埃博拉出血熱實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方案

PAGEPAGE2附件埃博拉出血熱實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方案（第一版）埃博拉出血熱是一種嚴(yán)重的急性傳染病，病死率高,病人感染埃博拉病毒后血液中可維持較高的病毒載量，可能發(fā)生人-人傳播和院內(nèi)感染。直接接觸傳播是本病最主要的傳播途徑?？梢酝ㄟ^接觸病人和被感染動(dòng)物的血液、分泌物、排泄物及其污染物等而感染。埃博拉出血熱在臨床表現(xiàn)上容易和其他病毒性出血熱混淆，需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷。為及時(shí)檢測(cè)和發(fā)現(xiàn)埃博拉出血熱病例，防止疫情擴(kuò)散，規(guī)范實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)程序，提高檢測(cè)質(zhì)量，特制定本方案。檢測(cè)對(duì)象（一）疑似患者。（二）密切接觸者。（三）當(dāng)臨床救治需要時(shí)，對(duì)患者開展檢測(cè)。二、樣本采集、保存和運(yùn)輸（一）臨床標(biāo)本采集用無菌真空干燥管，采集疑似病例、密切接觸者以及恢復(fù)期病例非抗凝血，每份5mL（附件1），標(biāo)記清楚后4℃保存，填寫基本信息（附表1），送指定的具有在BSL-3級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室開展埃博拉出血熱檢測(cè)資質(zhì)的國(guó)家、省級(jí)疾控中心或其他機(jī)構(gòu)。（二）標(biāo)本保存、運(yùn)送未分離血清的全血標(biāo)本應(yīng)4℃保存；血清標(biāo)本應(yīng)-70℃以下保存，或可-20℃以下保存不超過1周。標(biāo)本運(yùn)輸應(yīng)按照相關(guān)生物安全規(guī)定，采取A類包裝，采用低溫冷藏運(yùn)輸，避免凍融。三、檢測(cè)內(nèi)容（一）實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)主要包括埃博拉病毒核酸檢測(cè)和IgM、IgG抗體檢測(cè)。（二）復(fù)核檢測(cè)1．具有開展埃博拉病毒檢測(cè)資質(zhì)的機(jī)構(gòu)應(yīng)將檢測(cè)所有陽(yáng)性和部分陰性的標(biāo)本送中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病所進(jìn)行復(fù)核檢測(cè)。2.對(duì)檢測(cè)陽(yáng)性的標(biāo)本進(jìn)行病毒基因組序列分析。3.實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)陰性的疑似病例，應(yīng)連續(xù)采集系列血標(biāo)本進(jìn)行病毒核酸、IgM、IgG抗體檢測(cè)。四、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法（一）病原學(xué)檢測(cè)1．核酸檢測(cè)：為目前早期診斷、早期發(fā)現(xiàn)埃博拉出血熱病例的主要檢測(cè)方法。采用熒光定量PCR進(jìn)行病毒核酸檢測(cè)，患者標(biāo)本中擴(kuò)增到特異性核酸，可確診埃博拉病毒感染（附件2）。傳統(tǒng)RT-PCR因易出現(xiàn)污染使用受限，但可以獲得病毒基因序列。2.病毒抗原檢測(cè)：用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)埃博拉病毒核蛋白抗原。病毒抗原檢測(cè)陽(yáng)性可確診（附件3）（二）血清學(xué)檢測(cè)1.血清特異性IgM抗體：采用捕獲法ELISA方法檢測(cè)。疑似病例具有疫區(qū)旅行史或患者接觸史，IgM抗體陽(yáng)性，可確診（附件4）。2.血清特異性IgG抗體：目前主要采用間接法ELISA或免疫熒光方法檢測(cè)IgG抗體。單份血清埃博拉病毒IgG抗體陽(yáng)性為曾感染埃博拉病毒，雙份血清埃博拉病毒IgG抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)或恢復(fù)期滴度較急性期4倍或者以上增高者，可確診。（附件5）（三）結(jié)果的報(bào)告和反饋實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果應(yīng)及時(shí)反饋標(biāo)本送檢單位，盡快上報(bào)上級(jí)主管部門（附表2）。