第03章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法課件

第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法細(xì)胞生物學(xué)研究思路進(jìn)行初步觀察形成可驗(yàn)證的假說設(shè)計(jì)對照試驗(yàn)收集資料解釋結(jié)果作出合理結(jié)論查閱已有知識第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法CaenorhabditiselegansDrosophilamelanogasterArabidopsisthaliana生物學(xué)研究模式生物第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法生物學(xué)研究模式生物微生物細(xì)胞病毒孟加拉斑馬魚熒光斑馬魚全身透明斑馬魚第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法不同物種享有共同分子機(jī)制第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法

細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法

細(xì)胞組分的分析方法

細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù)第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法第一節(jié)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法

光學(xué)顯微鏡技術(shù)（lightmicroscopy）

電子顯微鏡技術(shù)(Electromicroscopy)

掃描探針顯微鏡（ScanningProbeMicroscope）掃描隧道顯微鏡(scanningtunnelingmicroscope)

第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)（lightmicroscopy)

普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡技術(shù)

熒光顯微鏡技術(shù)（FluorescenceMicroscopy）

激光共焦掃描顯微鏡技術(shù)（LaserConfocalMicroscopy）

相差顯微鏡（phase-contrastmicroscope）

微分干涉顯微鏡（differentialinterferencecontrastmicroscope,DIC）

錄像增差顯微鏡技術(shù)（video-enhancemicroscopy）第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法光鏡樣本制作第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法分辨率是指區(qū)分開兩個質(zhì)點(diǎn)間的最小距離。第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法熒光顯微鏡技術(shù)

（FluorescenceMicroscopy）

原理與應(yīng)用

直接熒光標(biāo)記技術(shù)

間接免疫熒光標(biāo)記技術(shù)

在光鏡水平用于特異蛋白質(zhì)等生物大分子的定性定位：

如綠色熒光蛋白(GFP)的應(yīng)用

第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法熒光顯微鏡技術(shù)原理第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法體視熒光顯微鏡第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法微管呈綠色、微絲紅色、核藍(lán)色直接熒光標(biāo)記技術(shù)第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法現(xiàn)代生物學(xué)的北斗星2008年度諾貝爾化學(xué)獎授予美國科學(xué)家下村修、馬丁-查爾菲，華裔化學(xué)家錢永健，他們因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)和發(fā)展綠色熒光蛋白(GFP)而獲獎的。多種顏色熒光的大腸桿菌組成的“錢氏實(shí)驗(yàn)室”字樣

第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法激光共焦掃描顯微鏡技術(shù)

（LaserScanningConfocalMicroscopy）激光共焦掃描顯微鏡技術(shù)原理第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法

應(yīng)用：

1.排除焦平面以外光的干擾，增強(qiáng)圖像反差和提高分辨率(1.4—1.7)，高品質(zhì)的熒光成像;2.多維觀察,重構(gòu)樣品的三維結(jié)構(gòu);3.可進(jìn)行一二三標(biāo)記;4.動、靜態(tài)觀察；

5.定性與定量分析。

第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法實(shí)例美國哈佛大學(xué)的吉恩·里維特(JeanLivet)使用共焦顯微技術(shù)(confocalmicroscopy)，拍攝了一只基因工程小鼠的腦干組織切片(厚340μm)。(即“腦虹”技術(shù)，Brainbow)美國北卡羅來納大學(xué)惠明頓分校的索尼婭·派奧特(SonjaPyott)拍攝到了小鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞

.毛細(xì)胞為綠色，與毛細(xì)胞有突觸聯(lián)系的細(xì)胞為紅色，藍(lán)色的則是細(xì)胞核第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法

相差顯微鏡（phase-contrastmicroscope）將光程差或相位差轉(zhuǎn)換成振幅差，可用于觀察活細(xì)胞

微分干涉顯微鏡（differential-interferencemicroscope）偏振光經(jīng)合成后，使樣品中厚度上的微小區(qū)別轉(zhuǎn)化成 明暗區(qū)別，增加了樣品反差且具有立體感。適于研究活細(xì)胞中較大的細(xì)胞器第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法AcomparisonofyeastcellsthatweregrowingonthevaginalepitheliumseenwithdifferenttypesofLM.a)underbright-field;b)phase-contrast;c)DIC第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法錄像增差顯微鏡技術(shù)（video-enhancemicroscopy）計(jì)算機(jī)輔助的DIC顯微鏡可在高分辨率下研究活細(xì)胞中的顆粒及細(xì)胞器的運(yùn)動。第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法二、電子顯微鏡技術(shù)

電子顯微鏡的基本知識

電鏡與光鏡的比較

電鏡與光鏡光路圖比較

電子顯微鏡的基本構(gòu)造

主要電鏡制樣技術(shù)

負(fù)染色技術(shù)

