（生物科技行業(yè)）微生物檢驗(yàn)技術(shù)

有：普通光學(xué)顯微鏡、暗視野顯微鏡、相差顯微鏡、熒光顯微鏡和電品微生物檢驗(yàn)中最常用的還是普通光學(xué)顯微鏡。光學(xué)顯微鏡是由光學(xué)放大系統(tǒng)和機(jī)械裝置兩部分組成。光學(xué)系光器、光源等；機(jī)械系統(tǒng)一般包括鏡筒、物鏡轉(zhuǎn)換器、鏡臺(tái)、鏡臂和底座等。（圖3-1)標(biāo)本的放大主要由物鏡完成，物鏡放大倍數(shù)越大，它的焦距越短。焦距越和玻片間距離（工作距離）也小。油鏡的工作距離很短，使用時(shí)需格外注大作用，不能提高分辨率，標(biāo)準(zhǔn)目鏡的放大倍數(shù)是十倍。聚光鏡能使光線物鏡，形成一個(gè)大角度的錐形光柱，因而對(duì)提高物鏡分辨率是很重要的。移動(dòng)，以調(diào)節(jié)光的明暗，可變光闌可以調(diào)節(jié)入射光束的大小。顯微鏡用光源，自然光和燈光都可以，以燈光較好，因光色和微鏡可用普通的燈光，質(zhì)量高的顯微鏡要用顯微鏡燈，才能充分發(fā)揮其強(qiáng)照明，如暗視野照明、攝影等，常常使用鹵素?zé)糇鳛楣庠?。圖3-1光學(xué)顯微鏡結(jié)構(gòu)圖顯微鏡的放大效能（分辨率）是由所用光波長短和物鏡數(shù)值口長或增加數(shù)值口徑可以提高分辨率，可見光的光波幅度比較窄，紫外光辨率，但不能用肉眼直接觀察。所以利用減小光波長來提高光學(xué)顯微鏡提高數(shù)值口徑是提高分辨率的理想措施。要增加數(shù)值口徑，可以提高介樣光線可以不發(fā)生折射而直接通過載片、香柏油進(jìn)入物鏡，從而提高分放大倍數(shù)是目鏡和物鏡放大倍數(shù)的乘積，而物鏡的放大倍數(shù)越高，分辨率越高。先將低倍物鏡的位置固定好，然后放置標(biāo)本片，轉(zhuǎn)動(dòng)反光鏡下調(diào)至看到標(biāo)本，再用細(xì)調(diào)對(duì)準(zhǔn)焦距進(jìn)行觀察。除少數(shù)顯微鏡外，最高點(diǎn)。如果視野中出現(xiàn)外界物體的圖像，可以將聚光鏡稍微下降光鏡下的虹彩光圈應(yīng)調(diào)到適當(dāng)?shù)拇笮。钥刂粕淙牍饩€的量，增加明暗差。顯微鏡的設(shè)計(jì)一般是共焦點(diǎn)的。低倍鏡對(duì)準(zhǔn)焦點(diǎn)后，轉(zhuǎn)換到高要稍微轉(zhuǎn)動(dòng)微調(diào)即可。有些簡易的顯微鏡不是共焦點(diǎn)，或者是由于焦點(diǎn)，就要采取將高倍物鏡下移，再向上調(diào)準(zhǔn)焦點(diǎn)的方法。虹彩光足夠的光錐角度。稍微上下移動(dòng)聚光鏡，觀察圖像是否清晰。油浸鏡的工作距離很小，所以要防止載皮片和物鏡上的透鏡損倍、高倍到油浸鏡。當(dāng)高倍物鏡對(duì)準(zhǔn)標(biāo)本后，再加油浸鏡觀察。載玻片低倍和高倍物鏡，直接用油浸鏡觀察。顯微鏡有自動(dòng)止降裝置的，載油浸鏡下移到油滴中，到停止下降為止，然后用微調(diào)向上調(diào)準(zhǔn)焦點(diǎn)的，對(duì)準(zhǔn)焦點(diǎn)的方法是從顯微鏡的側(cè)面觀察，后用微調(diào)向上提升調(diào)準(zhǔn)焦點(diǎn)。使用油浸鏡時(shí)，鏡臺(tái)要保持水平，防止油流動(dòng)。油浸鏡所用的油要潔凈最高點(diǎn)，并放大聚光鏡下的虹彩光圈，否則會(huì)降低數(shù)值口徑而影響或高倍鏡觀察，都宜用可調(diào)節(jié)的顯微鏡燈作光源。次，最后再用擦鏡紙將二甲苯擦去。鏡頭的保護(hù)最為重要。鏡頭要保持清潔，只能用軟而沒有短絨毛的擦鏡放在紙盒中，以防沾染灰塵。切勿用手絹或紗布等擦鏡頭。物鏡在必要洗，但要注意防止溶解固定透鏡的膠固劑。根據(jù)不同的膠固劑，可精、丙酮和二甲苯等，其中最安全的是二甲苯。方法是用脫脂棉花團(tuán)蘸取輕擦，并立即用擦鏡紙將二甲苯擦去，然后用洗耳球吹去可能殘留的短絨可以在顯微鏡下檢視。轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡，如果視野中可以看到污點(diǎn)隨著轉(zhuǎn)動(dòng)，則污物，可用擦鏡紙擦拭接目的透鏡。如果還不能除去，再擦拭下面的透鏡球?qū)⒍探q吹去。在擦拭目鏡或由于其他原因需要取下目鏡時(shí)，都要用擦鏡好，以防灰塵進(jìn)入鏡筒內(nèi)，落在鏡筒下面的物鏡上。利用血球計(jì)數(shù)器在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)是一種常見的微生物計(jì)總數(shù)和蓋片間的容積一定，所以可以根據(jù)顯微鏡下觀察到的微生物數(shù)目來計(jì)物總數(shù)。血球計(jì)數(shù)器是一只特制載玻片。載片上有兩個(gè)方格網(wǎng)，每一方格網(wǎng)間的一個(gè)大方格用來做微生物計(jì)數(shù)，所以又稱為計(jì)數(shù)室。計(jì)數(shù)或16×25）400個(gè)小方格。（圖3-2)因?yàn)槊總€(gè)大方格邊長為1毫米，載片與蓋片間距離圖3-2兩種血球計(jì)數(shù)板格）的菌數(shù)。不大，與周圍背景沒有明顯的明暗差。所以，除了觀察活體微生物細(xì)胞的算菌數(shù)外，絕大多數(shù)情況下都必須經(jīng)過染色后，才能在顯微鏡下進(jìn)行觀察項(xiàng)技術(shù)都不是完美無缺的。染色后的微生物標(biāo)本是死的，在染色過程中微構(gòu)均會(huì)發(fā)生一些變化，不能完全代表其生活細(xì)胞的真實(shí)情況，染色觀察時(shí)必須注意。微生物染色的基本原理，是借助物理因素和化學(xué)因素的作用而進(jìn)行的。細(xì)胞物質(zhì)對(duì)染料的毛細(xì)現(xiàn)象、滲透、吸附作用等?；瘜W(xué)因素則是根據(jù)同性質(zhì)而發(fā)生地各種化學(xué)反應(yīng)。酸性物質(zhì)對(duì)于堿性染料較易吸附，易于吸附。但是，要使酸性物質(zhì)染上酸性材料，必須把它們把它們變?yōu)檫m宜的物理形式，也同樣能與堿性染料發(fā)生吸附作用。電離后帶陰電荷；而堿性染料電離時(shí)染料離子帶陽電。因此，帶陰電的堿性染料進(jìn)行結(jié)合。所以，在細(xì)菌學(xué)上常用堿性染料進(jìn)行染色。影響染色的其它因素，還有菌體細(xì)胞的構(gòu)造和其外膜的通透性，如細(xì)胞的大小和細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整與否，在染色上都起一染料分為天然染料和人工染料兩種。天然染料有胭脂蟲紅、地衣們多從植物體中提取得到，其成分復(fù)雜，有些至今還未搞清楚。目前主也稱煤焦油染料，多從煤焦油中提取獲得，是苯的衍生物。多數(shù)染料為類，難溶于水，而易溶于有機(jī)溶劑中。為使它們易溶于水，通常制成鹽類。染料可按其電離后染料離子所帶電荷的性質(zhì)，分為酸性染料、堿料和單純?nèi)玖纤拇箢?。這類染料電離后染料離子帶負(fù)電，如伊紅、剛果紅、藻紅、苯胺黑、苦味增加，這時(shí)選擇酸性染料，易被染色。這類染料電離后染料離子帶正電，可與酸性物質(zhì)結(jié)合成鹽。