埃博拉出血熱實驗室檢測方案

PAGEPAGE2附件埃博拉出血熱實驗室檢測方案（第一版）埃博拉出血熱是一種嚴重的急性傳染病，病死率高,病人感染埃博拉病毒后血液中可維持較高的病毒載量，可能發(fā)生人-人傳播和院內(nèi)感染。直接接觸傳播是本病最主要的傳播途徑?？梢酝ㄟ^接觸病人和被感染動物的血液、分泌物、排泄物及其污染物等而感染。埃博拉出血熱在臨床表現(xiàn)上容易和其他病毒性出血熱混淆，需要進行實驗室診斷。為及時檢測和發(fā)現(xiàn)埃博拉出血熱病例，防止疫情擴散，規(guī)范實驗室檢測程序，提高檢測質(zhì)量，特制定本方案。檢測對象（一）疑似患者。（二）密切接觸者。（三）當臨床救治需要時，對患者開展檢測。二、樣本采集、保存和運輸（一）臨床標本采集用無菌真空干燥管，采集疑似病例、密切接觸者以及恢復期病例非抗凝血，每份5mL（附件1），標記清楚后4℃保存，填寫基本信息（附表1），送指定的具有在BSL-3級生物安全實驗室開展埃博拉出血熱檢測資質(zhì)的國家、省級疾控中心或其他機構(gòu)。（二）標本保存、運送未分離血清的全血標本應4℃保存；血清標本應-70℃以下保存，或可-20℃以下保存不超過1周。標本運輸應按照相關生物安全規(guī)定，采取A類包裝，采用低溫冷藏運輸，避免凍融。三、檢測內(nèi)容（一）實驗室檢測主要包括埃博拉病毒核酸檢測和IgM、IgG抗體檢測。（二）復核檢測1．具有開展埃博拉病毒檢測資質(zhì)的機構(gòu)應將檢測所有陽性和部分陰性的標本送中國疾病預防控制中心病毒病所進行復核檢測。2.對檢測陽性的標本進行病毒基因組序列分析。3.實驗室檢測陰性的疑似病例，應連續(xù)采集系列血標本進行病毒核酸、IgM、IgG抗體檢測。四、實驗室檢測方法（一）病原學檢測1．核酸檢測：為目前早期診斷、早期發(fā)現(xiàn)埃博拉出血熱病例的主要檢測方法。采用熒光定量PCR進行病毒核酸檢測，患者標本中擴增到特異性核酸，可確診埃博拉病毒感染（附件2）。傳統(tǒng)RT-PCR因易出現(xiàn)污染使用受限，但可以獲得病毒基因序列。2.病毒抗原檢測：用酶聯(lián)免疫法檢測埃博拉病毒核蛋白抗原。病毒抗原檢測陽性可確診（附件3）（二）血清學檢測1.血清特異性IgM抗體：采用捕獲法ELISA方法檢測。疑似病例具有疫區(qū)旅行史或患者接觸史，IgM抗體陽性，可確診（附件4）。2.血清特異性IgG抗體：目前主要采用間接法ELISA或免疫熒光方法檢測IgG抗體。單份血清埃博拉病毒IgG抗體陽性為曾感染埃博拉病毒，雙份血清埃博拉病毒IgG抗體陽轉(zhuǎn)或恢復期滴度較急性期4倍或者以上增高者，可確診。（附件5）（三）結(jié)果的報告和反饋實驗室檢測結(jié)果應及時反饋標本送檢單位，盡快上報上級主管部門（附表2）。五、生物安全按照《病原微生物實驗室生物安全管理條例》等相關規(guī)定要求，做好生物安全工作。實驗室檢測1．所有未經(jīng)培養(yǎng)的感染性材料的操作，如樣本分裝、滅活等處理應在BSL-3級實驗室；2．所有標本檢測前應首先60℃1小時滅活，滅活樣本的核酸檢測和血清學檢測均應在BSL-3級實驗室進行；3．在進行感染性材料操作時，每次操作標本不宜超過20份。（二）個人防護在進行上述實驗操作過程中，可能存在由病人標本導致的人員感染以及污染環(huán)境的機會，必須做好防護。