五、生物安全按照《病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例》等相關(guān)規(guī)定要求，做好生物安全工作。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)1．所有未經(jīng)培養(yǎng)的感染性材料的操作，如樣本分裝、滅活等處理應(yīng)在BSL-3級(jí)實(shí)驗(yàn)室；2．所有標(biāo)本檢測(cè)前應(yīng)首先60℃1小時(shí)滅活，滅活樣本的核酸檢測(cè)和血清學(xué)檢測(cè)均應(yīng)在BSL-3級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行；3．在進(jìn)行感染性材料操作時(shí)，每次操作標(biāo)本不宜超過20份。（二）個(gè)人防護(hù)在進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)操作過程中，可能存在由病人標(biāo)本導(dǎo)致的人員感染以及污染環(huán)境的機(jī)會(huì)，必須做好防護(hù)。在實(shí)驗(yàn)室處理感染性標(biāo)本時(shí)應(yīng)嚴(yán)格按照操作規(guī)范進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)室工作人員應(yīng)脫去個(gè)人衣服和各種首飾，穿著實(shí)驗(yàn)專用服裝和鞋，再穿可遮蓋全身的防護(hù)服。直接處理感染性樣本時(shí)，應(yīng)戴N95或以上口罩、護(hù)目鏡、乳膠手套及防滲漏防護(hù)服等。所有涉及感染性材料的操作均應(yīng)在三級(jí)生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。必要時(shí)可使用正壓頭盔。標(biāo)本離心時(shí)，應(yīng)使用有密封蓋的離心桶，在生物安全柜內(nèi)打開離心轉(zhuǎn)子。實(shí)驗(yàn)中不得使用注射器針頭等銳器。實(shí)驗(yàn)人員有體表開放式傷口時(shí)不宜參加實(shí)驗(yàn)活動(dòng)，需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)活動(dòng)時(shí)，應(yīng)使用防水布包扎傷口后方可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)活動(dòng)。在標(biāo)本的采集、包裝和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)等過程中所產(chǎn)生的醫(yī)療廢物，具有生物危險(xiǎn)性，應(yīng)當(dāng)按照《醫(yī)療廢物管理?xiàng)l例》和《醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)醫(yī)療廢物管理辦法》等相關(guān)規(guī)定及時(shí)處理。

附件1．血液標(biāo)本采集操作程序2．埃博拉病毒核酸檢測(cè)方法3．酶聯(lián)免疫法檢測(cè)埃博拉病毒核蛋白抗原4．IgM捕捉ELISA法（MacELISA）檢測(cè)埃博拉病毒IgM抗體5．酶聯(lián)免疫法檢測(cè)埃博拉病毒IgG抗體附表1．疑似埃博拉出血熱病人檢材送檢一覽表2．埃博拉出血熱實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果一覽表

附件1.血液標(biāo)本采集操作程序1目的采集埃博拉患者靜脈血，改善血樣采集的質(zhì)量，保護(hù)醫(yī)護(hù)人員和患者采血安全。2適用范圍醫(yī)療機(jī)構(gòu)、疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)和檢疫機(jī)構(gòu)從事血樣采集工作人員，采集疑似埃博拉出血熱患者、疑似患者及密切接觸者靜脈血。3職責(zé)操作人員：負(fù)責(zé)按照本操作細(xì)則對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行操作。監(jiān)督人員：負(fù)責(zé)現(xiàn)場(chǎng)對(duì)血標(biāo)本采集是否規(guī)范進(jìn)行監(jiān)督并協(xié)助操作人員工作。