微生物實(shí)驗(yàn)室一染料有美蘭、甲基紫、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅、中性紅、孔雀綠和蕃紅等細(xì)菌易被堿性染料染色。這類染料的化學(xué)親和力低，不能和被染的物質(zhì)生成鹽，其染色能力視其是否定，因?yàn)樗鼈兇蠖鄶?shù)都屬于偶氮化合物，不溶于水，但溶于脂微生物的染色方法很多，各種方法應(yīng)用的染料也不盡相同，但是一般染一套染色操作程序。在干凈的載玻片上滴上一滴蒸餾水，用接種環(huán)進(jìn)行無菌操作，挑取培養(yǎng)物不利觀察個(gè)體形態(tài)，可在載玻片之一側(cè)再加一滴水，從已涂布的中進(jìn)行稀釋，涂布成薄層，若材料為液體培養(yǎng)物或固體培養(yǎng)物中涂布于載玻片上即可。涂片最好在室溫下使其自然干燥，有時(shí)為了使之干得更快些，可片一端的兩側(cè)，小心地在酒精燈上高處微微加熱，使水分蒸發(fā)，但切間過長，以防標(biāo)本烤枯而變形。1)殺死微生物，固定細(xì)胞結(jié)構(gòu)。2)保證菌體能更牢的粘附在載玻片上，防止標(biāo)本被水沖洗掉。3)改變?nèi)玖蠈?duì)細(xì)胞的通透性，因?yàn)樗赖脑|(zhì)比活的原生質(zhì)易于染色。），用。應(yīng)用餓酸固定細(xì)胞的技術(shù)如下：在培養(yǎng)皿中放一玻璃，標(biāo)本固定后，滴加染色液。染色的時(shí)間各不相同，視標(biāo)本與染料的性質(zhì)標(biāo)本的部分）應(yīng)該浸在染料之中。若作復(fù)合染色，在媒染處理時(shí)，媒染劑與染料形成不溶性化合物，和力。一般固定后媒染，但也可以結(jié)合固定或染色同時(shí)進(jìn)行。5、脫色用醇類或酸類處理染色的細(xì)胞，使之脫色。可檢查染料與細(xì)6、復(fù)染脫色后再用一種染色劑進(jìn)行染色，與不被脫色部位形成鮮明的對(duì)照，便于在酒精脫色后用番紅，石碳酸復(fù)紅最后進(jìn)行染色，就是復(fù)染。7、水洗染色到一定的時(shí)候，用細(xì)小的水流從標(biāo)本的背面把多余的染料沖則保留。8、干燥著色標(biāo)本洗凈后，將標(biāo)本晾干，或用吸水紙把多余的水吸去，水紙時(shí)，切勿使載玻片翻轉(zhuǎn)，以免將菌體擦掉。9、鏡檢干燥后的標(biāo)本可用顯微鏡觀察。微生物染色方法一般分為單染色法和復(fù)染色法兩種。前者用一種染料使能鑒別微生物。復(fù)染色法是用兩種或兩種以上染料，有協(xié)助鑒別微生物的別染色法。常用的復(fù)染色法有革蘭氏染色法和抗酸性染色法，此外還有鑒構(gòu)的（如芽胞、鞭毛、細(xì)胞核等）特殊染色法。食品微生物檢驗(yàn)中常用的蘭氏染色法。1、單染色法細(xì)菌菌體多帶負(fù)電荷，易于和帶正電荷的堿性染料結(jié)合而被染色。因行單染色，如美蘭、孔雀綠、堿性復(fù)紅、結(jié)晶紫和中性紅等。若使用酸），單染色一般要經(jīng)過涂片、固定、染色、水洗和干燥五個(gè)步驟。石碳酸復(fù)紅染色液：著色快，時(shí)間短，菌體呈紅色。美蘭染色液：著色慢，時(shí)間長，效果清晰，菌體呈蘭色。草酸銨結(jié)晶染色液：染色迅速，著色深，菌體呈紫色。2、革蘭氏染色法細(xì)菌先經(jīng)堿性染料結(jié)晶染色，而經(jīng)碘液媒染后，用酒精脫色，在一定陽性菌仍帶紫色，陰性菌則被染上紅色。有芽胞的桿菌和絕大多數(shù)和線菌和真菌都呈革蘭氏正反應(yīng)；弧菌，螺旋體和大多數(shù)致病性的無應(yīng)。革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌在化學(xué)組成和生理性質(zhì)上有很多差在一般認(rèn)為革蘭氏陽性菌體內(nèi)含有特殊的核蛋白質(zhì)鎂鹽與多糖的復(fù)合物，的復(fù)合物結(jié)合很牢，不易脫色，陰性菌復(fù)合物結(jié)合程度底，吸附染料差，色反應(yīng)的主要依據(jù)。很多，因此不易脫去，陰性菌則相反。所以染色時(shí)的條件要嚴(yán)格控制。被脫色，陰性菌透性大，易脫色。所以脫色時(shí)間，脫色方法也應(yīng)嚴(yán)格控制。1)涂片固定。2)草酸銨結(jié)晶紫染1分鐘。3)自來水沖洗。4)加碘液覆蓋涂面染1分鐘。5)水洗，用吸水紙吸去水分。6)加95%酒精數(shù)滴，并輕輕搖動(dòng)進(jìn)行脫色，30秒后水洗，吸去水7)蕃紅梁色液（?。┤?0秒鐘后，自來水沖洗。干燥，鏡檢。染色的結(jié)果，革蘭氏正反應(yīng)菌體都呈紫色，負(fù)反應(yīng)菌體都呈紅色。劑等方法殺滅物體表面和內(nèi)部的病原菌營養(yǎng)體的方法，而滅菌是指用物理和表面和內(nèi)部的所有微生物，使之呈無菌狀態(tài)。利用溫度進(jìn)行滅菌、消毒或防腐，是最常用而又方便有效的方法的蛋白質(zhì)和酶類發(fā)生變性而失活，從而起滅菌作用，低溫通常起抑菌作用。1)干熱滅菌法:a.灼燒滅菌法：利用火焰直接把微生物燒死。此法徹底可靠，滅菌迅速，但易焚毀物品，所以使用范圍有限，只適合于接種針、環(huán)、試管口及不能用的污染物等的滅菌。b.干熱空氣滅菌法：這是實(shí)驗(yàn)室中常用的一種方法，即把待滅菌的物品均勻地放入烘箱2)濕熱滅菌法:在同樣的溫度下，濕熱滅菌的效果比干熱滅菌好，這是因?yàn)橐环矫婕?xì)胞高，容易變性。另一方面高溫水蒸汽對(duì)蛋白質(zhì)有高度的穿透力，速死亡。a.巴氏消毒法：有些食物會(huì)因高溫破壞營養(yǎng)成分或影響質(zhì)量，如牛奶、醬油、啤酒等，所以只能用較低的溫度來殺死其中的病原微生物，這樣既保持食物學(xué)家巴斯德首創(chuàng)，故名為巴氏消毒法。毛巾及解剖用具的消毒。c.間歇滅菌法：上述兩種方法在常壓下，只能起到消毒作用，而很難做到完全無菌。若采用間歇滅菌的方法，就能殺滅物品中所有的微生物。具體做法是：將壓滅菌鍋，適于推廣，但操作麻煩，所需時(shí)間長。d.加壓蒸汽滅菌法：這是發(fā)酵工業(yè)、醫(yī)療保健、食品檢測(cè)和微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中最常用的一種滅菌方法。它適用于各種耐熱、體積大的培養(yǎng)基的滅菌，也適用于玻物品的滅菌。加壓蒸汽滅菌是把待滅菌的物品放在一個(gè)可密閉的加壓蒸汽滅菌鍋中進(jìn)多、傳熱差的物品，則應(yīng)適當(dāng)延長滅菌時(shí)間。在加壓蒸汽滅菌中，要引起注意的一個(gè)問題是，在恒壓之前，一定要排盡氣，否則表上的蒸汽壓與蒸汽溫度之間不具對(duì)應(yīng)關(guān)系，這樣會(huì)大大降低滅菌效果。3)影響滅菌的因素a.不同的微生物或同種微生物的不同菌齡對(duì)高溫的敏感性不同。多數(shù)微生物的營養(yǎng)體和病齡菌對(duì)熱更敏感。b.微生物的數(shù)量多少顯然會(huì)影響滅菌的效果，數(shù)量越多，熱死時(shí)間越長。c.培養(yǎng)基的成分與組成也會(huì)影響滅菌效果。一般地講，蛋白質(zhì)、糖或脂肪存在，則提高抗產(chǎn)生不同的影響；固體培養(yǎng)基要比液體培養(yǎng)基滅菌時(shí)間長。4)滅菌對(duì)培養(yǎng)基成分的影響c.不少培養(yǎng)基顏色加深。d.體積和濃度有所變化。e.營養(yǎng)成分有時(shí)受到破壞。