在實驗室處理感染性標本時應嚴格按照操作規(guī)范進行。實驗室工作人員應脫去個人衣服和各種首飾，穿著實驗專用服裝和鞋，再穿可遮蓋全身的防護服。直接處理感染性樣本時，應戴N95或以上口罩、護目鏡、乳膠手套及防滲漏防護服等。所有涉及感染性材料的操作均應在三級生物安全柜內(nèi)進行。必要時可使用正壓頭盔。標本離心時，應使用有密封蓋的離心桶，在生物安全柜內(nèi)打開離心轉(zhuǎn)子。實驗中不得使用注射器針頭等銳器。實驗人員有體表開放式傷口時不宜參加實驗活動，需要進行實驗活動時，應使用防水布包扎傷口后方可進行實驗活動。在標本的采集、包裝和實驗室檢測等過程中所產(chǎn)生的醫(yī)療廢物，具有生物危險性，應當按照《醫(yī)療廢物管理條例》和《醫(yī)療衛(wèi)生機構(gòu)醫(yī)療廢物管理辦法》等相關規(guī)定及時處理。

附件1．血液標本采集操作程序2．埃博拉病毒核酸檢測方法3．酶聯(lián)免疫法檢測埃博拉病毒核蛋白抗原4．IgM捕捉ELISA法（MacELISA）檢測埃博拉病毒IgM抗體5．酶聯(lián)免疫法檢測埃博拉病毒IgG抗體附表1．疑似埃博拉出血熱病人檢材送檢一覽表2．埃博拉出血熱實驗室檢測結(jié)果一覽表

附件1.血液標本采集操作程序1目的采集埃博拉患者靜脈血，改善血樣采集的質(zhì)量，保護醫(yī)護人員和患者采血安全。2適用范圍醫(yī)療機構(gòu)、疾病預防控制機構(gòu)和檢疫機構(gòu)從事血樣采集工作人員，采集疑似埃博拉出血熱患者、疑似患者及密切接觸者靜脈血。3職責操作人員：負責按照本操作細則對實驗動物進行操作。監(jiān)督人員：負責現(xiàn)場對血標本采集是否規(guī)范進行監(jiān)督并協(xié)助操作人員工作。部門負責人：負責對標本采集、保存、運輸?shù)鹊木C合管理，以及對操作報告和記錄表格的審核。4實驗材料防護用品：包括工作服、鞋，可遮蓋全身的防護服、N95或以上口罩、護目鏡、尺寸合適的乳膠手套、防滲漏防護服或正壓防護服。采血用品：手部清潔衛(wèi)生用品（酒精擦拭子等）、一次性穿刺針采血設備，并保證這些物品有足夠數(shù)量；足夠的樣品試管等。當天制備的含氯消毒劑。5采血場所疑似患者應隔離在單獨的病房，相鄰的服務間作為唯一的進口，服務間內(nèi)備有除了病人常規(guī)護理的材料外應具備手套、防護服和防護面具等，同時要裝備有洗手的設施和裝有消毒液的桶。病人房間和服務間及外側(cè)環(huán)境相比應設為負壓，空氣不能再次循環(huán)流通。如果不具備上述條件，可用相鄰的房間提供足夠的安全空間。6采集步驟6.1個人防護血液采集人員和監(jiān)督人員應脫去個人衣服和各種首飾，穿著實驗專用服裝和鞋，再穿可遮蓋全身的防滲漏防護服，戴N95或以上口罩、護目鏡、雙層無菌乳膠手套。患者有嚴重出血等臨床表現(xiàn)時，應戴正壓防護頭盔。6.2器材準備收集所需器材，并將其放在安全、方便可及的托盤或推車上，確保肉眼可觀察到所有設備。6.3患者確認如果患者是成年人并且意識清醒，應向患者做自我介紹，并詢問患者的全名，檢查實驗室表格是否與患者的身份相符（即根據(jù)實驗室表格填寫內(nèi)容，核對患者的詳細內(nèi)容，以確保正確的身份識別）；詢問是否有過敏、恐慌或曾經(jīng)暈針暈血史。