部門負(fù)責(zé)人：負(fù)責(zé)對(duì)標(biāo)本采集、保存、運(yùn)輸?shù)鹊木C合管理，以及對(duì)操作報(bào)告和記錄表格的審核。4實(shí)驗(yàn)材料防護(hù)用品：包括工作服、鞋，可遮蓋全身的防護(hù)服、N95或以上口罩、護(hù)目鏡、尺寸合適的乳膠手套、防滲漏防護(hù)服或正壓防護(hù)服。采血用品：手部清潔衛(wèi)生用品（酒精擦拭子等）、一次性穿刺針采血設(shè)備，并保證這些物品有足夠數(shù)量；足夠的樣品試管等。當(dāng)天制備的含氯消毒劑。5采血場(chǎng)所疑似患者應(yīng)隔離在單獨(dú)的病房，相鄰的服務(wù)間作為唯一的進(jìn)口，服務(wù)間內(nèi)備有除了病人常規(guī)護(hù)理的材料外應(yīng)具備手套、防護(hù)服和防護(hù)面具等，同時(shí)要裝備有洗手的設(shè)施和裝有消毒液的桶。病人房間和服務(wù)間及外側(cè)環(huán)境相比應(yīng)設(shè)為負(fù)壓，空氣不能再次循環(huán)流通。如果不具備上述條件，可用相鄰的房間提供足夠的安全空間。6采集步驟6.1個(gè)人防護(hù)血液采集人員和監(jiān)督人員應(yīng)脫去個(gè)人衣服和各種首飾，穿著實(shí)驗(yàn)專用服裝和鞋，再穿可遮蓋全身的防滲漏防護(hù)服，戴N95或以上口罩、護(hù)目鏡、雙層無菌乳膠手套?；颊哂袊?yán)重出血等臨床表現(xiàn)時(shí)，應(yīng)戴正壓防護(hù)頭盔。6.2器材準(zhǔn)備收集所需器材，并將其放在安全、方便可及的托盤或推車上，確保肉眼可觀察到所有設(shè)備。6.3患者確認(rèn)如果患者是成年人并且意識(shí)清醒，應(yīng)向患者做自我介紹，并詢問患者的全名，檢查實(shí)驗(yàn)室表格是否與患者的身份相符（即根據(jù)實(shí)驗(yàn)室表格填寫內(nèi)容，核對(duì)患者的詳細(xì)內(nèi)容，以確保正確的身份識(shí)別）；詢問是否有過敏、恐慌或曾經(jīng)暈針暈血史。6.4穿刺部位消毒，采用醫(yī)院靜脈血采集常規(guī)消毒措施后采血6.5正確順序抽取樣本給采集的血液樣品正確編號(hào)，避免試管間的添加劑交叉污染，放4℃暫時(shí)保存，以便進(jìn)行安照相關(guān)生物安全規(guī)定包裝、送檢。6.6清潔被污染表面。把血液污染的針頭或耗材棄于耐刺銳器容器中。核對(duì)標(biāo)簽和表格。標(biāo)簽必須清晰標(biāo)明實(shí)驗(yàn)室所需的全部信息，一般是患者的姓和名、病史檔案號(hào)碼、出生日期、采血的日期和時(shí)間。將使用過的物品棄于有明顯生物安全標(biāo)識(shí)的廢棄物分類容器中。再次進(jìn)行手部清潔衛(wèi)生工作。樣本包裝送檢前，重新核對(duì)試管上的標(biāo)簽和表格。檢查穿刺點(diǎn)，確認(rèn)不再流血，告訴患者整個(gè)過程已經(jīng)結(jié)束，并指示患者休息。7樣本運(yùn)輸準(zhǔn)備按國(guó)家生物安全規(guī)定，采用A類按一類病原微生物包裝運(yùn)輸。8濺溢物的清理如果有血液濺溢出現(xiàn)（例如在采血區(qū)域或運(yùn)輸途中有血樣打破，或在采血過程中患者出血過多），必須按照實(shí)驗(yàn)室意外事故處理。安全操作程序如下：如果有大量血液濺溢，可能會(huì)污染防護(hù)服，首先對(duì)防護(hù)服噴灑含1%的次氯酸鈉的消毒劑。及時(shí)通知上級(jí)負(fù)責(zé)人，退出采血區(qū)域，去除防護(hù)服。由另一名工作人員穿上防護(hù)服，帶好N-95或以上口罩或正壓頭盔。使用紙巾輕輕的覆蓋濺出物，并將1%的次氯酸鈉傾倒在紙巾上，傾倒順序是由濺出物的四周向中心移動(dòng)。保持足夠的作用時(shí)間（30分鐘），然后將廢物清除。重復(fù)處理一次，并把紙巾?xiàng)売诟腥拘詮U棄物桶內(nèi)。如果血液意外接觸到了皮膚、粘膜或被刺傷，應(yīng)用0.5%碘伏消毒液、75%酒精、75%酒精洗必泰擦拭消毒，使用清水或肥皂水徹底清洗；粘膜應(yīng)用大量清水沖洗或0.05%碘伏沖洗。必須上報(bào)整個(gè)意外過程。在醫(yī)院外運(yùn)輸血樣時(shí)要給運(yùn)輸車輛裝備血液濺溢處理工具和消毒劑。9注意事項(xiàng)9.1采集埃博拉出血熱患者血樣會(huì)給醫(yī)護(hù)人員帶來風(fēng)險(xiǎn)，要杜絕采血過程中的危險(xiǎn)操作。