2、輻射1)接種室、手術(shù)室、食品、藥物包裝室常應(yīng)用紫外線殺菌。2)應(yīng)用β射線作食品表面殺菌，γ射線用于食品內(nèi)部殺菌。經(jīng)輻射后的食品，因大量微生物被殺滅，再用冷凍保藏，可使保存期延長。3、過濾采用機(jī)械方法，設(shè)計(jì)一種濾孔比細(xì)菌還小的篩子，做成各種過濾器。通過培養(yǎng)基從篩子中流下，而把各種微生物菌體留在篩子上面，從而達(dá)到除菌方法適用于一些對(duì)熱不穩(wěn)定的體積小的液體培養(yǎng)基的滅菌以及氣體的點(diǎn)是不破壞培養(yǎng)基中各種物質(zhì)的化學(xué)成分。但是比細(xì)菌還小的病毒仍然內(nèi)，有時(shí)會(huì)給實(shí)驗(yàn)帶來一定的麻煩。一般化學(xué)藥劑無法殺死所有的微生物，而只能殺死其中的病原微作用，而不是滅菌劑。能迅速殺滅病原微生物的藥物，稱為消毒劑。能抑制或阻止微生物防腐劑。但是一種化學(xué)藥物是殺菌還是抑菌，常不易嚴(yán)格區(qū)分。消能殺死或抑制病原微生物，而且對(duì)人體組織細(xì)胞也有損傷作用，汞、碘酒、酒精等。在制備培養(yǎng)基的過程中，首先要使用一些玻璃器皿，如試管、三角瓶、培管等。這些器皿在使用前都要根據(jù)不同的情況，經(jīng)過一定的處理，洗刷行包裝，經(jīng)過滅菌等準(zhǔn)備就緒后，才能使用。除去包裝沾染的污垢后，先用熱肥皂水刷洗，流水沖凈，再浸泡于1~2%的工業(yè)鹽酸中數(shù)小時(shí)，使游離的堿性物質(zhì)除去，再以流水沖凈。對(duì)容量較大的器皿，等，洗凈后注入濃鹽酸少許，轉(zhuǎn)動(dòng)容器使其內(nèi)部表面均沾以流水沖凈，倒置于洗滌架上將水空干，即可使用。凡確無病原菌或未被帶菌物污染的器皿，使用后可隨時(shí)沖洗，吸取先浸泡于清水中，待到一定數(shù)量后再集中進(jìn)行清洗。有可能被病原菌污染過適當(dāng)消毒后，將污垢除去，用皂液洗刷，再用流水沖洗干凈。若用皂皿，可用洗液浸泡適當(dāng)時(shí)間后再用清水洗凈。洗液的主要成份是重用是將有機(jī)物氧化成可溶性物質(zhì)，以便沖洗。洗液有很強(qiáng)心，避免濺到衣服、身體和其他物品上。在實(shí)驗(yàn)室中配制的適合微生物生長繁殖或累積代謝產(chǎn)物的任何營養(yǎng)基質(zhì)類很多。我們可根據(jù)某種標(biāo)準(zhǔn)，將種類繁多的培養(yǎng)基劃分為若干類型。成培養(yǎng)基和半合成培養(yǎng)基。1)天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基是指利用各種動(dòng)、植物或微生物的原料，其成分難以確切知道。用作這種培養(yǎng)基的主要原料有：牛肉膏、麥芽汁、蛋白胨、酵母膏、玉米粉、麩皮、各種餅粉、馬鈴薯、牛奶、血清等。用這些物質(zhì)配成的培養(yǎng)基雖然不成分，但一般來講，營養(yǎng)是比較豐富的，微生物生長旺盛，而且來源廣泛以較為常用，尤其適合于配制實(shí)驗(yàn)室常用的培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基的穩(wěn)定性號(hào)等因素的影響。2)合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基是一類化學(xué)成分和數(shù)量完全知道的培養(yǎng)基，它是用已知化學(xué)成分的化學(xué)藥品配制而成。這類培養(yǎng)基化學(xué)成分精確、重復(fù)性生長緩慢，所以它只適用于做一些科學(xué)研究，例如營養(yǎng)、代謝的研究。3)半合成培養(yǎng)基在合成培養(yǎng)基中，加入某種或幾種天然成分；或者在天然培養(yǎng)基中，加入一種或幾種已知成分的化學(xué)藥品即成半合成培養(yǎng)基。例如馬鈴薯養(yǎng)基在生產(chǎn)實(shí)踐和實(shí)驗(yàn)室中使用最多。2、根據(jù)培養(yǎng)基的物理狀態(tài)來區(qū)分，可以分為固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基和半固體培養(yǎng)基。1)液體培養(yǎng)基所配制的培養(yǎng)基是液態(tài)的，其中的成分基本上溶于水，沒有明顯的固形物，液體培養(yǎng)基營養(yǎng)成分分布均勻，易于控制微生物的生長代謝狀態(tài)。2)固體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基中加入適量的凝固劑即成固體培養(yǎng)基。常用作凝固劑的物質(zhì)有瓊脂、明膠、硅膠等，以瓊脂最為常用。固體培養(yǎng)基在實(shí)際中用得中，它被用作微生物的分離、鑒定、檢驗(yàn)雜菌、計(jì)數(shù)、保藏、生物測(cè)定等。3)半固體培養(yǎng)基如果把少量的凝固劑加入到液體培養(yǎng)基中，就制成了半固體培養(yǎng)基。以保藏菌種。3、根據(jù)培養(yǎng)基的用途來區(qū)分，可分為選擇培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基等。1)選擇培養(yǎng)基在培養(yǎng)基中加入某種物質(zhì)以殺死或抑制不需要的菌種生長的培養(yǎng)基，稱之為選擇培養(yǎng)基。如鏈霉素、氯霉素等抑制原核微生物的生長；而制霉菌素、灰黃霉素微生物的生長；結(jié)晶紫能抑制革蘭氏陽性細(xì)菌的生長等。2)增殖培養(yǎng)基在自然界中，不同種的微生物常生活在一起，為了分離我們所需要的微生物，在普通培養(yǎng)基中加入一些某種微生物特別喜歡的營養(yǎng)物質(zhì)，以增加這種微生物漸淘汰其它微生物，這種培養(yǎng)基稱為增殖培養(yǎng)基，這種培養(yǎng)基常用于菌種篩選和選擇增菌中。在某種程度上講，增殖培養(yǎng)基也是一種選擇培養(yǎng)基。3)鑒別培養(yǎng)基在培養(yǎng)基中加入某種試劑或化學(xué)藥品，使難以區(qū)分的微生物經(jīng)培養(yǎng)后呈現(xiàn)出明顯差別，因而有助開快速鑒別某種微生物。這樣的培養(yǎng)基稱之為鑒別培養(yǎng)水和乳品中是否含有腸道致病菌的伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基就是一種常用的鑒別性培養(yǎng)基。有些培養(yǎng)基是具有選擇和鑒別雙重作用。例如食品檢驗(yàn)中常用的麥康凱培），劑）能幫助區(qū)別乳糖發(fā)酵腸道菌（如大腸桿菌）和不能發(fā)酵乳糖的腸道致病菌（這類術(shù)語主要是用在微生物遺傳學(xué)中。根據(jù)培養(yǎng)基用于生產(chǎn)的目的來區(qū)分，可以基和發(fā)酵培養(yǎng)基。還有專門用于培養(yǎng)病毒等寄生微生物的活組織培養(yǎng)基，如雞胚培養(yǎng)自養(yǎng)微生物的無機(jī)鹽培養(yǎng)基等。1、培養(yǎng)基配方的選定規(guī)定進(jìn)行配制外，一般均應(yīng)盡量收集有關(guān)資料，加以比較核對(duì)，再依據(jù)自己的選用，記錄其來源。2、培養(yǎng)基的制備記錄值、消毒的溫度和時(shí)間制備的日期和制備者等，記錄應(yīng)復(fù)制一份，原記錄保存隨制好的培養(yǎng)基一同存放、以防發(fā)生混亂。