6.4穿刺部位消毒，采用醫(yī)院靜脈血采集常規(guī)消毒措施后采血6.5正確順序抽取樣本給采集的血液樣品正確編號，避免試管間的添加劑交叉污染，放4℃暫時保存，以便進行安照相關生物安全規(guī)定包裝、送檢。6.6清潔被污染表面。把血液污染的針頭或耗材棄于耐刺銳器容器中。核對標簽和表格。標簽必須清晰標明實驗室所需的全部信息，一般是患者的姓和名、病史檔案號碼、出生日期、采血的日期和時間。將使用過的物品棄于有明顯生物安全標識的廢棄物分類容器中。再次進行手部清潔衛(wèi)生工作。樣本包裝送檢前，重新核對試管上的標簽和表格。檢查穿刺點，確認不再流血，告訴患者整個過程已經(jīng)結(jié)束，并指示患者休息。7樣本運輸準備按國家生物安全規(guī)定，采用A類按一類病原微生物包裝運輸。8濺溢物的清理如果有血液濺溢出現(xiàn)（例如在采血區(qū)域或運輸途中有血樣打破，或在采血過程中患者出血過多），必須按照實驗室意外事故處理。安全操作程序如下：如果有大量血液濺溢，可能會污染防護服，首先對防護服噴灑含1%的次氯酸鈉的消毒劑。及時通知上級負責人，退出采血區(qū)域，去除防護服。由另一名工作人員穿上防護服，帶好N-95或以上口罩或正壓頭盔。使用紙巾輕輕的覆蓋濺出物，并將1%的次氯酸鈉傾倒在紙巾上，傾倒順序是由濺出物的四周向中心移動。保持足夠的作用時間（30分鐘），然后將廢物清除。重復處理一次，并把紙巾棄于感染性廢棄物桶內(nèi)。如果血液意外接觸到了皮膚、粘膜或被刺傷，應用0.5%碘伏消毒液、75%酒精、75%酒精洗必泰擦拭消毒，使用清水或肥皂水徹底清洗；粘膜應用大量清水沖洗或0.05%碘伏沖洗。必須上報整個意外過程。在醫(yī)院外運輸血樣時要給運輸車輛裝備血液濺溢處理工具和消毒劑。9注意事項9.1采集埃博拉出血熱患者血樣會給醫(yī)護人員帶來風險，要杜絕采血過程中的危險操作。包括：用雙手將使用過的針頭回套；回套、拆卸真空管和試管針管架；重復使用可能已被血液污染的壓脈帶及真空管的試管針管架；單獨給神志糊涂或缺乏指導的患者采血時，這些患者可能突然移動身體而導致針扎傷害發(fā)生。由于采血一般使用較大的針頭穿刺進入血管內(nèi)采集血液，針頭可能攜帶大量血液，一旦發(fā)生意外針刺事件，可能比其他銳器刺傷更容易發(fā)生感染。9.2采血時應注意：9.2.1要在每次操作或接觸每一位患者時更換一次性手套和防護服，不要使用同一雙手套和防護服對多個患者進行采血。9.2.2在采血和抽取血樣時使用一次性裝置，不要使用同一個注射器、針頭或穿刺針采集多個患者血樣。9.2.3要立即將使用過的裝置丟棄于放置銳器的牢固容器中（針頭和注射器應作為一個整體進行處置），不要將赤裸的針頭棄置于銳器容器外。9.2.4若針頭回套不可避免，要用單手技術(shù)（將針帽置于操作臺面上，僅使用一只手引導所使用的針尖進入針帽；然后用消毒液清潔桌面；將針帽背靠于一個穩(wěn)固的垂直面，開口朝向采血者，然后將使用過的針頭插入；一旦針尖被蓋上，就垂直提起針頭和注射器，使用另一只手將針帽套牢固定在注射器上）或用止血鉗輔助，不要用雙手回套9.2.5要用防開蓋的密封銳器容器，不要填充過滿，也不要傾倒銳器容器9.2.6要在針頭插入樣品管的橡膠塞前，將實驗樣品管放置在一個穩(wěn)固的架子上，不要一只手握著實驗樣品管，同時另一只手將針頭插入橡膠塞。9.2.7要在受到針頭或銳器傷害時立即報告，并尋求援助。

