第6章 培養(yǎng)基的滅菌課件

第6章培養(yǎng)基的滅菌第五章培養(yǎng)基及設備的滅菌第6章培養(yǎng)基的滅菌第一節(jié)培養(yǎng)基滅菌的目的、要求和方法第二節(jié)濕熱滅菌的理論基礎第三節(jié)培養(yǎng)基滅菌的工程設計第6章培養(yǎng)基的滅菌培養(yǎng)基滅菌的要求和方法1，培養(yǎng)基滅菌的定義是指從培養(yǎng)基中殺滅有生活能力的細菌營養(yǎng)體及其孢子，或從中將其除去。工業(yè)規(guī)模的液體培養(yǎng)基滅菌，殺滅雜菌比除去雜菌更為常用。2，滅菌與消毒的區(qū)別滅菌：用物理或化學方法殺死或除去環(huán)境中所有微生物，包括營養(yǎng)細胞、細菌芽孢和孢子消毒：用物理或化學方法殺死物料、容器、器皿內外的病源微生物。第6章培養(yǎng)基的滅菌在發(fā)酵過程中夾雜其它雜菌造成的后果：生產菌和雜菌同時生長，生產菌喪失生產能力；在連續(xù)發(fā)酵過程中，雜菌的生長速度有時會比生產菌生長得更快，結果使發(fā)酵罐中以雜菌為主；雜菌及其產生的物質，使提取精制發(fā)生困難雜菌會降解目的產物；雜菌會污染最終產品，雜菌會污染最終產品；發(fā)酵時如污染噬菌體，可使生產菌發(fā)生溶菌現象。培養(yǎng)基滅菌的要求和方法第6章培養(yǎng)基的滅菌培養(yǎng)基滅菌的目的、要求和方法工業(yè)上具體措施

1）使用的培養(yǎng)基和設備須經滅菌；

2）好氧培養(yǎng)中使用的空氣應經除菌處理；

3）設備應嚴密，發(fā)酵罐維持正壓環(huán)境；

4）培養(yǎng)過程中加入的物料應經過滅菌；

5）使用無污染的純粹種子。第6章培養(yǎng)基的滅菌培養(yǎng)基滅菌的目的、要求和方法培養(yǎng)基滅菌的要求達到要求的無菌程度（10-3）盡量減少營養(yǎng)成分的破壞，在滅菌過程中，培養(yǎng)基組分的破壞，是由兩個基本類型的反應引起的：培養(yǎng)基中不同營養(yǎng)成分間的相互作用；對熱不穩(wěn)定的組分如氨基酸和維生素等的分解。第6章培養(yǎng)基的滅菌第6章培養(yǎng)基的滅菌主要滅菌方法滅菌的方法化學法化學藥品滅菌法物理法干熱滅菌法熱滅菌法射線滅菌法第6章培養(yǎng)基的滅菌主要滅菌方法第6章培養(yǎng)基的滅菌干熱滅菌法：將金屬制品或清潔玻璃器皿放入電熱烘箱內，在150～170℃下維持1～2h后，即可達到徹底滅菌的目的。

在這種條件下，可使細胞膜破壞、蛋白質變性、原生質干燥，以及各種細胞成分發(fā)生氧化。灼燒：是一種最徹底的干熱滅菌方法，但它只能用于接種環(huán)、接種針等少數對象的滅菌。主要滅菌方法第6章培養(yǎng)基的滅菌濕熱滅菌法，多數細菌和真菌的營養(yǎng)細胞在60℃左右處理5～10min后即可殺死；酵母菌和真菌的孢子用80℃以上的溫度處理才能殺死；而細菌的芽孢一般要在120℃下處理15min才能殺死。巴氏消毒法（pasteurization）：目的是殺死其中無芽孢的病原菌（如牛奶中的結核桿菌或沙門氏菌），而又不影響它們的風味。巴氏消毒法是一種低溫消毒法.主要滅菌方法第6章培養(yǎng)基的滅菌低溫維持法：在63℃下保持30分鐘可進行牛奶消毒；間歇滅菌法：適用于不耐熱培養(yǎng)基的滅菌。待滅菌的培養(yǎng)基在80～100℃下蒸煮15～60分鐘，以殺死所有營養(yǎng)細胞，然后置室溫或37℃下保溫過夜，誘導殘留的芽孢發(fā)芽，再以同法蒸煮和保溫過夜，如此連續(xù)重復3天，即可在較低溫度下達到徹底滅菌的效果。主要滅菌方法第6章培養(yǎng)基的滅菌常規(guī)加壓滅菌法：盛有適量水的加壓蒸汽滅菌鍋加熱煮沸，徹底驅盡后將鍋密閉，再繼續(xù)加熱至121℃（壓力為1kg／cm2或15磅／英寸2），時間維持15～20分鐘，也可采用在較低的溫度（115℃，即0.7kg／cm2或10磅／英寸2）下維持35分鐘的方法。適合于一切微生物學實驗室、醫(yī)療保健機構或發(fā)酵工廠中對培養(yǎng)基及多種器材、物料的滅菌。連續(xù)加壓滅菌法：在發(fā)酵行業(yè)里也稱“連消法”。此法只在大規(guī)模的發(fā)酵工廠中作培養(yǎng)基滅菌用。將培養(yǎng)基在發(fā)酵罐外連續(xù)不斷地進行加熱、維持和冷卻，然后才進入發(fā)酵罐。培養(yǎng)基一般在135～140℃下處理5～15秒鐘。主要滅菌方法第6章培養(yǎng)基的滅菌高溫對培養(yǎng)基成分的影響：