3、培養(yǎng)基成分的稱取培養(yǎng)基的各種成分必須精確稱取并要注意防止錯(cuò)亂，最好一次完成，不要中斷傍側(cè)，每稱完一種成分即在配方面軍做出記號(hào)，并將所需稱取的藥品一次取種稱取完畢后，即移放于右側(cè)。完全稱取完畢后，還應(yīng)進(jìn)行一次檢查。4、培養(yǎng)基各成份的混合和溶化培養(yǎng)基所用化學(xué)藥品均應(yīng)是化學(xué)純的。使用的蒸煮鍋不得為銅鍋或鐵鍋，以防入培養(yǎng)基中，使細(xì)菌不易生長。最好使用不銹鋼萵加熱溶化，可放入大蒸汽滅菌器或流動(dòng)蒸汽消毒器中蒸煮溶化。在鍋中溶化時(shí)、可先用溫水焦化、如發(fā)現(xiàn)有焦化現(xiàn)象、該培養(yǎng)基即不能使用，應(yīng)重新制備。待大部用較小火力使所有成分完全溶化，迄至煮沸。如為瓊脂溶化，用另一部后將兩溶液充分混合。在加熱溶化過程中，因蒸發(fā)而丟失的水分，最后必須加以補(bǔ)足。將培養(yǎng)基煮沸數(shù)分鐘，以利培養(yǎng)基沉淀物的析出。6、培養(yǎng)基的過濾澄清液體培養(yǎng)基必須絕對(duì)澄清，瓊脂培養(yǎng)基也應(yīng)透明無顯著沉淀，因此，須方法以達(dá)到此項(xiàng)要求。一般液體培養(yǎng)基可用濾紙過濾法，濾紙應(yīng)折因液壓不均勻而引起濾紙破裂。瓊脂培養(yǎng)基可用清潔的白色薄絨布趁熱過濾。亦可用中間夾有薄層吸水棉的雙制肉、肝、血和土豆等浸液時(shí)、則須先用絨布將碎渣濾去，再用濾紙反復(fù)過濾7、培養(yǎng)基的分裝培養(yǎng)基的分裝，應(yīng)按使用的目的和要求，分裝于試管、燒瓶等適當(dāng)容器內(nèi)。分8、培養(yǎng)基的滅菌定，即可用此法滅菌。菌操作技術(shù)、定量加于培養(yǎng)基。明膠培養(yǎng)基亦應(yīng)用較低溫度滅菌。血9、培養(yǎng)基的質(zhì)量測(cè)試每批培養(yǎng)基制備好以后，應(yīng)仔細(xì)檢查一遍，如發(fā)現(xiàn)破裂、水分浸入、原因并重復(fù)接種一次，如結(jié)果仍同前，則該批培養(yǎng)基即應(yīng)棄去，不能使用。培養(yǎng)基應(yīng)存放于冷暗處，最好能放于普通冰箱內(nèi)。放置時(shí)間不宜超過一周，傾將微生物接到適于它生長繁殖的人工培養(yǎng)基上或活的生物體內(nèi)的過程叫做接種。1、接種工具和方法在實(shí)驗(yàn)室或工廠實(shí)踐中，用得最多的接種工具是接種環(huán)、接種針。由于接種工具進(jìn)行液體接種。在固體培養(yǎng)基表面要將菌液均勻涂布時(shí)，需要用到涂布棒。（圖3-3)圖3-3接種和分離工具1．接種針2.接種環(huán)3.接種鉤4.5.玻璃涂棒6.接種圈7.接種鋤8.小解剖刀1)劃線接種這是最常用的接種方法。即在固體培養(yǎng)基表面作來回直線形的移動(dòng)，就可達(dá)到接種的作用。常用的接種工具有接種環(huán)，接種針等。在斜面接種和平板劃線中就常用此法。2)三點(diǎn)接種在研究霉菌形態(tài)時(shí)常用此法。此法即把少量的微生物接種在平板表面上，成等邊三角形的三點(diǎn)，讓它各自獨(dú)立形成菌落后，來觀察、研究它們的形多點(diǎn)進(jìn)行接種的。3)穿刺接種在保藏厭氧菌種或研究微生物的動(dòng)力時(shí)常采用此法。做穿刺接種時(shí)，用的接種工具是接種針。用的培養(yǎng)基一般是半固體培養(yǎng)基。它的做法是：用接種針蘸取少量固體培養(yǎng)基中心向管底作直線穿刺，如某細(xì)菌具有鞭毛而能運(yùn)動(dòng)，則在穿刺線周圍能夠生長。4)澆混接種該法是將待接的微生物先放入培養(yǎng)皿中，然后再倒入冷卻至45°C左右的固體培養(yǎng)基，迅速輕輕搖勻，這樣菌液就達(dá)到稀釋的目的。待平板凝固之后，置合適溫度長出單個(gè)的微生物菌落。5)涂布接種與澆混接種略有不同，就是先倒好平板，讓其凝固，然后再將菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作來回左右的涂布，讓菌液均勻分布，就可落。6)液體接種從固體培養(yǎng)基中將菌洗下，倒入液體培養(yǎng)基中，或者從液體培養(yǎng)物中，用移液管將菌液接至液體培養(yǎng)基中，或從液體培養(yǎng)物中將菌液移至固體培養(yǎng)基中，都可稱為液體接種。7)注射接種該法是用注射的方法將待接的微生物轉(zhuǎn)接至活的生物體內(nèi)，如人或其它動(dòng)物中，常見的疫苗預(yù)防接種，就是用注射接種，接入人體，來預(yù)防某些疾病。8)活體接種活體接種是專門用于培養(yǎng)病毒或其它病原微生物的一種方法，因?yàn)椴《颈仨毥臃N于活的生物體內(nèi)才能生長繁殖。所用的活體可以是整個(gè)動(dòng)物；也可以是某個(gè)猴腎等；也可以是發(fā)育的雞胚。接種的方式是注射，也可以是拌料喂養(yǎng)。2、無菌操作培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后，用經(jīng)過滅菌的工具（如接種針和吸管等）在無菌條件種接種必須是無菌操作。實(shí)驗(yàn)臺(tái)面不論是什么材料，一律要求光滑、水平。光滑是便于用養(yǎng)基時(shí)利于培養(yǎng)皿內(nèi)平板的厚度保持一致。在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上方，空氣流動(dòng)應(yīng)少，其周圍雜菌也應(yīng)越少越好。為此，必須清掃室內(nèi)，關(guān)閉實(shí)驗(yàn)室氣消毒處理，盡可能地減少雜菌的數(shù)量。空氣中的雜菌在氣流小的情況下，隨著灰塵落下，所以接種時(shí)，打開培養(yǎng)皿的時(shí)間應(yīng)盡量短。用于接種的器具必須經(jīng)干熱或火焰等滅菌。接種環(huán)的火焰滅菌方法：通常接種環(huán)在冷卻到室溫后，方可用它來挑取含菌材料或菌體，迅速地接種到新的培養(yǎng)基上。（圖3-4)然后，將接種環(huán)從柄部至環(huán)端逐漸通過火焰滅菌，復(fù)原。不要直接燒環(huán)，以免殘留在菌體爆濺而污染空間。平板接種時(shí)，通常把平板的面傾斜，把培養(yǎng)皿的蓋打開一小種。在向培養(yǎng)皿內(nèi)倒培養(yǎng)基或接種時(shí)，試管口或瓶壁外面不要接觸底皿邊，試管或一下在火焰上通過。圖3-4斜面接種時(shí)的無菌操作(1)接種滅菌(2)開啟棉塞(3)管口滅菌(4)挑起菌苔(5)接種(6)塞好棉塞微生物一般均要求為純的培養(yǎng)物。得到純培養(yǎng)的過程稱為分離純化，方法有許多種。1、傾注平板法脂培養(yǎng)基充分混合，然后把這混合液傾注到無菌的培養(yǎng)皿中，待凝固之后，把箱中培養(yǎng)。單一細(xì)胞經(jīng)過多次增殖后形成一個(gè)菌落，取單個(gè)菌落制成懸液，重次，便可得到純培養(yǎng)物。（圖3-5,a）圖3-5傾注平板法（a）涂布平板法（b）圖解1.菌懸液2.熔化的培養(yǎng)基3.培養(yǎng)物4.無菌水2、涂布平板法首先把微生物懸液通過適當(dāng)?shù)南♂?