包括：用雙手將使用過的針頭回套；回套、拆卸真空管和試管針管架；重復(fù)使用可能已被血液污染的壓脈帶及真空管的試管針管架；單獨(dú)給神志糊涂或缺乏指導(dǎo)的患者采血時(shí)，這些患者可能突然移動(dòng)身體而導(dǎo)致針扎傷害發(fā)生。由于采血一般使用較大的針頭穿刺進(jìn)入血管內(nèi)采集血液，針頭可能攜帶大量血液，一旦發(fā)生意外針刺事件，可能比其他銳器刺傷更容易發(fā)生感染。9.2采血時(shí)應(yīng)注意：9.2.1要在每次操作或接觸每一位患者時(shí)更換一次性手套和防護(hù)服，不要使用同一雙手套和防護(hù)服對(duì)多個(gè)患者進(jìn)行采血。9.2.2在采血和抽取血樣時(shí)使用一次性裝置，不要使用同一個(gè)注射器、針頭或穿刺針采集多個(gè)患者血樣。9.2.3要立即將使用過的裝置丟棄于放置銳器的牢固容器中（針頭和注射器應(yīng)作為一個(gè)整體進(jìn)行處置），不要將赤裸的針頭棄置于銳器容器外。9.2.4若針頭回套不可避免，要用單手技術(shù)（將針帽置于操作臺(tái)面上，僅使用一只手引導(dǎo)所使用的針尖進(jìn)入針帽；然后用消毒液清潔桌面；將針帽背靠于一個(gè)穩(wěn)固的垂直面，開口朝向采血者，然后將使用過的針頭插入；一旦針尖被蓋上，就垂直提起針頭和注射器，使用另一只手將針帽套牢固定在注射器上）或用止血鉗輔助，不要用雙手回套9.2.5要用防開蓋的密封銳器容器，不要填充過滿，也不要傾倒銳器容器9.2.6要在針頭插入樣品管的橡膠塞前，將實(shí)驗(yàn)樣品管放置在一個(gè)穩(wěn)固的架子上，不要一只手握著實(shí)驗(yàn)樣品管，同時(shí)另一只手將針頭插入橡膠塞。9.2.7要在受到針頭或銳器傷害時(shí)立即報(bào)告，并尋求援助。

附件2.埃博拉病毒核酸檢測(cè)方法1目的疑似埃博拉患者血標(biāo)本中病毒核酸的提取及PCR檢測(cè)。2適用范圍適用于標(biāo)本中埃博拉病毒核酸檢測(cè)。3實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備3.1核對(duì)被檢樣品（血清或血漿）患者的姓名、編號(hào)及檢測(cè)項(xiàng)目等。3.2檢測(cè)前應(yīng)將60℃1小時(shí)熱滅活的待測(cè)樣品置于BSL-3實(shí)驗(yàn)室生物安全柜內(nèi)的冰上。4檢測(cè)項(xiàng)目及參數(shù)本方法檢測(cè)項(xiàng)目為檢測(cè)血標(biāo)本中埃博拉病毒核酸。5檢測(cè)儀器設(shè)備和材料實(shí)時(shí)定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)儀，常規(guī)核酸擴(kuò)增檢測(cè)儀，RNA提取試劑盒，一步法RT-PCR擴(kuò)增試劑盒，一步法實(shí)時(shí)定量RT-PCR擴(kuò)增試劑盒，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒等。6檢測(cè)的環(huán)境條件在滅活標(biāo)本中提取埃博拉病毒RNA的實(shí)驗(yàn)要求在BSL-2及以上實(shí)驗(yàn)室操作。7實(shí)驗(yàn)步驟7.1實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備a.在滅活標(biāo)本中提取埃博拉病毒RNA要求在BSL-3級(jí)別實(shí)驗(yàn)室操作。b.進(jìn)入實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所之前，要事先準(zhǔn)備好所需試劑，樣品。預(yù)約實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所，并看前一位實(shí)驗(yàn)者是否已經(jīng)清場(chǎng)。7.2RNA的提取7.2.1使用QIAampViralRNAMini試劑盒提取血清標(biāo)本中病毒RNA（使用其他試劑盒或方法提取病毒RNA的應(yīng)參照相應(yīng)試劑盒說明書或?qū)嶒?yàn)室操作手冊(cè)）。a.吸取560μl包含載體RNA的AVL緩沖液至1.5ml的離心管中。b.向上述的液體中加入140μl樣品，脈沖渦旋式混勻15秒，室溫孵育10分鐘，簡(jiǎn)單離心使離心管頂端液體落到底部。c.在樣品中加入560μl96－100％的乙醇，混勻15秒，再簡(jiǎn)單離心。d.小心將630μl液體加入未浸濕的QIAamp小柱中，蓋好蓋，離心8000rpm/min1min,棄去收集管，將柱子置于一新的2ml收集管上。e.打開QIAamp小柱的蓋子，重復(fù)步驟6，直至樣品全部離心。f.