附件2.埃博拉病毒核酸檢測方法1目的疑似埃博拉患者血標本中病毒核酸的提取及PCR檢測。2適用范圍適用于標本中埃博拉病毒核酸檢測。3實驗前準備3.1核對被檢樣品（血清或血漿）患者的姓名、編號及檢測項目等。3.2檢測前應將60℃1小時熱滅活的待測樣品置于BSL-3實驗室生物安全柜內(nèi)的冰上。4檢測項目及參數(shù)本方法檢測項目為檢測血標本中埃博拉病毒核酸。5檢測儀器設備和材料實時定量核酸擴增檢測儀，常規(guī)核酸擴增檢測儀，RNA提取試劑盒，一步法RT-PCR擴增試劑盒，一步法實時定量RT-PCR擴增試劑盒，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒等。6檢測的環(huán)境條件在滅活標本中提取埃博拉病毒RNA的實驗要求在BSL-2及以上實驗室操作。7實驗步驟7.1實驗準備a.在滅活標本中提取埃博拉病毒RNA要求在BSL-3級別實驗室操作。b.進入實驗場所之前，要事先準備好所需試劑，樣品。預約實驗場所，并看前一位實驗者是否已經(jīng)清場。7.2RNA的提取7.2.1使用QIAampViralRNAMini試劑盒提取血清標本中病毒RNA（使用其他試劑盒或方法提取病毒RNA的應參照相應試劑盒說明書或?qū)嶒炇也僮魇謨裕?。a.吸取560μl包含載體RNA的AVL緩沖液至1.5ml的離心管中。b.向上述的液體中加入140μl樣品，脈沖渦旋式混勻15秒，室溫孵育10分鐘，簡單離心使離心管頂端液體落到底部。c.在樣品中加入560μl96－100％的乙醇，混勻15秒，再簡單離心。d.小心將630μl液體加入未浸濕的QIAamp小柱中，蓋好蓋，離心8000rpm/min1min,棄去收集管，將柱子置于一新的2ml收集管上。e.打開QIAamp小柱的蓋子，重復步驟6，直至樣品全部離心。f.打開蓋子，向柱中加入500μlAW1緩沖液，蓋好蓋，離心8000rpm/min1min，棄去收集管，將柱子置于一新的2ml收集管上。g.打開蓋子，加入500μlAW2緩沖液，蓋好蓋，離心14，000rpm/min3min。將柱子置于一新的2ml收集管上，空離1min。h.將柱子置于一新的1.5ml離心管上，加入50μlAVE洗脫緩沖液，室溫孵育1min,離心8000rpm/min1min。7.2.2RNeasyMiniKit提取組織標本或血塊或血細胞標本病毒RNA（使用其他試劑盒或方法提取病毒RNA的應參照相應試劑盒說明書或?qū)嶒炇也僮魇謨裕?。a.從Kit中取出RLT液，根據(jù)標本數(shù)量分裝適量RLT液按照1：100體積比分別加入β-巰基乙醇，分裝至相應的預先標記好的微量離心管中，每管600μL。b.將150μl組織研磨混懸液分別加入相應的RLT液管中，充分混勻。c.混勻后依次加入750μl70％的乙醇，充分混勻。d.從Kit中取出帶收集管的濾柱，打開包裝將其做好標記。取步驟2中的混合液750μl加入濾柱中，12000rpm，離心15s，棄收集管中的離心液。e.濾柱仍放回收集管上，將步驟2剩余的混合液全部轉(zhuǎn)入濾柱中，12000rpm，離心15s，棄離心液；f.