，取一定量的稀釋液放在無菌的上，然后用無菌的玻璃刮刀把稀釋液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面上，經(jīng)菌落。（圖3-5,b）3、平板劃線法最簡單的分離微生物的方法是平板劃線法。用無菌的接種環(huán)取培養(yǎng)物少許在平板上進(jìn)行劃線。劃線的方法很多，常見的比較容易出現(xiàn)單個(gè)菌落的劃線方法有斜線法、曲線法法、四格法等。（圖3-6)當(dāng)接種環(huán)在培養(yǎng)基表面上往后移動(dòng)時(shí)，接種環(huán)上的菌液逐漸稀釋，最后在所劃的線上分散著單個(gè)細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)，每一個(gè)細(xì)胞長成一個(gè)菌落。（圖3-7)4、富集培養(yǎng)法富集培養(yǎng)法的方法和原理非常簡單。我們可以創(chuàng)造一些條件只件下，所需要的微生物能有效地與其他微生物進(jìn)行競爭，在生長能力方面培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，經(jīng)過多次重復(fù)移種，最后富集的菌株很容易在固體培落。如果要分離一些專性寄生菌，就必須把樣品接種到相應(yīng)敏感宿主細(xì)長。通過多次重復(fù)移種便可以得到純的寄生菌。圖3-6平板劃線分離法1.斜線法2.曲線法3.方格法4.放射法5.四格法5、厭氧法在實(shí)驗(yàn)室中，為了分離某些厭氧菌，可以利用裝有原培養(yǎng)基的試管作為培養(yǎng)容可以把所分離的樣品接種于培養(yǎng)基上，然后再把培養(yǎng)皿放在完全密封的厭氧培養(yǎng)裝置中。微生物的生長，除了受本身的遺傳特性決定外，還受到許多外界因素的影響，如營養(yǎng)物濃度、溫度、水分、氧氣、PH等。微生物的種類不同，培養(yǎng)的方式和條件也不盡相同。1、影響微生物生長的因素微生物的生長，除了受本身的遺傳特性決定外，還受到外界許多因素的影響的因素很多，簡要介紹如下。細(xì)菌的生長率與營養(yǎng)物的濃度有關(guān):μ=μma營養(yǎng)物濃度與生長率的關(guān)系曲線是典型的雙曲線。以在自然界中，它們到處生長。然而營養(yǎng)太低時(shí)，細(xì)菌生長就會(huì)遇到是因?yàn)槌松L需要能量以外，細(xì)菌還需要能量來維持它的生存。這方面，隨著營養(yǎng)物濃度的增加，生長率愈接近最大值。2)溫度在一定的溫度范圍內(nèi)，每種微生物都有自已的生長溫度三基點(diǎn)：最低生長溫度和最高生長溫度。在生長溫度三基點(diǎn)內(nèi)，微生物都能生長，但生長速率于最適生長溫度時(shí)，生長速度才最快，代時(shí)最短。超過最低生長溫度，太低，甚至?xí)劳?。超過最高生長溫度，微生物也要停止生長，溫度過況下，每種微生物的生長溫度三基點(diǎn)是恒定的。但也常受其它環(huán)境條件的影響而發(fā)生變化。a.嗜冷微生物：其是適生長溫度多數(shù)在-10℃-20℃之間c.嗜熱微生物：生長溫度在45℃以上。3)水分水分是微生物進(jìn)行生長的必要條件。芽孢、孢子萌發(fā)，首先需要水分。微生存的。但是微生物只能在水溶液中生長，而不能生活在純的水分活性范圍內(nèi)，均具有狹小的適當(dāng)?shù)乃只钚詤^(qū)域。4)氧氣按照微生物對(duì)氧氣的需要情況，可將它們分為以下五個(gè)類型。a.需氧微生物這類微生物需要氧氣供呼吸之用。沒有氧氣，便不能生長，但是高濃度的氧氣對(duì)是有毒的。很多需氧微生物不能在氧氣濃度大于大氣中氧氣濃度的條件下生物都屬于這個(gè)類型。b.兼性需氧微生物這類微生物在有氧氣存在或無氧氣存在情況下，都能生長，只不過所進(jìn)行的代了。在無氧氣存在的條件下，它進(jìn)行發(fā)酵作用，例如酵母菌的無氧乙醇發(fā)酵。c.微量需氧微生物這類菌是需要氧氣的，但只在0.2大氣壓下生長最好。這可能是由一它們含有失活的酶，因而只有在低壓下作用。d.耐氧微生物這類微生物在生長過程中，不需要氧氣，但也不怕氧氣存在，不會(huì)被氧氣所殺死。c.厭氧微生物這類微生物在生長過程中，不需要分子氧。分子氧存在對(duì)它們生長產(chǎn)生毒害，不是被殺死。2、培養(yǎng)方法良好。在實(shí)驗(yàn)室中，斜面培養(yǎng)是通過棉花塞從外界獲得無菌的空氣。三角通過搖床振蕩，使外界的空氣源源不斷地進(jìn)入瓶中。a.降低培養(yǎng)基中的氧化還原電位：常將還原劑如谷胱甘肽、硫基醋酸鹽等，加入到培養(yǎng)基中，便可達(dá)到目的。有的將一些動(dòng)物的死的或活的組織如牛心、羊腦加入到培養(yǎng)氧菌的生長。b.化合去氧：這也有很多方法，主要有：用焦性沒食子酸吸收氧氣；用磷吸收氧氣；用好氧菌與厭氧混合培養(yǎng)吸收氧氣；用植物組織如發(fā)芽的種子吸收氧氣；用產(chǎn)生氫氧。c.隔絕阻氧：深層液體培養(yǎng)；用石蠟油封存；半固體穿刺培養(yǎng)。d.替代驅(qū)氧用二氧氣碳驅(qū)代氧氣；用氮?dú)怛?qū)代氧氣；用真空驅(qū)代氧氣；用氫氣驅(qū)代氧氣；用混和氣體驅(qū)代氧氣。2)根據(jù)培養(yǎng)基的物理狀態(tài)，可分為固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)兩大類。方法。液體培養(yǎng)：在實(shí)驗(yàn)中，通過液體培養(yǎng)可以使微生物迅速繁殖，獲得大量下，還是微生物選擇增菌的有效方法。1、微生物的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察主要是通過染色，在顯微鏡下對(duì)其形狀、大小、排列方式、細(xì)胞結(jié)構(gòu)（包括細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性進(jìn)行觀察，直形態(tài)結(jié)構(gòu)上特性，根據(jù)不同微生物在形態(tài)結(jié)構(gòu)上的不同達(dá)到區(qū)別、鑒定微生物的目的。生長繁殖，所形成的菌落特征有很大差異，而同一種的細(xì)菌在一定條件下，培鑒別中的一項(xiàng)重要內(nèi)容。1)細(xì)菌的培養(yǎng)特征包括以下內(nèi)容：在固體培養(yǎng)基上，觀察菌落大小、形態(tài)、顏色（色素是水3-8)圖3-8細(xì)菌的培養(yǎng)特征1.點(diǎn)狀2.圓形3.絲狀4.不規(guī)則形5.假根狀6.紡錘狀7.扁平8.隆起9.凸起10.墊狀11.臍狀12.邊緣整齊13.波狀14.裂片狀15.嚙蝕狀16.絲狀17.卷發(fā)狀18.絲線狀19.刺毛狀20.串珠狀21.疏展?fàn)?2.樹根狀23.假根狀24.絲狀25.串珠狀26.乳頭狀27.絨毛狀28.樹根狀29.量杯狀30.蘿卜狀31.漏斗狀32.囊狀33.層狀34.絮狀35.環(huán)狀36.蹼狀37.膜狀2)霉菌酵母菌的培養(yǎng)特征：大多數(shù)酵母菌沒有絲狀體，在固體培養(yǎng)基上形成的菌落和細(xì)菌的很相似，只是比細(xì)菌菌落大且厚。液體培養(yǎng)也和細(xì)菌相似，有均勻生長、沉淀膜。霉菌有分支的絲狀體，菌絲粗長，在條件適宜的培養(yǎng)基里，菌絲無限伸長延。霉菌的基內(nèi)菌絲、氣生菌絲和孢子絲都常帶有不同顏色，因而菌落邊緣和面顏色常常不同，如青霉菌：孢子青綠色，氣生菌絲無色，基內(nèi)菌絲褐色。