打開蓋子，向柱中加入500μlAW1緩沖液，蓋好蓋，離心8000rpm/min1min，棄去收集管，將柱子置于一新的2ml收集管上。g.打開蓋子，加入500μlAW2緩沖液，蓋好蓋，離心14，000rpm/min3min。將柱子置于一新的2ml收集管上，空離1min。h.將柱子置于一新的1.5ml離心管上，加入50μlAVE洗脫緩沖液，室溫孵育1min,離心8000rpm/min1min。7.2.2RNeasyMiniKit提取組織標(biāo)本或血塊或血細(xì)胞標(biāo)本病毒RNA（使用其他試劑盒或方法提取病毒RNA的應(yīng)參照相應(yīng)試劑盒說明書或?qū)嶒?yàn)室操作手冊(cè)）。a.從Kit中取出RLT液，根據(jù)標(biāo)本數(shù)量分裝適量RLT液按照1：100體積比分別加入β-巰基乙醇，分裝至相應(yīng)的預(yù)先標(biāo)記好的微量離心管中，每管600μL。b.將150μl組織研磨混懸液分別加入相應(yīng)的RLT液管中，充分混勻。c.混勻后依次加入750μl70％的乙醇，充分混勻。d.從Kit中取出帶收集管的濾柱，打開包裝將其做好標(biāo)記。取步驟2中的混合液750μl加入濾柱中，12000rpm，離心15s，棄收集管中的離心液。e.濾柱仍放回收集管上，將步驟2剩余的混合液全部轉(zhuǎn)入濾柱中，12000rpm，離心15s，棄離心液；f.于濾柱中加入700μlWashBufferRW1液，12000rpm，離心15s。g.從QIAGENRNeasyMiniKit中取一支干凈的2mL收集管，將離心后的濾柱移到新的收集管上，加入500μlWashBufferRPE液，12000rpm，離心15s。h.棄收集管中的離心液，再于濾柱中加入500μlWashBufferRPE液，13000～14000rpm，離心2min。i.將濾柱移到一個(gè)無RNA酶的干凈的1.5mLeppendorf管上，向?yàn)V柱中加入30～50μl的RNase-freeWater,室溫靜置1～3min。j.12000rpm，離心1min，離心液即為病毒RNA，立即檢測(cè)或-70℃以下保存。7.3實(shí)時(shí)定量RT-PCR法分型檢測(cè)埃博拉病毒核酸7.3.1引物與探針引物/探針序列熒光標(biāo)記檢測(cè)引物探針1ZEBOV-FCGCCGAGTCTCACTGAATCTGZEBOV-RAGTTGGCAAATTTCTTCAAGATTGTZEBOV-PFAM-CGGCAAAGAGTCATCCCAGTGTATCAAGTAA-BHQ1FAM/BHQ-1檢測(cè)引物探針2EBOGP1D-fwdTGGGCTGAAAAYTGCTACAATCEBOGP1D-revCTTTGTGMACATASCGGCACEBOGP1DZ-PrbFAM-CTACCAGCAGCGCCAGACGG-BHQ1FAM/BHQ-17.3.2實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR擴(kuò)增實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)配置體系：RNA模板5μl，酶0.5μl，緩沖液12.5μl，引物各0.5μl(共4對(duì),8條)，探針各0.25μl，加水至總體積25μl。推薦反應(yīng)條件為50℃30min，95℃2min，95℃15s、60℃30s反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。7.3.3結(jié)果判斷以定量熒光PCR反應(yīng)的前3～15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為本底信號(hào)，以本底信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)差的10倍作為熒光閾值，標(biāo)本擴(kuò)增產(chǎn)生的熒光信號(hào)達(dá)到熒光閾值時(shí)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)為循環(huán)閾值（Ct值），以Ct<35熒光信號(hào)數(shù)據(jù)線性化處理后對(duì)應(yīng)循環(huán)數(shù)生成的曲線圖成“S”形的標(biāo)本，可判斷為相應(yīng)的埃博拉病毒核酸檢測(cè)陽(yáng)性。7.3.4意義熒光定量PCR是一種靈敏、特異、低污染的埃博拉病毒RNA檢測(cè)方法，可以定性或定量檢測(cè)標(biāo)本中的埃博拉病毒。陽(yáng)性具有確診意義。首例病人確診應(yīng)通過序列分析予以確認(rèn)。