冰凍蝕刻技術(shù)

超薄切片技術(shù)

電鏡三維重構(gòu)技術(shù)

掃描電鏡（Scanningelectronmicroscope，SEM）

SPM(Scanningprobemicroscope)第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法電鏡與光鏡的比較

顯微鏡分辨本領(lǐng)光源透鏡真空成像原理LMTEM200nm100nm0.1nm可見光（400-700）紫外光（約200nm)電子束（0.01-0.9）玻璃透鏡玻璃透鏡電磁透鏡不要求真空不要求真空要求真空1.33x10-5～1.33x10-3Pa利用樣品對光的吸收形成明暗反差和顏色變化利用樣品對電子的散射和透射形成明暗反差第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法電鏡與光鏡光路圖比較第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法電子顯微鏡的基本構(gòu)造第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法主要電鏡制樣技術(shù)

超薄切片技術(shù)用于電鏡觀察的樣本制備示意圖

負(fù)染色技術(shù)（Negativestaining）與金屬投影 染色背景，襯托出樣品的精細(xì)結(jié)構(gòu)

冰凍蝕刻技術(shù)（Freezeetching）（技術(shù)示意圖） 冰凍斷裂與蝕刻復(fù)型：主要用來觀察膜斷裂面的蛋白質(zhì)顆粒和膜表面結(jié)構(gòu)。 快速冷凍深度蝕刻技術(shù)（quickfreezedeepetching）

電鏡三維重構(gòu)技術(shù) 電子顯微術(shù)、電子衍射與計(jì)算機(jī)圖象處理相結(jié)合而形成的具有重要應(yīng)用前景的一門新技術(shù)。 電鏡三維重構(gòu)技術(shù)與X-射線晶體衍射技術(shù)及核磁共振分析技術(shù)相結(jié)合，是當(dāng)前結(jié)構(gòu)生物學(xué)（StructuralBiology）

——主要研究生物大分子空間結(jié)構(gòu)及其相互關(guān)系的主要實(shí)驗(yàn)手段。第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法Examplesofnegtivelystainedandmetal-shadowedspecimens.Electronmicrographsofatobaccorattlevirusafternegtivestainingwithpotassiumphosphotungstate(a)orshadowcastingwithchromium(b).第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法掃描電鏡

原理與應(yīng)用：

電子“探針”掃描，激發(fā)樣品表面放出二次電子，探測器收集二次電子成象。

CO2臨界點(diǎn)干燥法防止引起樣品變形的表面張力問題第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法掃描電鏡外觀第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法三、掃描隧道顯微鏡ScanningProbeMicroscope,SPM(80年代發(fā)展起來的檢測樣品微觀結(jié)構(gòu)的儀器)

包括：STM、AFM、磁力顯微鏡、摩擦力顯微鏡等原理：掃描探針與樣品接觸或達(dá)到很近距離時，即產(chǎn)生彼此間相互作用力，如量子力學(xué)中的隧道效應(yīng)（隧道電流）、原子間作用力、磁力、摩擦力等，并在計(jì)算機(jī)顯示出來，從而反映出樣品表面形貌信息、電特性或磁特性等。

裝置：掃描的壓電陶瓷，逼近裝置，電子學(xué)反饋控制系統(tǒng)和數(shù)據(jù)采集、處理、顯示系統(tǒng)。

特點(diǎn)：（1）可對晶體或非晶體成像，無需復(fù)雜計(jì)算，且分辨本領(lǐng)高。（側(cè)分辨率為0.1～0.2nm，縱分辨率可達(dá)0.01nm）； （2）可實(shí)時得到樣品表面三維圖象，可測量厚度信息；（3）可在真空、大氣、液體等多種條件下工作；非破壞性測量。 （4）可連續(xù)成像，進(jìn)行動態(tài)觀察

用途：納米生物學(xué)研究領(lǐng)域中的重要工具,在原子水平上揭示樣本表面的結(jié)構(gòu)。第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法透射電鏡外觀第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法

透射電鏡下的細(xì)胞第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法

活細(xì)胞工作站可實(shí)現(xiàn)在細(xì)胞水平上的定性和定量分析、活細(xì)胞圖像處理、活細(xì)胞動態(tài)示蹤。在分子水平，可做到基因定位定量表達(dá)的動態(tài)分析、蛋白質(zhì)合成降解運(yùn)輸和相互作用的動態(tài)研究、細(xì)胞骨架的代謝動力學(xué)測定和細(xì)胞周期各時相的動態(tài)觀察等。