于濾柱中加入700μlWashBufferRW1液，12000rpm，離心15s。g.從QIAGENRNeasyMiniKit中取一支干凈的2mL收集管，將離心后的濾柱移到新的收集管上，加入500μlWashBufferRPE液，12000rpm，離心15s。h.棄收集管中的離心液，再于濾柱中加入500μlWashBufferRPE液，13000～14000rpm，離心2min。i.將濾柱移到一個無RNA酶的干凈的1.5mLeppendorf管上，向濾柱中加入30～50μl的RNase-freeWater,室溫靜置1～3min。j.12000rpm，離心1min，離心液即為病毒RNA，立即檢測或-70℃以下保存。7.3實時定量RT-PCR法分型檢測埃博拉病毒核酸7.3.1引物與探針引物/探針序列熒光標記檢測引物探針1ZEBOV-FCGCCGAGTCTCACTGAATCTGZEBOV-RAGTTGGCAAATTTCTTCAAGATTGTZEBOV-PFAM-CGGCAAAGAGTCATCCCAGTGTATCAAGTAA-BHQ1FAM/BHQ-1檢測引物探針2EBOGP1D-fwdTGGGCTGAAAAYTGCTACAATCEBOGP1D-revCTTTGTGMACATASCGGCACEBOGP1DZ-PrbFAM-CTACCAGCAGCGCCAGACGG-BHQ1FAM/BHQ-17.3.2實時熒光定量RT-PCR擴增實時熒光定量RT-PCR擴增反應配置體系：RNA模板5μl，酶0.5μl，緩沖液12.5μl，引物各0.5μl(共4對,8條)，探針各0.25μl，加水至總體積25μl。推薦反應條件為50℃30min，95℃2min，95℃15s、60℃30s反應40個循環(huán)。7.3.3結(jié)果判斷以定量熒光PCR反應的前3～15個循環(huán)的熒光信號作為本底信號，以本底信號標準差的10倍作為熒光閾值，標本擴增產(chǎn)生的熒光信號達到熒光閾值時所對應的循環(huán)數(shù)為循環(huán)閾值（Ct值），以Ct<35熒光信號數(shù)據(jù)線性化處理后對應循環(huán)數(shù)生成的曲線圖成“S”形的標本，可判斷為相應的埃博拉病毒核酸檢測陽性。7.3.4意義熒光定量PCR是一種靈敏、特異、低污染的埃博拉病毒RNA檢測方法，可以定性或定量檢測標本中的埃博拉病毒。陽性具有確診意義。首例病人確診應通過序列分析予以確認。7.4一步法常規(guī)RT-PCR方法檢測埃博拉病毒核酸7.4.1引物：引物序列見下表引物序列片段大小方法1EBVGP451-472F5’-TGGGCTGAAAACTGCTACAATC-3’EBVGP1024-10035’-TTTTAGTTTCCCAGAAGGCCCA-3’570bp方法2Filo-AATCGGAATTTTTCTTTCTCATTFilo-BATGTGGTGGGTTATAATAATCACTGACATG414bpFilo-A-nestedGTCAAAGCATTTCCTAGCAACATGATGGFilo-B-nestedATAATAATCACTCACATGCATATAACA282bp7.4.2PCR擴增根據(jù)實驗室內(nèi)所使用病毒核酸PCR擴增試劑盒特點，正向引物和反向引物配置第一輪PCR體系，進行PCR擴增。