7.4一步法常規(guī)RT-PCR方法檢測(cè)埃博拉病毒核酸7.4.1引物：引物序列見下表引物序列片段大小方法1EBVGP451-472F5’-TGGGCTGAAAACTGCTACAATC-3’EBVGP1024-10035’-TTTTAGTTTCCCAGAAGGCCCA-3’570bp方法2Filo-AATCGGAATTTTTCTTTCTCATTFilo-BATGTGGTGGGTTATAATAATCACTGACATG414bpFilo-A-nestedGTCAAAGCATTTCCTAGCAACATGATGGFilo-B-nestedATAATAATCACTCACATGCATATAACA282bp7.4.2PCR擴(kuò)增根據(jù)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)所使用病毒核酸PCR擴(kuò)增試劑盒特點(diǎn)，正向引物和反向引物配置第一輪PCR體系，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。推薦反應(yīng)條件為 94℃預(yù)變性2min，然后 94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，反應(yīng)40循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘。如為套式PCR則開展第二輪擴(kuò)增。第二輪分型PCR擴(kuò)增體系配置采用正向引物Filo-A-nested與反向引物Filo-B-nested。推薦反應(yīng)條件為 94℃預(yù)變性2min，然后 94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，反應(yīng)30循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘。7.4.31.5%濃度瓊脂糖電泳分析。7.4.4結(jié)果判讀a，陽(yáng)性：電泳顯示相應(yīng)大小DNA片段。b，陰性：無特異性核酸片段擴(kuò)增。7.4.5意義陽(yáng)性結(jié)果可以初步判斷埃博拉病毒感染，但一般情況下需經(jīng)序列分析確診。8可能危害具有潛在感染性的液體迸濺。9預(yù)防及處置措施當(dāng)皮膚、粘膜表面受到液體迸濺時(shí)，立即75%乙醇或75%乙醇洗必泰溶液擦拭，并用大量酒精、或肥皂水、或清水沖洗，立即向BSL-3實(shí)驗(yàn)室主任和生物安全實(shí)驗(yàn)室安全負(fù)責(zé)人報(bào)告。10清場(chǎng)與消毒10.1操作結(jié)束后，及時(shí)清理生物安全柜內(nèi)的物品，用0.5%次氯酸鈉溶液和75%乙醇擦試外表面后，移出生物安全柜放入冰箱中。10.2未使用完的感染性生物材料銷毀或放入BSL-3級(jí)實(shí)驗(yàn)室－70℃冰箱，并如實(shí)填寫操作和處理記錄。10.3實(shí)驗(yàn)區(qū)內(nèi)的污染材料高壓處理（121℃高壓20min）后，再進(jìn)行集中高壓處理。

附件3.酶聯(lián)免疫法檢測(cè)埃博拉病毒核蛋白抗原1目的酶聯(lián)免疫法檢測(cè)患者血清中埃博拉病毒核蛋白抗原。2適用范圍適用于人血清或血漿中埃博拉病毒核蛋白抗原的檢測(cè)。3實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備3.1核對(duì)被檢樣品（血清或血漿）患者的姓名、編號(hào)及檢測(cè)項(xiàng)目等。3.2檢測(cè)前應(yīng)將60℃1小時(shí)熱滅活的待測(cè)樣品置于BSL-3實(shí)驗(yàn)室生物安全柜內(nèi)的冰上。4檢測(cè)項(xiàng)目及參數(shù)本方法檢測(cè)項(xiàng)目為檢測(cè)血清或血漿中埃博拉病毒核蛋白抗原。5檢測(cè)儀器設(shè)備和材料加樣器、溫箱、洗板機(jī)、含波長(zhǎng)450nm的酶標(biāo)儀、埃博拉病毒抗原檢測(cè)試劑盒（酶聯(lián)免疫法）（IVDC自制）6檢測(cè)的環(huán)境條件生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室（BSL-3）。7操作步驟7.1將試劑盒在冰箱中取出，放置室溫平衡30分鐘，使用前將試劑輕輕震蕩混勻。7.2配液：將濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋注入洗滌瓶或洗板機(jī)的桶內(nèi)。