霉面形成絮狀、絨毛狀和蜘蛛網(wǎng)狀菌落。微生物生化反應(yīng)是指用化學(xué)反應(yīng)來測(cè)定微生物的代謝產(chǎn)物，生化反應(yīng)常用來其它方面不易區(qū)別的微生物。因此微生物生化反應(yīng)是微生物分類鑒定中的重1、糖酵解試驗(yàn)不同微生物分解利用糖類的能力有很大差異，或能利用或不能利用，能氣。可用指示劑及發(fā)酵管檢驗(yàn)。試驗(yàn)方法：以無菌操作，用接種針或環(huán)移取純培養(yǎng)物少許，接種于發(fā)酵液），視沿穿刺線和管壁及管底有無微小氣泡，有時(shí)還可看出接種菌有無動(dòng)力，若有呈彌散生長。本試驗(yàn)主要是檢查細(xì)菌對(duì)各種糖、醇和糖苷等的發(fā)酵能力，從而進(jìn)行各種細(xì)劑。2、淀粉水解試驗(yàn)?zāi)承┘?xì)菌可以產(chǎn)生分解淀粉的酶，把淀粉水解為麥芽糖或葡萄糖。淀色。碘試劑直接滴浸于培養(yǎng)表面，若為液體培養(yǎng)物，則加數(shù)滴碘試劑于試管中。立性反應(yīng)（淀粉被分解）為瓊脂培養(yǎng)基呈深藍(lán)色、菌落或培養(yǎng)物周圍出現(xiàn)無色透色無變化。陰性反應(yīng)則無透明環(huán)或肉湯呈深藍(lán)色。淀粉水解系逐步進(jìn)行的過程，因而試驗(yàn)結(jié)果與菌種產(chǎn)生淀粉酶的能力、不宜保存于冰箱，因而以臨用時(shí)制備為妥。某些細(xì)菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮’’色、可判定為陰性。3)快速法：將0.5%肌酸溶液2滴放于小試管中、挑取產(chǎn)酸反應(yīng)的三糖鐵瓊脂斜面培養(yǎng)物一接定結(jié)果。不產(chǎn)酸的培養(yǎng)物不能使用。本試驗(yàn)一般用于腸桿菌科各菌屬的鑒別。在用于芽胞桿菌和葡萄球菌等其它基中的磷酸鹽可阻礙乙酰甲基醇的產(chǎn)生，故應(yīng)省去或以氯化鈉代替。腸桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖，在分解葡萄糖過程中產(chǎn)生丙酮酸，進(jìn)一步應(yīng)延長培養(yǎng)時(shí)間，重復(fù)試驗(yàn)。某些細(xì)菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用顯色二甲基氨基苯醛結(jié)合，形成玫瑰吲哚，為紅色化合物。接觸面呈紅色，即為陽性。進(jìn)行提取，再加試劑，則只有靛基質(zhì)或5-甲基靛基質(zhì)在溶劑中呈現(xiàn)紅色，因而結(jié)果更為可靠。6、硝酸鹽（Nitrate）還原試驗(yàn)有些細(xì)菌具有還原硝酸鹽的能力，可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽、氨或氮?dú)饪捎孟跛嵩噭z驗(yàn)。試驗(yàn)方法：臨試前將試劑的A（磺胺酸冰醋酸溶液）和B(α-萘胺乙醇溶液）試液各0.2ml等紅色即為試驗(yàn)陽性，若無紅色出現(xiàn)則為陰性。用α-萘胺進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，陽性紅色消退很快、故加入后應(yīng)立即判定結(jié)果。進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)必須有未接種的培養(yǎng)基管作為陰性對(duì)照。α-萘胺具有致癌性、故使用時(shí)應(yīng)加注意。7、明膠（Gelatin）液化試驗(yàn)），失去凝膠性質(zhì)而液化。高而使明膠本身液化時(shí)應(yīng)不加搖動(dòng)、靜置冰箱中待其凝固后、再觀察其是否被被液化，即為試驗(yàn)陽性。平板試驗(yàn)結(jié)果的觀察為在培養(yǎng)基平板點(diǎn)種的菌落上滴7.0。性。有些細(xì)菌可分解培養(yǎng)基中含硫氨基酸或含硫化合物，而產(chǎn)生硫化氫氣體，鹽可生成黑色沉淀物。解產(chǎn)酸可使斜面先變黃，但因量少，生成的少量酸，因接觸空氣而氧化，加之細(xì)中含氮物質(zhì)，生成堿性產(chǎn)物，故使斜面后來又變紅，底部由于是在厭氧狀態(tài)下化，所以仍保持黃色。照。本試驗(yàn)用于腸桿菌科細(xì)菌初步生化篩選，與三糖鐵瓊脂等聯(lián)合使用可顯著提高篩選功效。血清學(xué)反應(yīng)是指：相應(yīng)的抗原與抗體在體外一定條件下作用，可出現(xiàn)肉象。在食品微生物檢驗(yàn)中，常用血清學(xué)反應(yīng)來鑒定分離到的細(xì)菌，以最終確認(rèn)檢測(cè)結(jié)果。1)抗原體的結(jié)合具有特異性，當(dāng)有共同抗原體存在時(shí)，會(huì)出現(xiàn)交叉反應(yīng)。2)抗原體的結(jié)合是分子表面的結(jié)合，這種結(jié)合雖相當(dāng)穩(wěn)定，但是可逆的。3)抗原體的結(jié)合是按一定比例進(jìn)行的，只有比例適當(dāng)時(shí)，才能出現(xiàn)可見反應(yīng)。4)血清學(xué)反應(yīng)大體分為兩個(gè)階段進(jìn)行，但其間無嚴(yán)格界限。第一階段為抗原體特異性結(jié)合階段，反應(yīng)速度很快，只需幾秒至幾分鐘反應(yīng)即可完畢，但不出現(xiàn)肉眼可見現(xiàn)象。原體反應(yīng)的可見階段，表現(xiàn)為凝集、沉淀、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)等。反應(yīng)速度慢，清學(xué)反應(yīng)的結(jié)果。習(xí)慣上將經(jīng)典的血清學(xué)反應(yīng)分三種類別：凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)和補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)。1、凝集反應(yīng)顆粒性抗原（細(xì)菌、紅細(xì)胞等）與相應(yīng)抗體結(jié)合，在電解質(zhì)參與下所形成的肉該反應(yīng)中，因?yàn)閱挝惑w積抗體量大，做定量實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)稀釋抗體。1)直接凝集反應(yīng)顆粒性抗原與相應(yīng)抗體直接結(jié)合所出現(xiàn)的反應(yīng)，稱(Directagglutionreaction)。a.玻片凝集法。是一種常規(guī)的定性試驗(yàn)方法。原理是用已知抗體來檢測(cè)未知抗原。常用于鑒定菌種、血型。如將含有痢疾桿菌抗體的血清與待檢菌液各一滴，在玻片現(xiàn)肉眼可見的凝集塊，即陽性反應(yīng)，證明該菌是痢疾桿菌。此法快速、測(cè)定。b.試管凝集法。是一種定量試驗(yàn)方法。多用已知抗原來檢測(cè)血清中有無相應(yīng)抗體及其含量。常用于協(xié)助診斷某些傳染病及進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查。如肥達(dá)氏反應(yīng)就是診斷集試驗(yàn)。