DB41T 706-2011 豬傳染性胃腸炎病毒與流行性腹瀉病毒二重RT-PCR鑒別診斷試驗方法

DB41河南省質量技術監(jiān)督局發(fā)布I1豬傳染性胃腸炎病毒與流行性腹瀉病毒二重RT-PCR鑒別診斷試驗方法二重反轉錄聚合酶鏈式反應(二重RT-PCR)二重RT-PCR是在同一反轉錄體系內加入兩條分別針對二種病毒相應基因序列的反轉錄過一次PCR反應，可同時擴增出二種病毒相應核酸片段的RT-P酯（DEPC）處理水（見附錄A）2℃~8℃保存。PCR擴增儀，高速冷凍離心機（離心力應在12000×g以上電泳儀和水平電泳槽，恒溫水22℃~8℃冰箱20℃冰箱，單道微量移液器（0.5μL～10μL；2μL～20μL；20μL～200μL；100μL~），4樣品的采集、處理、存放及運輸4.1樣品的采集及處理4.1.1組織樣品用無菌的剪刀剪取豬小腸組織0.5g于組織勻漿器或研缽中充分勻漿或研磨，或用刀片刮取病死豬胃腸道粘膜放入無菌1.5mL離心管中，加0.3mL～0.5mL組織懸液混勻，將組織懸液轉入無菌1.5mL4.1.2腸內容物樣品無菌取小腸內容物樣品3g，置于無菌離心管中，加0.5mL～1.0mL腸內容物懸液混勻，4℃條件-1離心10min，取上清轉入新的無菌1.5mL離心管中，編號備用。4.1.3肛門拭子樣品4.2存放與運送采集或處理的樣品在2℃~8℃條件下保存應不超過24h，密封后，冷藏保存，及時運送到實驗室。若需長期保存，應放置于－40℃以下處冷凍保存，應避免5操作方法）；）；），上清，倒置于吸水紙上，吸干液體，不同樣品3配制反轉錄反應混合液（反轉錄反應混合液組成參見附錄C.2.1向每管中分別加入5.1.6中相滅活反轉錄酶，直接用于下面的PCR擴增或－20℃配制PCR反應混合液（PCR反應混合液組成參見附錄C.2.2），在室溫下融化后，瞬時離心使液體全PCR擴增條件：95℃預變性5min后，94℃45s，51℃45s，72℃延伸10min。擴增反應結束后取出放置于2℃~8℃。5.4PCR擴增產物的電泳檢測-1)，倒入膠槽制備凝膠板。在電泳槽中加入核酸電泳緩沖液，使液面剛剛沒過凝膠。取5μL～10μLPCR擴增產物分別和1μL～2μL的6×上樣緩沖液混合豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉病毒陽性對照的PCR產物，經電泳后在869bp和448bp位置異性條帶，同時陰性對照PCR產物電泳后沒有任何條帶，則檢測試驗結果成立，否則4在試驗結果成立的前提下，如果待檢樣品的PCR產物電泳后在869bp和448bp的位置上同時出現(xiàn)特異特異條帶，判定為豬流行性腹瀉病毒核酸檢測陽性（參見附5試劑的配制-1（pH7.2）的磷酸鹽緩沖液（PBS）的配制：Na2HPO42O35.6g）先用適量蒸餾水溶解，最后用蒸餾水稀釋并定容至1000mL。A.5DEPC處理水：用0.1%A.6陽性對照樣品：經滅活的豬流行性腹瀉和豬傳染A.7陰性對照樣品：正常細胞培養(yǎng)液。6豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉病毒二重RT-PCR試驗所豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉病毒二重RT-PCR試驗所用引物見PCR擴增上游引物5'-TCATTCTTCAACCCCATAAC-3'PCR擴增下游引物5'-AAGGAATTGTCCAGTCTTAG-3'PCR擴增上游引物5'-CTGCGTTCTTGTATGGTGT-3'PCR擴增下游引物5'-TGAAGCATTGACTGAACGAC-3'7豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉病毒二重RT-PCR試驗反應混合液組C.1豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉病毒二重RT-PCR試驗反應混合液組成豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉病毒二重RT-PCR試驗反應混合液組成見表C表C.1豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉病毒二重RT-PCR試PCR反應混合液40μL150μLC.2.3裂解液的主要成分是TriZol，C.2.4DEPC水，用0.1%DEPC處理后的去離子水，經121℃15min高壓處理，用于溶C.2.5反轉錄反應混合液中分別含豬傳染性胃腸炎或流行性腹瀉病毒反轉錄引物、反轉錄酶及各種離8C.2.6PCR反應混合液中含豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉病毒特異