7.3編號(hào)：將樣品對(duì)應(yīng)微孔板編號(hào)，每板設(shè)陰性對(duì)照3孔，模擬陽(yáng)性對(duì)照2孔和空白對(duì)照1孔。7.4加稀釋液：每孔加稀釋液50μL，空白孔除外。7.5加樣：分別在相應(yīng)孔加入待測(cè)樣品或陰陽(yáng)性對(duì)照各50μL，空白孔除外。7.6溫育：用封板膜封板后，置37℃溫育60分鐘。7.7每孔加酶標(biāo)試劑50μL，空白孔除外，輕輕震蕩混勻。7.8溫育：用封板膜封板后，置37℃溫育30分鐘。7.9洗板：小心揭掉封板膜，用洗板機(jī)洗滌5遍，最后一次盡量扣干。7.10顯色：每孔加入顯色劑A、B液各50μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘。7.11測(cè)定：每孔加終止液50μL，10分鐘內(nèi)測(cè)定結(jié)果。設(shè)定酶標(biāo)儀波長(zhǎng)于450nm處（建議使用雙波長(zhǎng)450nm/600-650nm檢測(cè)），用空白孔調(diào)零后測(cè)定各孔A值。8結(jié)果判定8.1臨界值計(jì)算：臨界值=0.10+陰性對(duì)照孔A值均值（陰性對(duì)照孔A值低于0.05者以0.05計(jì)算）。8.2陰性對(duì)照的正常值范圍：陰性對(duì)照孔A≤0.1。8.3陽(yáng)性對(duì)照的正常值范圍：0.8≤A≤1.5.8.4陽(yáng)性判定：樣品A值≥臨界值者為埃博拉病毒抗原陽(yáng)性。8.5陰性判定：樣品A值＜臨界值者為埃博拉病毒抗原陰性。9意義結(jié)合臨床信息，陽(yáng)性結(jié)果可以診斷為埃博拉病毒感染，但陰性結(jié)果并不排除埃博拉病毒感染的可能。10可能危害具有潛在感染性的液體迸濺。11預(yù)防及處置措施當(dāng)皮膚、粘膜表面受到液體迸濺時(shí)，立即75%乙醇或75%乙醇洗必泰溶液擦拭，并用大量酒精、或肥皂水、或清水沖洗，立即向BSL-3實(shí)驗(yàn)室主任和生物安全實(shí)驗(yàn)室安全負(fù)責(zé)人報(bào)告。12清場(chǎng)與消毒12.1操作結(jié)束后，及時(shí)清理生物安全柜內(nèi)的物品，用0.5%次氯酸鈉溶液和75%乙醇擦試外表面后，移出生物安全柜放入冰箱中。12.2將未使用完的感染性生物材料按銷毀或放入BSL-3級(jí)實(shí)驗(yàn)室－70℃冰箱，并如實(shí)填寫操作和處理記錄。12.3將實(shí)驗(yàn)區(qū)內(nèi)的污染材料按高壓處理（121℃高壓20min）后，再進(jìn)行集中高壓處理。

附件4.IgM捕捉ELISA法（MacELISA）檢測(cè)埃博拉病毒IgM抗體1目的檢測(cè)埃博拉病毒特異性IgM抗體。2適用范圍適用于人血清或血漿中埃博拉病毒特異性IgM抗體的檢測(cè)。3樣品接收和準(zhǔn)備（1）核對(duì)被檢樣品（血清或血漿）患者的姓名、編號(hào)及檢測(cè)項(xiàng)目等。（2）檢測(cè)前應(yīng)將60℃1小時(shí)熱滅活的待測(cè)樣品置于BSL-3實(shí)驗(yàn)室生物安全柜內(nèi)的冰上。4檢測(cè)項(xiàng)目及參數(shù)本方法檢測(cè)項(xiàng)目為檢測(cè)血清或血漿中病毒特異性IgM抗體5檢測(cè)儀器設(shè)備和材料加樣器、溫箱、洗板機(jī)、含波長(zhǎng)450nm的酶標(biāo)儀、埃博拉病毒IgM抗體檢測(cè)試劑盒，或?qū)嶒?yàn)室自備材料：（1）抗原：陽(yáng)性抗原標(biāo)記物：酶標(biāo)原核表達(dá)埃博拉病毒核蛋白。陰性抗原標(biāo)記物：酶標(biāo)原核表達(dá)漢坦病毒核蛋白。（2）抗人IgM（μ鏈）單克隆抗體或多克隆抗體；（3）漢坦病毒IgM陽(yáng)性、陰性對(duì)照血清；（4）辣根過氧化物酶標(biāo)記埃博拉病毒單克隆抗體；（5）緩沖液：洗滌液：pH7.4PBS－T（0.05％吐溫－20）；稀釋液：pH7.4PBS（5％牛血清）；封閉液：pH9.6碳酸緩沖液（1％牛血清白蛋白）；（6）顯色液：A/B液（7）終止液：4NH2SO46檢測(cè)的環(huán)境條件生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室（BSL-3）中進(jìn)行。7檢測(cè)原理本方法采用抗人μ鏈捕獲人血清IgM抗體，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的病毒抗原，用以檢測(cè)埃博拉病毒特異性IgM抗體。適用于埃博拉出血熱的早期診斷及其它實(shí)驗(yàn)性研究。