推薦反應條件為 94℃預變性2min，然后 94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，反應40循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘。如為套式PCR則開展第二輪擴增。第二輪分型PCR擴增體系配置采用正向引物Filo-A-nested與反向引物Filo-B-nested。推薦反應條件為 94℃預變性2min，然后 94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，反應30循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘。7.4.31.5%濃度瓊脂糖電泳分析。7.4.4結(jié)果判讀a，陽性：電泳顯示相應大小DNA片段。b，陰性：無特異性核酸片段擴增。7.4.5意義陽性結(jié)果可以初步判斷埃博拉病毒感染，但一般情況下需經(jīng)序列分析確診。8可能危害具有潛在感染性的液體迸濺。9預防及處置措施當皮膚、粘膜表面受到液體迸濺時，立即75%乙醇或75%乙醇洗必泰溶液擦拭，并用大量酒精、或肥皂水、或清水沖洗，立即向BSL-3實驗室主任和生物安全實驗室安全負責人報告。10清場與消毒10.1操作結(jié)束后，及時清理生物安全柜內(nèi)的物品，用0.5%次氯酸鈉溶液和75%乙醇擦試外表面后，移出生物安全柜放入冰箱中。10.2未使用完的感染性生物材料銷毀或放入BSL-3級實驗室－70℃冰箱，并如實填寫操作和處理記錄。10.3實驗區(qū)內(nèi)的污染材料高壓處理（121℃高壓20min）后，再進行集中高壓處理。

附件3.酶聯(lián)免疫法檢測埃博拉病毒核蛋白抗原1目的酶聯(lián)免疫法檢測患者血清中埃博拉病毒核蛋白抗原。2適用范圍適用于人血清或血漿中埃博拉病毒核蛋白抗原的檢測。3實驗前準備3.1核對被檢樣品（血清或血漿）患者的姓名、編號及檢測項目等。3.2檢測前應將60℃1小時熱滅活的待測樣品置于BSL-3實驗室生物安全柜內(nèi)的冰上。4檢測項目及參數(shù)本方法檢測項目為檢測血清或血漿中埃博拉病毒核蛋白抗原。5檢測儀器設備和材料加樣器、溫箱、洗板機、含波長450nm的酶標儀、埃博拉病毒抗原檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫法）（IVDC自制）6檢測的環(huán)境條件生物安全三級實驗室（BSL-3）。7操作步驟7.1將試劑盒在冰箱中取出，放置室溫平衡30分鐘，使用前將試劑輕輕震蕩混勻。7.2配液：將濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋注入洗滌瓶或洗板機的桶內(nèi)。7.3編號：將樣品對應微孔板編號，每板設陰性對照3孔，模擬陽性對照2孔和空白對照1孔。7.4加稀釋液：每孔加稀釋液50μL，空白孔除外。7.5加樣：分別在相應孔加入待測樣品或陰陽性對照各50μL，空白孔除外。7.6溫育：用封板膜封板后，置37℃溫育60分鐘。7.7每孔加酶標試劑50μL，空白孔除外，輕輕震蕩混勻。7.8溫育：用封板膜封板后，置37℃溫育30分鐘。7.9洗板：小心揭掉封板膜，用洗板機洗滌5遍，最后一次盡量扣干。