現(xiàn)在市場上使用的活細(xì)胞工作站由高級自動倒置顯微鏡、活細(xì)胞長時間孵育系統(tǒng)、Z軸微光切系統(tǒng)（數(shù)碼共聚焦系統(tǒng)）、單色儀、高靈敏冷CCD、圖像軟件工作站組成。還需要加熱控制器；溫度控制器；CO2控制器；CO2培養(yǎng)箱。用于培養(yǎng)狀態(tài)下細(xì)胞動態(tài)的研究。儀器可以自動聚焦、單細(xì)胞追蹤、多位點(diǎn)成像。成像速度高、圖像清晰度高。四、活細(xì)胞工作站第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法用途：1、活細(xì)胞熒光標(biāo)記蛋白的長時程失蹤觀察2、活細(xì)胞運(yùn)動分化形態(tài)示蹤觀察3、熒光共定位4、熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）5、熒光圖像處理、測量第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法第二節(jié)細(xì)胞組分的分析方法

離心分離技術(shù)

細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、酶、糖與脂類等的顯示方法

特異蛋白抗原的定位與定性

細(xì)胞內(nèi)特異核酸的定位與定性

放射自顯影技術(shù)

定量細(xì)胞化學(xué)分析技術(shù)第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法一、離心分離技術(shù)

用途：于分離細(xì)胞器與生物大分子及其復(fù)合物

差速離心：分離密度不同的細(xì)胞組分

密度梯度離心：精細(xì)組分或生物大分子的分離第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法差速離心A等速度沉降B等密度沉降密度梯度離心第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法二、細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、

酶、糖與脂類等的顯示方法

原理：利用一些顯色劑與所檢測物質(zhì)中一些 特殊基團(tuán)特異性結(jié)合的特征，通過顯色劑在細(xì)胞中的定位及顏色的深淺來判斷某種物質(zhì)在細(xì)胞中的分布和含量。

第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法FeulgenStaining第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法三、特異蛋白抗原的定位與定性

免疫熒光技術(shù)： 快速、靈敏、有特異性，但其分辨率有限（圖）

蛋白電泳(SDS)

與免疫印跡反應(yīng)(Western-Blot)

免疫電鏡技術(shù)：

免疫鐵蛋白技術(shù)

免疫酶標(biāo)技術(shù)

免疫膠體金技術(shù)

應(yīng)用：通過對分泌蛋白的定位，可以確定某種蛋白的分泌動態(tài)；胞內(nèi)酶的研究；膜蛋白的定位與骨架蛋白的定位等第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法四、細(xì)胞內(nèi)特異核酸的定位與定性

光鏡水平的原位雜交技術(shù)

（同位素標(biāo)記或熒光素標(biāo)記的探針）

電鏡水平的原位雜交技術(shù)

（生物素標(biāo)記的探針與抗生物素抗體相連的膠體金標(biāo)記結(jié)合）

PCR技術(shù)

第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法人類染色體端粒DNA的熒光原位雜交照片第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法五、放射自顯影技術(shù)

原理及應(yīng)用：

利用同位素的放射自顯影，對細(xì)胞內(nèi)生物大分子進(jìn)行定性、定位與半定量研究；

實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞內(nèi)生物大分子進(jìn)行動態(tài)研究和追蹤。

步驟：

前體物摻入細(xì)胞（標(biāo)記：持續(xù)標(biāo)記和脈沖標(biāo)記）

———放射自顯影第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法六．定量細(xì)胞化學(xué)分析技術(shù)

細(xì)胞顯微分光光度術(shù)（Microspectrophotometry）

利用細(xì)胞內(nèi)某些物質(zhì)對特異光譜的吸收，測定這些物質(zhì) （如核酸與蛋白質(zhì)等）在細(xì)胞內(nèi)的含量。 包括：紫外光顯微分光光度測定法可見光顯微分光光度測定法

流式細(xì)胞儀（FlowCytometry）

主要應(yīng)用：用于定量測定細(xì)胞中的DNA、RNA或某一特異蛋白的含量； 測定細(xì)胞群體中不同時相細(xì)胞的數(shù)量； 從細(xì)胞群體中分離某些特異染色的細(xì)胞； 分離DNA含量不同的中期染色體。

第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法流式細(xì)胞術(shù)第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法第三節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程與

顯微操作技術(shù)

細(xì)胞的培養(yǎng)

細(xì)胞工程第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法一、細(xì)胞的培養(yǎng)

動物細(xì)胞培養(yǎng)