因?yàn)橐獪y(cè)定抗體的含量，故將待檢查的血清用等滲鹽水倍比稀的凝集效價(jià)。2)間接凝集反應(yīng)將可溶性抗原（抗體）先吸附在一種與免疫無關(guān)的，顆粒狀微球表面，然原）作用，在有電解質(zhì)存在的條件下，即可發(fā)生凝集，稱(Indirectagglutination)。由于載體增大了可溶性抗原的反應(yīng)面積。當(dāng)載體上有少量抗原與抗體結(jié)合。就出現(xiàn)肉眼可見的反應(yīng)，敏感性很高。2、沉淀反應(yīng)可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合，在有適量電解質(zhì)存在下，經(jīng)過一定物，稱為沉淀反應(yīng)（Precipitation體積內(nèi)抗原量大，為了不使抗原過剩，故應(yīng)稀釋抗原，并以抗原的稀釋價(jià)。1)環(huán)狀沉淀反應(yīng)：是一種定性試驗(yàn)方法，可用已知抗體檢測(cè)未知抗原。將已知抗體注入特制小試管中，然后沿管壁徐徐加入等量抗原，如抗原與抗體對(duì)應(yīng)，則在圓環(huán)。2)絮狀沉淀反應(yīng)：將已知抗原與抗體在試管（如凹玻片）內(nèi)混勻，如抗原抗體對(duì)應(yīng)，而又二者比例適當(dāng)時(shí)，會(huì)出現(xiàn)肉眼可見的絮狀沉淀，此為陽性反應(yīng)。3)瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)：利用可溶性抗原抗體在半固體瓊脂內(nèi)擴(kuò)散，若抗原抗體對(duì)應(yīng)，且二者比例合適，在其擴(kuò)散的某一部分就會(huì)出現(xiàn)白色的沉淀線。每對(duì)抗原抗體可形成一條抗原抗體，就可分別形成幾條沉淀線。瓊脂擴(kuò)散可分為單向擴(kuò)散和雙向擴(kuò)散兩散是一種定量試驗(yàn)?？捎糜诿庖叩鞍缀康臏y(cè)定。而雙向擴(kuò)散多用于定性試驗(yàn)易行，常用于測(cè)定分析和鑒定復(fù)雜的抗原成分。3、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)示系統(tǒng)的抗原抗體反應(yīng)。補(bǔ)體無特異性，能與任何一組抗原抗體復(fù)合物結(jié)合補(bǔ)體與綿羊紅細(xì)胞、溶血素的復(fù)合物結(jié)合，就會(huì)出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，如果與細(xì)菌結(jié)合，就會(huì)出現(xiàn)溶菌現(xiàn)象。因此，整個(gè)試驗(yàn)需要有補(bǔ)體、待檢系統(tǒng)（已知抗原或抗體）及指示系統(tǒng)（綿羊細(xì)胞和溶血素）五種成份參加。其試驗(yàn)原理是或抗體結(jié)合。如果出現(xiàn)溶菌，是補(bǔ)體與待檢系統(tǒng)結(jié)合的結(jié)果，說明抗原抗體出現(xiàn)溶血，說明抗原抗體不相對(duì)應(yīng)。此反應(yīng)操作復(fù)雜，敏感性高，特異性強(qiáng)和抗體，所以應(yīng)用范圍較廣。本單元講述了無菌取樣操作，在討論無菌取樣的原因和采集方法之前，無菌樣品的采集，應(yīng)該通過這樣一種方式，即：在收集過程中，本身入消毒容器中。無菌樣品的采集基本是為了支持、針對(duì)工廠的衛(wèi)生條件狀況的檢查結(jié)果。擁有正確的采取產(chǎn)品或加工過程的無菌取樣器械工具是至關(guān)重要的的。除非集工具，否則樣品的完整性會(huì)被懷疑，甚至樣品毫無意義。為了具，建議建立一個(gè)無菌取樣的分析清單，來收集取樣工具。進(jìn)入加工區(qū)之前應(yīng)當(dāng)被預(yù)先標(biāo)識(shí)，象樣品號(hào)、取樣日期、取樣人等。這樣工廠條件下的樣品取樣更為方便一些。附加樣品號(hào)碼一般在樣品采集中被因此不用預(yù)先標(biāo)明。人員的工具設(shè)施，象工作服、發(fā)網(wǎng)或消毒處理過的清潔的鞋靴必須具備有沒有污染到食物產(chǎn)品或樣品。生產(chǎn)線樣品一般是指原材料，原料生產(chǎn)用水、包裝材料或其他任何使用在生產(chǎn)線的材料。生產(chǎn)線樣品的采集一般用來確定細(xì)菌污染源是否來自于原材料或加工序中的某些地方。墻壁、頂部管道和檢驗(yàn)中考察的其他潛在污染源程序，并且記錄可能的：（如果使樣品在貯運(yùn)過程中保持冷卻，一些種類的制冷劑是必需的。有接觸，如果泄漏可能污染樣品，你也可以用濕冰，濕冰可以由工廠須清楚這一點(diǎn)，如果想保持樣品冷凍，干冰應(yīng)在檢驗(yàn)前獲得。檢驗(yàn)員需要貯藏、運(yùn)輸他們的樣品，如果樣品不需冷凍，那么用一個(gè)盒品需要冷卻，一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的制冷皿或保溫箱是必須使用的，一般來講制袋，樣品可以放還袋子里，制冷劑象干冰，等可以放置在袋外，這樣性就被避免了。從塑料袋到滅菌的加侖漆桶，可以用于有銳利邊面的產(chǎn)品如蟹、蝦等。產(chǎn)品來決定。所有取樣設(shè)施和容器的滅菌日期應(yīng)當(dāng)被檢查、滅菌時(shí)間應(yīng)當(dāng)在儀器設(shè)明，一些儀器設(shè)施可以在當(dāng)?shù)貙?shí)驗(yàn)室滅菌處設(shè)施一般可以保持至少兩個(gè)月，過期后設(shè)施必須重新滅菌。滅菌手套在采樣中并非必須啟用，如果一個(gè)產(chǎn)品在樣品收集過產(chǎn)過程中處理接觸產(chǎn)品，那么我們就不能認(rèn)為他們對(duì)產(chǎn)品又有附加的污染。當(dāng)用手套時(shí)必須用一種避免污染的方式戴上，手套的大小必須適合工作的需要。一般用于拭取儀器設(shè)施和工廠環(huán)境區(qū)域，使用棉拭子一般有一個(gè)剝掉表皮，然后必須小心的放在試管頭上，注意不要沾染棉拭子的外端；入直到試管中部。袋子必須購買滅菌的，使用時(shí)只需撕掉封頭，用提供的地方張開袋子將袋子頂端卷起，用線繩扎實(shí)牢；底部應(yīng)當(dāng)折疊兩次，以便線繩不會(huì)穿品泄露。記錄入檢驗(yàn)員的注釋說明中，取樣的樣品可以從樣品號(hào)、采集日期、查人和其他鑒別信息事區(qū)分。當(dāng)采集無菌樣品時(shí)，一條最重要的規(guī)則是：千萬別污染樣品。這需要樣品采集人非常小心地采集所有附加樣品，確保不違反這條規(guī)則。微生物檢驗(yàn)的特點(diǎn)是一個(gè)以小份樣品的檢測(cè)結(jié)果來說明一大批食品衛(wèi)生分析的樣品的代表性至關(guān)重要，也即樣品的數(shù)量、大小和性質(zhì)對(duì)結(jié)果判定產(chǎn)生重大影響。要保證樣品的代表性首先要有一套科學(xué)的抽樣方案，其次使的保存和運(yùn)輸過程中保持樣品的原有狀態(tài)。一般說來，進(jìn)出口貿(mào)易合同對(duì)食品抽樣量有明確規(guī)定的，按合同同沒有具體抽樣規(guī)定的，可根據(jù)檢驗(yàn)的目的，產(chǎn)品及被抽樣品批的性質(zhì)和用于分析所抽樣品的數(shù)量、大小和性質(zhì)對(duì)結(jié)果會(huì)產(chǎn)生很大影和水。