7.10顯色：每孔加入顯色劑A、B液各50μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘。7.11測定：每孔加終止液50μL，10分鐘內(nèi)測定結(jié)果。設定酶標儀波長于450nm處（建議使用雙波長450nm/600-650nm檢測），用空白孔調(diào)零后測定各孔A值。8結(jié)果判定8.1臨界值計算：臨界值=0.10+陰性對照孔A值均值（陰性對照孔A值低于0.05者以0.05計算）。8.2陰性對照的正常值范圍：陰性對照孔A≤0.1。8.3陽性對照的正常值范圍：0.8≤A≤1.5.8.4陽性判定：樣品A值≥臨界值者為埃博拉病毒抗原陽性。8.5陰性判定：樣品A值＜臨界值者為埃博拉病毒抗原陰性。9意義結(jié)合臨床信息，陽性結(jié)果可以診斷為埃博拉病毒感染，但陰性結(jié)果并不排除埃博拉病毒感染的可能。10可能危害具有潛在感染性的液體迸濺。11預防及處置措施當皮膚、粘膜表面受到液體迸濺時，立即75%乙醇或75%乙醇洗必泰溶液擦拭，并用大量酒精、或肥皂水、或清水沖洗，立即向BSL-3實驗室主任和生物安全實驗室安全負責人報告。12清場與消毒12.1操作結(jié)束后，及時清理生物安全柜內(nèi)的物品，用0.5%次氯酸鈉溶液和75%乙醇擦試外表面后，移出生物安全柜放入冰箱中。12.2將未使用完的感染性生物材料按銷毀或放入BSL-3級實驗室－70℃冰箱，并如實填寫操作和處理記錄。12.3將實驗區(qū)內(nèi)的污染材料按高壓處理（121℃高壓20min）后，再進行集中高壓處理。

附件4.IgM捕捉ELISA法（MacELISA）檢測埃博拉病毒IgM抗體1目的檢測埃博拉病毒特異性IgM抗體。2適用范圍適用于人血清或血漿中埃博拉病毒特異性IgM抗體的檢測。3樣品接收和準備（1）核對被檢樣品（血清或血漿）患者的姓名、編號及檢測項目等。（2）檢測前應將60℃1小時熱滅活的待測樣品置于BSL-3實驗室生物安全柜內(nèi)的冰上。4檢測項目及參數(shù)本方法檢測項目為檢測血清或血漿中病毒特異性IgM抗體5檢測儀器設備和材料加樣器、溫箱、洗板機、含波長450nm的酶標儀、埃博拉病毒IgM抗體檢測試劑盒，或?qū)嶒炇易詡洳牧希海?）抗原：陽性抗原標記物：酶標原核表達埃博拉病毒核蛋白。陰性抗原標記物：酶標原核表達漢坦病毒核蛋白。（2）抗人IgM（μ鏈）單克隆抗體或多克隆抗體；（3）漢坦病毒IgM陽性、陰性對照血清；（4）辣根過氧化物酶標記埃博拉病毒單克隆抗體；（5）緩沖液：洗滌液：pH7.4PBS－T（0.05％吐溫－20）；稀釋液：pH7.4PBS（5％牛血清）；封閉液：pH9.6碳酸緩沖液（1％牛血清白蛋白）；（6）顯色液：A/B液（7）終止液：4NH2SO46檢測的環(huán)境條件生物安全三級實驗室（BSL-3）中進行。7檢測原理本方法采用抗人μ鏈捕獲人血清IgM抗體，加辣根過氧化物酶標記的病毒抗原，用以檢測埃博拉病毒特異性IgM抗體。適用于埃博拉出血熱的早期診斷及其它實驗性研究。8檢測步驟：（1）用稀釋液按效價稀釋抗人μ鏈單克隆抗體，100μl/孔，加蓋，4℃過夜；（2）棄去抗人μ鏈，用洗滌液重復洗3次，甩干，加封閉液，100μl/孔，置37℃水浴孵育2小時；（3）棄封閉液，用洗滌液重復洗3次，甩干。