)培養(yǎng)基之外，還需隨著腫瘤類型的不同而額外加入不同的細(xì)胞因子，但基本上都包括以下四種：生長因子主要是酪氨酸受體激酶的配體，包括表皮生長因子（Epidermalgrowthfactor，EGF）、成纖維細(xì)胞生長因子（Fibroblastgrowthfactor，F(xiàn)GF、神經(jīng)生長因子（nervegrowthfactor，NGF）等，上述的三種生長因子可刺激上皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤生長。圖1腫瘤類器官的培養(yǎng)流程和藥物敏感性篩選Wnt信號通路激活劑Wnt信號通路是一個復(fù)雜的蛋白質(zhì)作用網(wǎng)絡(luò)，在胚胎發(fā)育、癌癥以及成年動物的正常生理過程中均發(fā)揮著重要作用。類器官領(lǐng)域中的Wnt激活劑主要是R-spondin1（RSPO1），RSPO1可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖與分化，從而支持類器官中多種細(xì)胞類型的形成和維持。TGF-β超家族抑制劑最常使用的TGF-β抑制劑是Noggin和A83-01，A83-01是一種有效的TGF-β的I型受體ALK5、ALK4和ALK7的抑制劑，A83-01可以抑制腫瘤類器官的增殖，有助于維持腫瘤類器官的穩(wěn)定性和長期增殖能力，這對于研究腫瘤生長機(jī)制、評估藥物療效等具有重要意義。骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）是TGF-β超家族的一個重要亞類，Noggin通過抑制BMP信號通路的活性來維持腫瘤類器官中細(xì)胞的正常增殖和分化狀態(tài)。ROCK抑制劑Y27632是類器官領(lǐng)域中使用最為普遍的Rho相關(guān)蛋白激酶（ROCK）的抑制劑，Y27632可以直接結(jié)合ROCK的催化位點(diǎn)以抑制其激酶活性，因此Y-27632可以間接抑制Rho介導(dǎo)的應(yīng)力纖維的形成，因此Y-27632可以避免細(xì)胞因過度收縮而導(dǎo)致的死亡。Y27632還可以保持干細(xì)胞的干性，對于一些離體的組織，例如腫瘤組織可以通過保存在含有Y27632的溶液中以延長保存時間。在腫瘤類器官培養(yǎng)完成后還需要進(jìn)行鑒定，可通過組織切片、HE染色、測序分析、免疫熒光等方法去驗證腫瘤類器官與體內(nèi)腫瘤的一致性以便于開展后續(xù)的藥物篩選。腫瘤類器官的藥物敏感性篩選腫瘤類器官因其與患者腫瘤組織具有高度相似性，所以它可作為一種模型來測試抗癌化合物的效果。通過將高通量與自動化等技術(shù)相結(jié)合，可以在相對短的時間內(nèi)篩選出潛在的更有效力的藥物，一定程度上也可以降低耐藥性的出現(xiàn)（圖2）。圖2腫瘤類器官藥物敏感性篩選的一般流程腫瘤類器官的藥物敏感性篩選的總體流程是首選將要篩選的藥物構(gòu)成文庫，一般是先配制特定濃度的藥物母液，然后按照梯度稀釋至96或者384孔板中。隨后構(gòu)建腫瘤類器官并將類器官轉(zhuǎn)入孔板中，待其培養(yǎng)完成后按照設(shè)計好的布局加入藥物，最后分析對應(yīng)孔板中的細(xì)胞活力以采集不同藥物的IC50、腫瘤生長抑制率等數(shù)據(jù)。藥物文庫的組成用于腫瘤類器官藥物敏感性篩選的藥物一般是一些常見的抗腫瘤抑制劑或者人源化單抗，并且還可以按照設(shè)計好的方案進(jìn)行聯(lián)合藥敏測試。這里需注意的是由于類器官不具有完整的機(jī)體代謝能力和環(huán)境，因此待測藥物一般選擇其活性形式而非前體藥物。常見的抗腫瘤抑制劑包括：Afatinib、Cisplatin、Dabrafenib、LY2157299、Selumetinib等，它們可以抑制DNA合成和特定的細(xì)胞生長信號通路如EGF、TGF-β等，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。人源化單抗是近些年關(guān)注度極高的腫瘤靶向產(chǎn)品，這種特殊設(shè)計的單克隆抗體可結(jié)合腫瘤細(xì)胞并通過多種方式發(fā)揮作用：阻斷細(xì)胞生長相關(guān)信號通路、通過抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性（ADCC）、阻止腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸、抑制血管生成等。在結(jié)合基因工程手段對抗體進(jìn)行人源化后進(jìn)一步降低了單抗的免疫原性，其治療效果和副作用得到了進(jìn)一步的改善，目前常見用于腫瘤藥物敏感性篩選的人源化單抗主要有：用于免疫檢查點(diǎn)抑制的納武利尤單（Nivolumab，抗PD-1）、帕博利珠單抗（Pembrolizumab，抗PD-1）和曲美木單抗（Tremelimumab，抗CTLA-4），用于血管生成抑制的貝伐珠單抗（Bevacizumab），以及靶向治療單抗如帕尼單抗（Panitumumab，靶向EGFR）、 帕妥珠單抗（Pertuzumab，靶向HER2）等。細(xì)胞活力檢測以往對二維培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行活力檢測時常用的方法是MTT，但是對于三維體系細(xì)胞的檢測而言上述方法由于滲透不佳、分布不均等問題導(dǎo)致準(zhǔn)確度較差。增強(qiáng)型ATP細(xì)胞活力檢測試劑盒采用生物發(fā)光法，即利用熒光素酶與其底物熒光素之間的反應(yīng)產(chǎn)生熒光，該反應(yīng)需要消耗ATP并且發(fā)光信號的強(qiáng)度與ATP的量呈正比（圖3），由于ATP存在于所有代謝活躍的細(xì)胞中，而在死細(xì)胞中幾乎不存在，因此是鑒定活細(xì)胞最合適的標(biāo)志物之一。增強(qiáng)型ATP細(xì)胞活力檢測試劑盒具有多種優(yōu)點(diǎn)，包括：超高信號穩(wěn)定性、超高靈敏度、超寬線性范圍，目前已成腫瘤類器官研究領(lǐng)域細(xì)胞活力檢測的最佳方案。圖3增