在微生物的質(zhì)量上差異很大的多個(gè)單元。因此在選擇抽樣方案之前，必度，來設(shè)定抽樣方案并規(guī)定其不同采樣數(shù)。目前，加拿大、以色列等很多國c：系指該批產(chǎn)品的檢樣菌數(shù)中，超過限量數(shù)。的界限。有些實(shí)驗(yàn)室在每批產(chǎn)品中，僅采一個(gè)檢樣進(jìn)行檢驗(yàn)，該批產(chǎn)品是否合的菌數(shù)限量。的則建議使用三級(jí)抽樣方案。度分類的。這個(gè)設(shè)想是很科學(xué)的，符合實(shí)際情況的，對(duì)生產(chǎn)廠及消費(fèi)者來說級(jí)別,危害程度,對(duì)象微生物,食品經(jīng)不同處理后的危害度,,,減少（加熱）,無變化（冷凍品立刻進(jìn)食）,增加危害度（未加熱吃到吃前還有一段時(shí)三級(jí)方案,1.食品的保藏2.輕度間接指標(biāo)菌3.中度程度局部傳播,細(xì)菌數(shù)產(chǎn)氣莢膜梭菌,例1例4例7例5例8例6例9二級(jí)方案,1.中度程度廣泛傳播2.嚴(yán)重程度,沙門氏菌副溶血性弧菌致病性大腸桿菌注：表中“減少”系指食品經(jīng)加熱殺死污染的細(xì)菌?！霸黾印毕抵笇⑹称繁４嬖诓涣辑h(huán)境中使微生物二級(jí)法判定。對(duì)食品處理應(yīng)酌情考慮，例如生肉火腿中的金黃色葡萄球菌，被腐敗菌3據(jù)各種食品的危害度進(jìn)行設(shè)定。依靠菌數(shù)限量，而用合格率來控制。食品名稱,檢查項(xiàng)目,例,級(jí)別,n,c,菌數(shù)限量/g,,,,,,冷凍烹調(diào)蝦,細(xì)菌數(shù)副溶血性弧菌,1443693323332,55555555,330111410310210641033 1073 上。位產(chǎn)品，即為一件應(yīng)抽取的樣品。數(shù)為止。確定了抽樣方案以后，抽樣方法對(duì)抽樣方案的有效執(zhí)行和保證樣品的有要。抽樣必須遵循無菌操作程序，抽樣工具如整套不銹鋼勺子、鑷子、菌，防止一切可能的外來污染。容器必需清潔、干燥、防漏、廣口、滅檢樣。抽樣全過程中，應(yīng)采取必要的措施防止食品中固有微生物的數(shù)量盡可能取原包裝，直到檢驗(yàn)前不要開封，以防污染。再凍，保持冷卻即可。證產(chǎn)品的代表性不被人為地破壞。抽樣過程中應(yīng)對(duì)所抽樣品進(jìn)行及時(shí)、準(zhǔn)確的標(biāo)記；抽樣結(jié)束后，應(yīng)有抽樣報(bào)告，使樣品盡可能保持在原有條件下迅速發(fā)送到實(shí)驗(yàn)室。號(hào)以及其他需要說明的情況。標(biāo)記應(yīng)牢固，具防水性，字跡不會(huì)被擦掉或脫色。2.樣品的保存和運(yùn)送常溫冷暗處?；虿蝗诨?。必要時(shí)可于途中補(bǔ)加冷卻劑或冷凍劑。送人簽字。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，特別是免疫學(xué)、生物細(xì)菌診斷技術(shù)和方法已廣泛用于食品微生物的鑒別。傳統(tǒng)的細(xì)菌分離、已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足對(duì)各種病原微生物的診斷以及流行病學(xué)的研究。近年來針和多聚酶鏈反應(yīng)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，明顯提高了細(xì)菌的診斷水平。快速酶觸反應(yīng)是根據(jù)細(xì)菌在其生長繁殖過程中可合成和釋放某些特異性，選用相應(yīng)的底物和指示劑，將他們配制在相關(guān)的培養(yǎng)基中。根據(jù)顯的顏色變化，確定待分離的可疑菌株，反應(yīng)的測(cè)定結(jié)果有助術(shù)將傳統(tǒng)的細(xì)菌分離與生化反應(yīng)有機(jī)的結(jié)合起來，并使得檢測(cè)結(jié)果直觀易與乳糖發(fā)酵菌株區(qū)別。在細(xì)菌診斷中利用免疫學(xué)的各種方法日益受到人們的極大關(guān)注，從而簡化鑒定手續(xù)。術(shù)的進(jìn)一步完善，尤其是單克隆抗體的制備，明顯提高了細(xì)菌凝集實(shí)泛用于細(xì)菌的分型和鑒定，如沙門氏菌、霍亂弧菌等。將特異性的抗體包被在乳膠顆粒上，通過抗體與相應(yīng)的細(xì)菌抗原結(jié)合，集反應(yīng)。通常此法需獲得細(xì)菌純培養(yǎng)物，再將培養(yǎng)物與致敏乳膠反應(yīng)。用于快速檢測(cè)細(xì)菌的熒光抗體技術(shù)主要有直接法和間接法。加已知特異性熒光標(biāo)記的抗血清，經(jīng)洗滌后在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。滴加已知的細(xì)菌特異性抗體，待作用后經(jīng)洗滌，再加入熒光標(biāo)記的第二致。酶聯(lián)免疫技術(shù)的應(yīng)用，大大提高了檢測(cè)的敏感性和特異性，現(xiàn)已廣泛地應(yīng)的檢驗(yàn)。應(yīng)用酶聯(lián)免疫技術(shù)制造的mini-Vidas全自動(dòng)免疫分析儀，是用熒光分析技術(shù)通過固相吸附器，用已知抗體來捕捉目標(biāo)生物體，然后以帶熒光的酶聯(lián)抗體再次結(jié)合，過激發(fā)光源檢測(cè)，即能自動(dòng)讀出發(fā)光的陽性標(biāo)本，其優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)靈敏度高和葡萄球菌腸毒素等。隨著分子微生物生物學(xué)和分子化學(xué)的飛速發(fā)展，對(duì)病外部形態(tài)結(jié)構(gòu)及生理特性等一般檢驗(yàn)上，而是從分子生物學(xué)水平上研究是核酸結(jié)構(gòu)及其組成部分。在此基礎(chǔ)上建立的眾快速的特點(diǎn)成為世人矚目的生物技術(shù)革命的新產(chǎn)物，業(yè)已逐步應(yīng)用于測(cè)。生反應(yīng)，它對(duì)某些菌屬、菌種、菌株有特異性，另一種探針只能限制性同微度的指示菌E.Coli.選擇探針的原則是只能同檢測(cè)的細(xì)菌發(fā)生雜交反應(yīng)，而不受非檢菌存在的干擾。等方面的檢測(cè)，如腸毒素。有毒和無毒菌株。4.1.探針的特異性:檢微生物而不與其他微生物發(fā)生反應(yīng)。對(duì)食品檢測(cè)而言，就是不與樣品從而引起其表達(dá)產(chǎn)物的變化。而核酸探針檢測(cè)的是基因本身，它不受基因表達(dá)產(chǎn)物的影響。常規(guī)免疫學(xué)方法檢測(cè)抗原、抗體，它們都是質(zhì)由氨基酸組成，而氨基酸由核苷酸序列確定，一旦這種序列受外界影導(dǎo)致其產(chǎn)物的變化，影響抗原抗體間的反應(yīng)，使檢測(cè)特異性下降。檢測(cè)病毒主要通過組織培養(yǎng)后，檢測(cè)病毒相關(guān)的蛋白質(zhì)囊膜，即使采用另外，核酸之間的識(shí)別連接比抗原抗體準(zhǔn)確，并壞能力強(qiáng)，所以用比提取制備蛋白質(zhì)強(qiáng)烈的多的方法制備核酸，不會(huì)影響雜交反應(yīng)。延長培養(yǎng)時(shí)間，增強(qiáng)信號(hào)強(qiáng)度能提