（4）將待檢血清1:100稀釋液，加入酶標板孔中，100μl/孔，同時將1:100稀釋的陽性血清、陰性血清對照分別加入，100μl/孔，置37℃水浴孵育1小時；（5）棄去血清，用洗滌液重復洗3次，甩干，分別加入酶標埃博拉病毒抗原及漢坦病毒抗原，100μl/孔，4℃過夜；（6）棄抗原，用洗滌液重復洗3次，甩干，于各反應孔內(nèi)加A/B液各一滴，37℃，避光3～5分鐘；（7）加終止液于每反應孔，一滴/孔。9結(jié)果判斷：9.1臨界值計算：臨界值=0.10+陰性對照孔A值均值（陰性對照孔A值低于0.05者以0.05計算）。9.2陰性對照的正常值范圍：陰性對照孔A≤0.1。9.3漢坦病毒陽性對照的正常值范圍：0.8≤A≤1.5.9.4陽性判定：樣品A值≥臨界值者為埃博拉病毒IgM抗體陽性。9.5陰性判定：樣品A值＜臨界值者為埃博拉病毒IgM抗體陰性。陽性結(jié)果，提示患者埃博拉病毒感染，用于埃博拉出血熱早期診斷。10可能危害具有潛在感染性的液體迸濺。11預防及處置措施當皮膚、粘膜表面受到液體迸濺時，立即75%乙醇或75%乙醇洗必泰溶液擦拭，并用大量酒精、或肥皂水、或清水沖洗，立即向BSL-3實驗室主任和生物安全實驗室安全負責人報告。12清場與消毒12.1操作結(jié)束后，及時清理生物安全柜內(nèi)的物品，用0.5%次氯酸鈉溶液和75%乙醇擦試外表面后，移出生物安全柜放入冰箱中。12.2未使用完的感染性生物材料銷毀或放入BSL-3級實驗室－70℃冰箱，并如實填寫操作和處理記錄。12.3將實驗區(qū)內(nèi)的污染材料高壓處理（121℃高壓20min）后，再集中高壓處理。

附件5.酶聯(lián)免疫法檢測埃博拉病毒IgG抗體1目的檢測埃博拉病毒特異性IgG抗體。2適用范圍適用于人血清或血漿中埃博拉病毒特異性IgG抗體的檢測。3實驗前準備（1）核對被檢樣品（血清或血漿）患者的姓名、編號及檢測項目等。（2）檢測前應將60℃1小時熱滅活的待測樣品置于BSL-3實驗室生物安全柜內(nèi)的冰上。4檢測項目及參數(shù)本方法檢測項目為檢測血清或血漿中埃博拉病毒特異性IgG抗體5檢測儀器設備和材料加樣器、溫箱、洗板機、含波長450nm的酶標儀、埃博拉病毒IgG抗體檢測試劑盒，或?qū)嶒炇易詡洳牧希海?）抗原：陽性抗原：原核表達埃博拉病毒核蛋白。陰性抗原：原核表達漢坦病毒核蛋白。（2）辣根過氧化物酶標記的抗人IgG抗體；（3）漢坦病毒IgG陽性、陰性對照血清；（4）緩沖液：包被液：pH9.6碳酸緩沖液；稀釋液：pH7.4PBS（含5%脫脂奶）洗滌液：pH7.4PBS－T（0.05％吐溫－20）；（5）顯色液：A/B液（6）終止液：4NH2SO4（7）酶標板、酶標儀。6檢測的環(huán)境條件生物安全三級實驗室（BSL-3）中進行。7檢測步驟（1）用包被液按工作濃度稀釋埃博拉病毒抗原和陰性對照抗原，100μl/孔，4℃過夜；（2）棄去包被液，用PBS-T重復洗滌3～5次，甩干；（3）將待檢血清用稀釋液從1：100開始作2或4倍連續(xù)稀釋，加入抗原孔，100μl/孔，同時設漢坦病毒陰、陽性血清對照，37℃水浴30分鐘；（4）棄去血清，用洗滌液洗滌5～6次；（5）加酶結(jié)合物，用稀釋液按工作濃度稀釋，100μl/孔，37℃水浴30分鐘；（6）棄去酶標抗體，用洗滌液洗滌6次，甩干；（7）加