主要滅菌方法第6章培養(yǎng)基的滅菌消除高溫有害影響的措施采用特殊加熱滅菌法；含易破壞成分的培養(yǎng)基應與其他成分分別滅菌后再合并，或者進行低壓滅菌；對含Ca2+或Fe3+的培養(yǎng)基與磷酸鹽先分別滅菌，再混合，避免產生磷酸鹽沉淀。主要滅菌方法第6章培養(yǎng)基的滅菌濕熱滅菌的原理每一種微生物都有一定的最適生長溫度范圍。當微生物處于最低溫度以下時，代謝作用幾乎停止而處于休眠狀態(tài)。當溫度超過最高限度時，微生物細胞中的原生質膠體和酶起了不可逆的凝固變性，使微生物在很短時間內死亡，加熱滅菌即是根據微生物這一特性而進行的。主要滅菌方法第6章培養(yǎng)基的滅菌濕熱滅菌相關定義殺死微生物的極限溫度稱為致死溫度。在致死溫度下，殺死全部微生物所需的時間稱為致死時間；在致死溫度以上，溫度愈高，致死時間愈短。微生物的熱阻：是指微生物在某一特定條件（主要是溫度和加熱方式）下的致死時間。相對熱阻是指某一微生物在某條件下的致死時間與另一微生物在相同條件下的致死時間的比值。主要滅菌方法第6章培養(yǎng)基的滅菌各種微生物對濕熱的相對熱阻微生物相對熱阻營養(yǎng)細胞和酵母1.0細菌芽孢3×106霉菌孢子2~10病毒和噬菌體1~5主要滅菌方法第6章培養(yǎng)基的滅菌培養(yǎng)基成分對滅菌的影響油脂，糖類及一定濃度的蛋白質可增加微生物的耐熱性，另一些物質，如高濃度的鹽類，色素等可削弱其耐熱性。培養(yǎng)基的物理狀態(tài)對滅菌的影響培養(yǎng)基中微生物數量對滅菌的影響培養(yǎng)基中氫離子濃度對滅菌的影響培養(yǎng)基中氫離子濃度直接影響滅菌的效果。培養(yǎng)基的酸堿度越大，所需殺滅微生物的溫度越低。主要滅菌方法第6章培養(yǎng)基的滅菌微生物細胞中水分對滅菌的影響細胞含水越多，蛋白質變性的溫度越底微生物細胞菌齡對滅菌的影響老細胞水分含量低、低齡細胞水分含量高空氣排除情況對滅菌的影響攪拌對滅菌的影響泡沫對滅菌的影響主要滅菌方法第6章培養(yǎng)基的滅菌濕熱滅菌的優(yōu)點蒸汽來源容易，操作費用低，本身無毒；蒸汽有強的穿透力，滅菌易于徹底；蒸汽有很大的潛熱；操作方便，易管理。濕熱滅菌的理論基礎第6章培養(yǎng)基的滅菌培養(yǎng)基濕熱滅菌需解決的工程問題將培養(yǎng)基中的雜菌總數N0殺滅到可以接受的總數N（10-3），需要多高的溫度、多長的時間為合理。滅菌溫度和時間的確定取決于：雜菌孢子的熱滅死動力學反應器的形式和操作方式培養(yǎng)基中有效成分受熱破壞的可接受范圍第二節(jié)濕熱滅菌的理論基礎第6章培養(yǎng)基的滅菌二、微生物的熱死滅動力學方程實驗證明，微生物營養(yǎng)細胞的均相熱死滅動力學符合化學反應的一級反應動力學，即：N：任一時刻的活細菌濃度（個/L）