8檢測(cè)步驟：（1）用稀釋液按效價(jià)稀釋抗人μ鏈單克隆抗體，100μl/孔，加蓋，4℃過夜；（2）棄去抗人μ鏈，用洗滌液重復(fù)洗3次，甩干，加封閉液，100μl/孔，置37℃水浴孵育2小時(shí)；（3）棄封閉液，用洗滌液重復(fù)洗3次，甩干。（4）將待檢血清1:100稀釋液，加入酶標(biāo)板孔中，100μl/孔，同時(shí)將1:100稀釋的陽(yáng)性血清、陰性血清對(duì)照分別加入，100μl/孔，置37℃水浴孵育1小時(shí)；（5）棄去血清，用洗滌液重復(fù)洗3次，甩干，分別加入酶標(biāo)埃博拉病毒抗原及漢坦病毒抗原，100μl/孔，4℃過夜；（6）棄抗原，用洗滌液重復(fù)洗3次，甩干，于各反應(yīng)孔內(nèi)加A/B液各一滴，37℃，避光3～5分鐘；（7）加終止液于每反應(yīng)孔，一滴/孔。9結(jié)果判斷：9.1臨界值計(jì)算：臨界值=0.10+陰性對(duì)照孔A值均值（陰性對(duì)照孔A值低于0.05者以0.05計(jì)算）。9.2陰性對(duì)照的正常值范圍：陰性對(duì)照孔A≤0.1。9.3漢坦病毒陽(yáng)性對(duì)照的正常值范圍：0.8≤A≤1.5.9.4陽(yáng)性判定：樣品A值≥臨界值者為埃博拉病毒IgM抗體陽(yáng)性。9.5陰性判定：樣品A值＜臨界值者為埃博拉病毒IgM抗體陰性。陽(yáng)性結(jié)果，提示患者埃博拉病毒感染，用于埃博拉出血熱早期診斷。10可能危害具有潛在感染性的液體迸濺。11預(yù)防及處置措施當(dāng)皮膚、粘膜表面受到液體迸濺時(shí)，立即75%乙醇或75%乙醇洗必泰溶液擦拭，并用大量酒精、或肥皂水、或清水沖洗，立即向BSL-3實(shí)驗(yàn)室主任和生物安全實(shí)驗(yàn)室安全負(fù)責(zé)人報(bào)告。12清場(chǎng)與消毒12.1操作結(jié)束后，及時(shí)清理生物安全柜內(nèi)的物品，用0.5%次氯酸鈉溶液和75%乙醇擦試外表面后，移出生物安全柜放入冰箱中。12.2未使用完的感染性生物材料銷毀或放入BSL-3級(jí)實(shí)驗(yàn)室－70℃冰箱，并如實(shí)填寫操作和處理記錄。12.3將實(shí)驗(yàn)區(qū)內(nèi)的污染材料高壓處理（121℃高壓20min）后，再集中高壓處理。

附件5.酶聯(lián)免疫法檢測(cè)埃博拉病毒IgG抗體1目的檢測(cè)埃博拉病毒特異性IgG抗體。2適用范圍適用于人血清或血漿中埃博拉病毒特異性IgG抗體的檢測(cè)。3實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備（1）核對(duì)被檢樣品（血清或血漿）患者的姓名、編號(hào)及檢測(cè)項(xiàng)目等。（2）檢測(cè)前應(yīng)將60℃1小時(shí)熱滅活的待測(cè)樣品置于BSL-3實(shí)驗(yàn)室生物安全柜內(nèi)的冰上。4檢測(cè)項(xiàng)目及參數(shù)本方法檢測(cè)項(xiàng)目為檢測(cè)血清或血漿中埃博拉病毒特異性IgG抗體5檢測(cè)儀器設(shè)備和材料加樣器、溫箱、洗板機(jī)、含波長(zhǎng)450nm的酶標(biāo)儀、埃博拉病毒IgG抗體檢測(cè)試劑盒，或?qū)嶒?yàn)室自備材料：（1）抗原：陽(yáng)性抗原：原核表達(dá)埃博拉病毒核蛋白。陰性抗原：原核表達(dá)漢坦病毒核蛋白。（2）辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG抗體；（3）漢坦病毒IgG陽(yáng)性、陰性對(duì)照血清；（4）緩沖液：包被液：pH9.6碳酸緩沖液；稀釋液：pH7.4PBS（含5%脫脂奶）洗滌液：pH7.4PBS－T（0.05％吐溫－20）；（5）顯色液：A/B液（6）終止液：4NH2SO4（7）酶標(biāo)板、酶標(biāo)儀。6檢測(cè)的環(huán)境條件生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室（BSL-3）中進(jìn)行。7檢測(cè)步驟（1）用包被液按工作濃度稀釋埃博拉病毒抗原和陰性對(duì)照抗原，100μl/孔，4℃過夜；（2）棄去包被液，用PBS-T重復(fù)洗滌3～5次，甩干；（3）將待檢血清用稀釋液從1：100開始作2或4倍連續(xù)稀釋，加入抗原孔，100μl/孔，同時(shí)設(shè)漢坦病毒陰、陽(yáng)性血清對(duì)照，37℃水浴30分鐘；（4）棄去血清，用洗滌液洗滌5～6次；（5）加酶結(jié)合物，用稀釋液按工作濃度稀釋，100μl/孔，37℃水浴30分鐘；（6）棄去酶標(biāo)抗體，用洗滌液洗滌6次，甩干；（7）加