類型：原代培養(yǎng)細(xì)胞（primaryculturecell） 繼代培養(yǎng)細(xì)胞（sub-culturecell）

細(xì)胞系（cellline）有限細(xì)胞系，永生細(xì)胞系

細(xì)胞株（cellstrain）

植物細(xì)胞

類型：

原生質(zhì)體培養(yǎng)（體細(xì)胞培養(yǎng)）

單倍體細(xì)胞培養(yǎng)（花藥培養(yǎng)）

非細(xì)胞體系（cell-freesystem）

第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法細(xì)胞懸浮液10代細(xì)胞50代細(xì)胞無限傳代原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)細(xì)胞系有限與無限細(xì)胞系如何界定原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)；細(xì)胞株和細(xì)胞系？多數(shù)組織細(xì)胞固定在表面生長和分裂。隨細(xì)胞增多，細(xì)胞就會停止分裂增殖遺傳物質(zhì)改變第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法Hela細(xì)胞（左）、CHO細(xì)胞（右）的培養(yǎng)第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法獲得細(xì)胞細(xì)胞的全能性細(xì)胞株、細(xì)胞系植物體培養(yǎng)結(jié)果或細(xì)胞產(chǎn)物快速繁殖、培育無病毒植株等培養(yǎng)目的葡萄糖、動物血清蔗糖、植物激素培養(yǎng)基特有成分液體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基培養(yǎng)基性質(zhì)細(xì)胞增殖原理動物細(xì)胞培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)比較項(xiàng)目植物細(xì)胞和動物細(xì)胞培養(yǎng)的比較第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用（1）生產(chǎn)蛋白生物制品：病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體等。（2）獲得大量自身的皮膚細(xì)胞，用于植皮。（3）用于檢測有毒物質(zhì)（4）用于生理、病理、藥理等方面的研究，為治療和預(yù)防疾病提供理論依據(jù)這只老鼠身上的“人耳”是由我國科學(xué)家曹誼林教授利用細(xì)胞工程技術(shù)復(fù)制出來的。第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法

二、細(xì)胞工程

細(xì)胞融合（cellfusion）與細(xì)胞雜交（cellhybridization）技術(shù)

單克隆抗體（monocloneantibody）技術(shù)

細(xì)胞拆合與顯微操作技術(shù)

物理法結(jié)合顯微操作技術(shù)(圖1、圖2)

化學(xué)法結(jié)合離心技術(shù)

制備核體（karyoplast）和胞質(zhì)體（cytoplast）。

其它技術(shù)遺傳分析（mutant,knockout,knockin）

對細(xì)胞生命活動的研究成為當(dāng)今生命科學(xué)發(fā)展的瓶頸第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法主要用于制備單克隆抗體獲得雜種植株用途物理、化學(xué)方法（同左）滅活的病毒物理（離心、振蕩、電刺激）化學(xué)（聚乙二醇）誘導(dǎo)方法使細(xì)胞分散后誘導(dǎo)細(xì)胞融合去除細(xì)胞壁后誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合細(xì)胞融合的方法細(xì)胞膜的流動性細(xì)胞膜的流動性、植物細(xì)胞全能性細(xì)胞融合的原理動物細(xì)胞融合植物體細(xì)胞雜交比較項(xiàng)目比較項(xiàng)目（一）植物、動物細(xì)胞融合的比較第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法細(xì)胞融合單克隆抗體技術(shù)第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法(二)單克隆抗體提出問題：長期以來，人們?yōu)榱双@得抗體，采用的是把某種抗原反復(fù)注射到動物體內(nèi)，然后從動物血清中分離出所需抗體的方法。用這種方法獲得的抗體，不僅產(chǎn)量低，而且抗體的特異性差，純度低，反應(yīng)不夠靈敏。單克隆抗體的概念第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法（1）為什么用小鼠骨髓瘤細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞融合？思考：（2）單克隆抗體制備過程中應(yīng)用哪些細(xì)胞工程技術(shù)手段？（3）制備過程為何要經(jīng)過兩次篩選？第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法單克隆抗體有何應(yīng)用？

主要用于疾病的診斷、治療和預(yù)防。與常規(guī)抗體相比，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。如；各種癌癥、肝炎病毒、SARS病毒、細(xì)菌及血吸蟲等數(shù)百種疾病的診斷；在疾病治療方面，單克隆抗體猶如人體衛(wèi)士，能識別“自己”與“異己”，一旦發(fā)現(xiàn)致病因素便與之結(jié)合將其殺死。若在單抗上帶上抗癌藥物制成“生物導(dǎo)彈”，將藥物定向帶到癌細(xì)胞所在部位，既消滅了癌細(xì)胞又不會傷害健康細(xì)胞。第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法

絕大多數(shù)的單克隆抗體(mAb)是用小鼠開發(fā)的，雖然可作為研究和診斷的工具，但它們至少在一定程度上不是理想的治療劑，因?yàn)樗鼈冊谌祟愔杏忻庖咴浴Ｒ簿褪钦f，小鼠抗體引入到病人體內(nèi)，將被病人的免疫系統(tǒng)識別為外源物質(zhì)，并將發(fā)生有損治療抗體利用的人抗鼠抗體(HAMA)應(yīng)答。已經(jīng)通過將這些鼠的抗體人源化或直接制備人的mAb來解決。

最近，通過用人免疫球蛋白基因取代小鼠免疫球蛋白基因創(chuàng)建了產(chǎn)生人抗體