t：時間（min）K：比熱死速率常數（min-1）第二節(jié)濕熱滅菌的理論基礎第6章培養(yǎng)基的滅菌取邊界條件t0=0，N=N0，對（1）積分得（2）或（3）第二節(jié)濕熱滅菌的理論基礎第6章培養(yǎng)基的滅菌細菌孢子的熱殺滅動力學與營養(yǎng)細胞的有所不同。它表現為非對數的死亡動力學。這可能與孢子壁的化學成分及結構有關。但當溫度超過120?C時，熱阻極強的嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子的熱殺滅動力學也接近對數死亡動力學即符合一級反應規(guī)律。第二節(jié)濕熱滅菌的理論基礎第6章培養(yǎng)基的滅菌三、溫度對K的影響微生物的熱死滅動力學接近一級反應動力學它的比熱死滅速率常數K與滅菌溫度T的關系可用阿累尼烏斯方程表征

A：頻率因子（min-1）ΔE：活化能（J/mol）

R：通用氣體常數[J/（mol.k）]第二節(jié)濕熱滅菌的理論基礎第6章培養(yǎng)基的滅菌活化能ΔE的大小對K值有重大影響。其它條件相同時，ΔE越高，K越低，熱死速率越慢。不同菌的孢子的熱死滅反應ΔE可能各不相同。第二節(jié)濕熱滅菌的理論基礎第6章培養(yǎng)基的滅菌1/TK（min-1）第二節(jié)濕熱滅菌的理論基礎反應的ΔE越高，lnK對T的變化率越大，即T的變化對K的影響越大第6章培養(yǎng)基的滅菌細菌孢子熱死滅反應的ΔE很高，而某些有效成分熱破壞反應的ΔE較低。將溫度提高到一定程度，會加速細菌孢子的死滅速度，縮短滅菌時間，由于有效成分的ΔE很低，溫度的提高也會增大其破壞速度，但幅度較小。由于滅菌時間的顯著縮短，有效成分的破壞反而減少受熱物質ΔE（J/mol）維生素B1296232維生素B1鹽酸鹽92048嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子283257肉毒梭菌孢子343088枯草桿菌孢子317984第二節(jié)濕熱滅菌的理論基礎第6章培養(yǎng)基的滅菌溫度上升，滅菌速率常數增加的倍數大于培養(yǎng)基成分破壞的速率常數倍數。將溫度提高到一定程度，會加速細菌孢子的死滅速度，縮短滅菌時間，由于有效成分的E’很低，溫度的提高只能稍微增大其破壞速度，但由于滅菌時間的顯著縮短，有效成分的破壞反而減少.因此，培養(yǎng)基滅菌宜采用“高溫短時間”滅菌。第二節(jié)濕熱滅菌的理論基礎第6章培養(yǎng)基的滅菌1/T

lnK第二節(jié)濕熱滅菌的理論基礎第6章培養(yǎng)基的滅菌滅菌時溫度從T1T2時：第二節(jié)濕熱滅菌的理論基礎第6章培養(yǎng)基的滅菌殺滅細菌芽孢的活化能E大于維生素等營養(yǎng)物質破壞的活化能E`(即E>E`)第二節(jié)濕熱滅菌的理論基礎第6章培養(yǎng)基的滅菌ΔEBS=67000×4.184（J/mol）ΔEVB=22000×4.184（J/mol）將滅菌溫度從105?C提高到127?CKVB從0.02（min-1）提高到0.06（min-1

）KBS從0.12（min-1）提高到40.0（min-1

）嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子和維生素B1的lnK-1/T圖第二節(jié)濕熱滅菌的理論基礎第6章培養(yǎng)基的滅菌嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子死滅程度為N/N0=10-16時，滅菌溫度對維生素B1破壞的影響滅菌溫度（?C）達到滅菌程度的時間（min）維生素B1的損失（%）10084399.9911075891207.6271300.851101400.10731500.0151第二節(jié)濕熱滅菌的理論基礎第6章培養(yǎng)基的滅菌第二節(jié)濕熱滅菌的理論基礎殺菌鍋內滅菌培養(yǎng)基及物品滅菌所需壓強0,098MPa,固體培養(yǎng)基維持20-30min，液體培養(yǎng)基維持15-20min，玻璃器皿及用具維持30-60min。種子罐、發(fā)醉罐、計量罐、補料鑲等的空罐滅菌及管道滅菌

通入蒸汽，使罐內蒸汽壓強達0.147MPa，維持45min。滅菌過程中從閥門、邊閥排出空氣，并使蒸汽達到所有死角。滅菌完畢，關閉蒸汽后，待罐內壓力低于空氣過濾器壓力時，通人無菌空氣保持罐壓0,098MPa第6章培養(yǎng)基的滅菌

空氣總過濾器和分過濾器滅菌從過濾器上部通入蒸汽，并從上、下排氣口排氣，維持壓強0.174MPa，滅菌完畢，通入壓縮空氣吹干。

種子培養(yǎng)基實罐滅菌從夾層通人燕汽間接加熱至80℃，再從取樣管、進風管、接種管通人蒸汽直接加熱同時關閉夾層蒸汽進口閥門，升溫到121℃，維待30min，谷氨酸發(fā)酵的種子培養(yǎng)基實罐滅菌為110℃,維持l0min

發(fā)酵培養(yǎng)基實罐滅菌從夾層或盤管進人蒸汽，間接加熱至90℃,關閉夾層蒸汽，從取樣管、進風管、放料管三路進蒸汽，直接加熱至121℃，維持10min.谷氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基實罐滅菌為105℃，維持25min。第二節(jié)濕熱滅菌的理論基礎第6章培養(yǎng)基的滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基連續(xù)滅菌一般培養(yǎng)基為130℃,維持5min。谷氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基為115℃,維持6-8min。發(fā)酵罐需在培養(yǎng)基滅菌之前直接用蒸汽進行空罐滅菌?？障蟛荒芰⒓蠢鋮s，先用無菌空氣保壓，待滅菌的培養(yǎng)基輸人罐內后，才可以開冷卻系統進行冷卻。油罐(消泡劑罐)滅菌一般條件為0.15--0.18MPa·維持60min。補料實罐滅菌視物料性質而定，如糖水為0.1MPa(120℃)，保溫30min;淀粉料液為121℃維持5min。尿素溶液滅菌常用滅菌條件為105℃,維持5min。第二節(jié)濕熱滅菌的理論基礎第6章培養(yǎng)基的滅菌第三節(jié)培養(yǎng)基滅菌的工程設計一、無菌的標準根據微生物熱死滅方程，要求滅菌后達到絕對無菌是很難做到的，也是不必要的。因此在工程設計中常取N=10-3第6章培養(yǎng)基的滅菌二、分批滅菌1，分批滅菌的設計在發(fā)酵罐中進行實罐滅菌，是典型的分批滅菌。全過程包括升溫、保溫、降溫三個過程第三節(jié)培養(yǎng)基滅菌的工程設計第6章培養(yǎng)基的滅菌孢子熱死亡的規(guī)律符合第三節(jié)培養(yǎng)基滅菌的工程設計二、分批滅菌第6章培養(yǎng)基的滅菌因為升溫、冷卻階段T是時間t的函數，K不是常數，所以：

式中Kh是保溫階段的孢子比熱死亡速度常數第三節(jié)培養(yǎng)基滅菌的工程設計二、分批滅菌第6章培養(yǎng)基的滅菌分批滅菌中幾種換熱方式的溫度-時間變化關系T：介質溫度（K）；T0：介質初溫（K）；t：時間（min）；h：蒸汽相對于介質的熱焓（kJ/kg）；s：蒸汽的重量流率（kg/min）M：介質重量(kg)；Cp：介質比熱[kJ/(kg.K)]；TH：熱源溫度(K)U：總傳熱系數[kJ/（m2.min.K）]；q：傳熱速率（kJ/min）C’p：冷卻劑比熱；W：冷卻劑流率；TCO：冷卻劑溫度二、分批滅菌第三節(jié)培養(yǎng)基滅菌的工程設計第6章培養(yǎng)基的滅菌培養(yǎng)基間歇滅菌過程中應注意的問題溫度和壓力的關系泡沫問題投料過程中，麩皮和豆餅粉等固形物在罐壁上殘留的問題滅菌結束后應立即引入無菌空氣保壓二、分批滅菌第三節(jié)培養(yǎng)基滅菌的工程設計第6章培養(yǎng)基的滅菌三、連續(xù)滅菌的設計第三節(jié)培養(yǎng)基滅菌的工程設計第6章培養(yǎng)基的滅菌三、連續(xù)滅菌的設計第三節(jié)培養(yǎng)基滅菌的工程設計第6章培養(yǎng)基的滅菌連續(xù)滅菌流程圖第三節(jié)培養(yǎng)基滅菌的工程設計第6章培養(yǎng)基的滅菌連續(xù)滅菌主要設備套管式連消塔第三節(jié)培養(yǎng)基滅菌的工程設計第6章培養(yǎng)基的滅菌噴嘴式連消塔連續(xù)滅菌主要設備第三節(jié)培養(yǎng)基滅菌的工程設計第6章培養(yǎng)基的滅菌噴射加熱器連